قياس الحساسية المفرطة المحلية في الفئران

Summary

استجابات حساسية، والتي تتميز تنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، ويقودها الربط عبر ال IgE وإطلاق وسطاء proinflammatory. ويمكن تحقيق التقييم الكمي للاستجابات حساسية باستخدام ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية بعد التحدي حساسية.

Abstract

استجابات حساسية هي نتيجة لتنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، وإطلاق سراح لاحق من فعال في الأوعية والوسطاء proinflammatory. التعرض لمسببات الحساسية في الأفراد الحساسين يمكن أن يؤدي إلى الأعراض السريرية التي تختلف من حمامي طفيف إلى الحساسية المفرطة التي تهدد الحياة. في المختبر، وقد تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة لفهم آليات القيادة استجابات حساسية. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لقياس التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية لقياس استجابات حساسية موضعية. وذكرت وفحص الحساسية المفرطة المحلي أولا في 1920s، وقد تم تكييفها من تقنية نشرته كوجيما وآخرون. في عام 2007 ^1. في هذا الاختبار، يتم الطعن الفئران توعيتهم OVA في الأذن اليسرى مع السيارة وفي الأذن اليمنى مع OVA. ويلي ذلك حقنة في الوريد من ايفانز الأزرق صباغة. عشرة دقيقة بعد حقن ايفانز الأزرق، والموت الرحيم للحيوان والصبغة التي extravasated فيالى الاسماع يستخرج بين عشية وضحاها في الفورماميد. ثم يتم كميا امتصاص الصبغة المستخرجة مع طيفي. هذه الطريقة النتائج بشكل موثوق في مظهر البصرية وقابل للقياس للاستجابة تحسسية المحلية.

Introduction

وبوساطة النوع الأول من فرط الحساسية الناجمة عن مستضد عبر ربط إيج على سطح الخلايا البدينة والخلايا القاعدية. وهذا يؤدي إلى تحبب الخلوية والإفراج عن وسطاء فعال في الأوعية وproinflammatory مثل الهستامين، تريبتاز، وعامل تنشيط الصفائح الدموية ^2. وعقب صدور سطاء بريفورميد خلال تحبب الخلايا البدينة توليف والافراج عن البروستاجلاندين و leukotrienes، التي تزيد من نفاذية الأوعية الدموية ^3. وتحدث هذه الاستجابة السريرية الأولية بسرعة ويشار إليه على أنه "رد فعل فوري". في الجلد، استجابة الانتفاخ و-مضيئة مرئيا بسهولة في غضون دقائق من التحدي مستضد. اعتمادا على جرعة من التحدي، فمن الممكن لمراقبة "رد مرحلة متأخرة" بعد بضع ساعة. ويرجع ذلك إلى وذمة موضعية والتوظيف الكريات البيض في الأنسجة ² أواخر مرحلة التورم. الهستامين، يعتبر عموما أن يكون الوسيط الرئيسي يشاركون فياستجابات حساسية مباشرة، يعمل على مستقبلات الهستامين أعرب 1 (HR1) على السفن ومستقبلات الهستامين 2 (HR2) أعرب على العضلات الملساء. التأثير المشترك يزيد من تدفق الدم ونفاذية الأوعية الدموية في موقع الالتهاب ^4.

وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج حيوانية من الحساسية وذلك لدراسة الآليات التي تشارك في الالتهاب التحسسي، بما في ذلك نماذج من الربو التحسسي، الحساسية المفرطة النظامية، والحساسية المفرطة المحلية. وقد استخدمت إدارة صبغة عن طريق الوريد لقياس استجابات حساسية موضعية في نماذج حيوانية لمدة قرن تقريبا، مع المنشورات التي تصف هذه التقنية التي يعود تاريخها إلى 1920s ^5. كانت الأرانب والخنازير الغينية على نماذج حيوانية الأولى المستخدمة لاختبار تفاعلات فرط الحساسية المباشرة، وعثر الردود الأكثر حساسية عموما في الأذن ^5،6. تم التحقق من صحة الفحص في وقت لاحق للاستخدام في الجرذان والفئران ^{7 8.}

تاريخيا،وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية، بما في ذلك حقن مستضد قبل حقن الصبغة، حقن الصبغة قبل حقن المستضد، وحقن صبغة في وقت واحد والمستضد. إدارة صبغة عن طريق الوريد كوسيلة لقياس استجابات حساسية هي فحص تنوعا لأنها يمكن أن تستخدم لقياس نشطة، سلبية، وعكس ردود فعل سلبية ^5،9. وقد استخدمت الأصباغ العديدة لتقييم استجابات حساسية، بما في ذلك التريبان الأزرق، Pontamine السماء الزرقاء، ايفانز الأزرق، الأزرق غايغي 536، والهند الحبر ^5،6،9. هناك حل من 0.5٪ ايفانز الأزرق حاليا الصبغة القياسية المستخدمة لقياس استجابات حساسية في الجلد.

الاستجابة إلى التحدي الحساسية هي عابرة. يتم التوصل إلى الحد الأقصى لكثافة الداخل 10 - 15 دقيقة من حقن الصبغة، وأي رد فعل مرئيا إذا كانت تدار صبغة أكثر من 30 دقيقة بعد التحدي، بغض النظر عن أنواع الحيوانات المستخدمة ^9. كان الكمي لصبغ تسرب الأصليلاي الحصول عليها عن طريق قياس حجم الانتفاخ كما يدل على ذلك صبغة زرقاء ^7-9. بالإضافة إلى ذلك، تهم الخلايا البدينة degranulated يمكن كميا بواسطة استئصال أنسجة الجلد من موقع رد الفعل وتلطيخ مع طولويدين الأزرق ^7. وكثيرا ما يستخدم تحبب الخلايا البدينة كعلامة للالجلدي، استجابات حساسية إيج بوساطة، والخلايا البدينة هي خلية السكان المحليين الرئيسي معربا عن تقارب عالية إيج مستقبلات FcεRI. تم تطوير تقنيات طيفية لقياس تسرب الصبغة في الأنسجة الجلدية الحساسية المفرطة للالسلبي (PCA) في الفئران والفأر ^{10 11} في عام 1990.

وقد تم تكييف البروتوكول الحساسية المفرطة فحص المحلية التالية من كوجيما وآخرون. ^1، ويستخدم ألبومين البيض بيض الدجاج (OVA) كما مستضد لانتزاع استجابات حساسية. ومع ذلك، مستضدات أخرى من OVA قد تستخدم اذا شئت. ثم يستخدم الفحص ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في الأوعية الدموية permeabilitذ التي تحدث بسبب الصاري خلية إيج عبر ربط وإطلاق الهستامين.

Protocol

1. الفئران توعية

1. إعداد محلول المخزون عن طريق تمييع OVA OVA في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل. تجميد أسفل مأخوذة في cryovials وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2. تحقيق واحد أو أكثر aliquots من 20 ملغ / مل الأسهم OVA إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع OVA في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في أنبوب 5 مل البوليسترين جولة القاع مع قبعة. دوامة لفترة وجيزة لخلط.
3. في حين عقد أنبوب البوليسترين التي تحتوي على 1 ملغ / مل OVA على دوامة وضعت في سرعة متوسطة، إضافة حجم مساو من المتجانس تماما Imject الشب (40 ملغ / مل) قطرة قطرة مع الاستمرار في دوامة أنبوب لإنتاج نسبة 1: 1 ل الشب لمستمنع.
4. وضع غطاء على أنبوب وأنبوب الشريط لدوامة. تحويل دوامة على أدنى الإعداد والسماح OVA بأن يمتص إلى الشب لمدة 30 دقيقة.
   1. لا تسمح كمية كبيرة من الوقت لتمرير بين إعداد OVA / الشب وتوعية الفئران. إذا التوعية لا يمكن إتمام مباشرة بعد OVA / الشب preparatأيون، مخزن OVA / الشب في درجة حرارة الغرفة. دوامة لمدة 1 دقيقة قبل استخدام.
5. تحميل الأنسولين حقنة 1 مل مع OVA / الشب الخليط. سقف الحقنة مع إبرة قياس 27.
6. ضخ 100 ميكرولتر من OVA / الشب في الصفاق من BALB / ج الفئران لجرعة في الماوس من 50 ميكروغرام من OVA و 2 ملغ من الشب.
7. لمراقبة سلبية، توعية مجموعة أخرى من الفئران إلى برنامج تلفزيوني. إعداد 1: 1 خليط من الشب وPBS في بنفس الطريقة المذكورة أعلاه، حذف OVA.
8. توعية جميع الفئران (OVA والسيطرة PBS) مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع ليصبح المجموع 3 الحقن. بعد الحقن النهائي، انتظر على الأقل 2 أسابيع قبل إجراء فحص الحساسية المفرطة المحلي.

2. المحلية العوار الفحص

1. جلب OVA محلول المخزون إلى درجة حرارة الغرفة. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وتمييع 20 ملغ / مل الأسهم OVA إلى تركيز النهائي من 5 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني (1: 4 التخفيف من OVA في 1X PBS). دوامة لفترة وجيزة لخلط.
2. تخدير الفئران باستخدام RC ^{2 <}/ سوب> القوارض نظام التخدير (أو نظام مماثل تسليم يتبخر). ملء خزان مع isoflurane، وبدوره على تدفق الهواء O _2. مكان الفئران في غرفة تحريض وضبط قرص التحكم الأيزوفلورين إلى 5٪ لبدء التخدير. مرة واحدة يتم تخدير الفئران تماما، يتبين من عدم الحراك، وضبط قرص التحكم الأيزوفلورين إلى 3٪ للحفاظ على التخدير العميق. الغرض من التخدير في هذا الإجراء هو شل الحيوان. الحقن الأذن والذيل الوريد لا تسبب الألم أو الضيق كبيرا للحيوان.
   ملاحظة: الأيزوفلورين يمكن أن يكون لها آثار سلبية على الجهاز التناسلي البشري. تأكد من استخدام في غرفة جيدة التهوية وإرفاق اسطوانة الكسح إلى غرفة تحريض لتحييد النفايات الغازية. إذا كنت حاملا أثناء استخدام الأيزوفلورين، وارتداء قناع فلتر الكربون لتقليل التعرض.
3. تحميل 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل OVA إلى حقنة الأنسولين 3/10 سم مكعب توج مع إبرة 31 G. تحميل 3/10 سم مكعب حقنة الأنسولين آخر مع 10 ميكرولترمن 1X PBS.
4. باستخدام مجهر تشريح، وضخ 10 ميكرولتر من OVA في الأذن اليمنى من الماوس تخدير لجرعة التحدي من 50 ميكروغرام من OVA. جرعات أخرى، مثل 20 ميكروغرام، هي أيضا مقبولة.
   1. لتحقيق الاستقرار في الأذن للحقن، والتفاف الاسكتلندي (الجانب زجة متابعة) حوالي 15 مل أنبوب مخروطي. تأمين الجانب الظهري من الأذن اليمنى إلى الشريط. إدراج الجانب شطبة إبرة يصل بين الأوراق اثنين من الأذن. حقن ببطء OVA في وسط النسيج الأذن، مع الحرص على عدم ضرب أي الأوعية الدموية.
5. باستخدام نفس الطريقة المذكورة أعلاه، وضخ 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الأذن اليسرى كعنصر تحكم السلبية.
6. انتظر 3 دقائق.
   1. خلال هذا الوقت، ضع الماوس في رادع وعقد ذيل تحت مصباح الحرارة أو في حمام ماء دافئ لمدة 1 دقيقة إلى تمدد الأوعية الدموية.
7. باستخدام حقنة 1 مل الأنسولين توج مع إبرة 27 G، حقن ببطء 200 ميكرولتر من 0.5٪ ايفانز الأزرق صبغة في الذيل الخامسعين من الفأرة. تدار الحقن السريع قد تدمر هيكل السفينة قبل كامل 200 ميكرولتر. إذا حدث هذا، محاولة لحقن حجم ما تبقى من الصبغة في الوريد على الجانب الآخر من الذيل.
8. الانتظار 10 دقيقة.
9. الموت ببطء الماوس وإزالة كلتا الأذنين باستخدام ملقط ومقص جراحي.
   1. الاستيلاء على حواف الأذن مع ملقط، والتأكد من أن أي ضغط يطبق على موقع الحقن في مركز الأذن. إزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة الأذن ممكن عن طريق خفض بالقرب من، ولكن ليس من خلال سلسلة من التلال الغضروف الحاضر في قاعدة الأذن. كميات صغيرة من الفراء قد تكون موجودة على الأذن استئصاله. هذا لن يؤثر على الفحص.
10. قسامة 700 ميكرولتر من الفورماميد إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إعداد أنبوب واحد في الأذن (أنبوبين في الماوس).
    ملاحظة: الفورماميد هو ماسخة، مطفرة، ومصدرا للإزعاج. ارتداء القفازات، وحماية العين، وحماية الوجه. النساء الحوامل يجب توخي الحذر عند التعامل معقد تكون ق الفورماميد سمي جنيني.
11. إضافة إلى آذان الفورماميد، وكأب الأنابيب، واحتضان بين عشية وضحاها في حمام الحرارة الجافة المنصوص إلى 63 درجة مئوية. الأذنين قد لا تزال تظهر اللون الأزرق قليلا بعد الحضانة. ولكن يتم استخراج معظم الصبغة في الفورماميد.
12. إضافة 300 ميكرولتر من كل عينة من نسختين إلى 96 لوحة جيدا. تجنب نقل الفراء إذا كان موجودا في العينة. ضمان عدم وجود فقاعات الموجودة في الآبار، لأنها سوف تؤثر على القراءة الامتصاصية.
13. إضافة 300 ميكرولتر من الفورماميد، في نسختين، إلى 96 لوحة جيدا. وسوف تستخدم هذه الآبار والفراغات.
14. استخدام مطياف لقياس الامتصاصية في 620 نانومتر. آبار الفورماميد طرح من كل قراءة العينة.
    ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب في إطار البروتوكولات وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة الخدمات الموحدة.

النتائج

والحيوانات التي خضعت للفحص بنجاح يكون الجلد والعيون التي تظهر باللون الأزرق. يجب توعية PBS الحيوانات لا تتفاعل إما برنامج تلفزيوني أو OVA التحدي، ينبغي أن تظل بالتالي كلتا الأذنين الأبيض (الشكل 1A). في الحيوانات OVA توعية، الأذن تلقي التحدي PBS (يسار) وينبغي أن تكون...

Discussion

وتستخدم علامات عديدة من أمراض الحساسية لتقييم قوة استجابات حساسية التالية التحدي حساسية، بما في ذلك التغيرات في مستويات تعميم الهستامين، إنتاج السيتوكينات الاستجابة Th2، وتجنيد خلية في السائل القصبات في وضع التحدي مجرى الهواء. في حين رصد التغيرات في هذه المعايير ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c Mice	The Jackson Laboratory	651
PBS pH 7.4	Quality Biologic	114-058-101
Ovalbumin	Sigma	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	Mix thoroughly before use
Evans Blue Dye	Sigma	E2129
Formamide	Sigma	295876	99%+ Spectrophotometric grade
Isoflurane, USP	Phoenix	NDC 57319-474-06
1cc Insulin syringes	BD	329654
3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle	Terumo	NDC 100861
27 G Needles	BD	305109
Forceps	F.S.T.	11000-12
Surgical scissors	F.S.T.	14070-12
5 ml Polystyrene round-bottom tubes	BD Falcon	352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes	Medical Supply Partners	15-1151
15 ml Conical tubes	BD Falcon	352097
Flat-bottom 96 well plate	Costar	3590
Scotch tape
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560 with 3 inch platform