JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Abstract

فهم الآليات التي المحركات الجزيئية تنسيق أنشطتهم لنقل البضائع حويصلي داخل الخلايا العصبية يتطلب التحليل الكمي للجمعيات المحرك / البضائع على مستوى حويصلة واحدة. الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام المجهر مضان الكمي لربط ("الخريطة") موقف وتوجه حركة البضائع الحية إلى كميات تكوين والنسبية المحركات المرتبطة بنفس البضائع. "رسم الخرائط للشحن" يتكون من التصوير الحي للبضائع fluorescently المسمى تتحرك في محاور مثقف على أجهزة ميكروفلويديك، تليها تثبيت الكيميائي أثناء تسجيل الحركة الحية، والمناعي لاحق (IF) تلطيخ من نفس المناطق بالضبط محور عصبي مع الأجسام المضادة ضد المحركات. ويتم تقييم Colocalization بين الشحنات والمحركات المرتبطة بها من خلال تخصيص موقف الفرعي بكسل تنسق لقنوات السيارات والبضائع، من خلال وظائف جاوس مناسبة للحيود ليثيومmited انتشار نقطة ظائف يمثلون الفردية مصادر نقطة الفلورسنت. يتم فرضه البضائع والسيارات صور ثابتة لاحقا إلى قطع حركة البضائع، ل"الخريطة" لهم لتتبع مساراتها. قوة هذا البروتوكول هو مزيج من العيش وإذا كانت البيانات لتسجيل كل من نقل الشحنات حويصلي في الخلايا الحية وتحديد المحركات المرتبطة نفس هذه الحويصلات الدقيقة. هذه التقنية تتغلب التحديات السابقة التي تستخدم أساليب الكيمياء الحيوية لتحديد متوسط ​​تكوين محرك تنقيته غير متجانسة السكان حويصلة بالجملة، لأن هذه الأساليب لا تكشف التراكيب على الشحنات المتحركة واحدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل مسارات النقل و / أو الاتجار أخرى في أنواع الخلايا الأخرى لربط حركة هياكل داخل الخلايا الفردية مع تكوين البروتين. قيود من هذا البروتوكول هي إنتاجية منخفضة نسبيا نظرا لانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن مثقفالخلايا العصبية الابتدائية وحقل المحدود المتاح لعرض عالية الدقة التصوير. ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية طرق لزيادة عدد الخلايا العصبية معربا عن الشحنات fluorescently المسمى.

Introduction

النقل داخل الخلايا أمر حاسم في جميع أنواع الخلايا لتسليم البروتينات والأغشية، والعضيات، والجزيئات يشير الى مختلف المجالات الخلوية 1. الخلايا العصبية وخلايا متخصصة للغاية مع طويلة، توقعات الاستقطاب التي تعتمد بشكل كبير على نقل البضائع داخل الخلايا الأساسية للتسليم لمسافات طويلة لمختلف microdomains محور عصبي. وتوسط هذا النقل kinesins وdyneins - عائلتين كبيرة من البروتينات المحركات الجزيئية - التي ترتبط وتتبع الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة الاستقطاب في تقدمي ورجعية الاتجاهات، على التوالي. في حين تتوسط أساسا حركة تراجعية من قبل داينين، مما يسهل التحرك في الاتجاه تقدمي قبل الكبيرة، عائلة متنوعة من المحركات كينيسين وظيفيا. بالتالي، نقل البضائع تقدمي محور عصبي يمكن بوساطة مختلف أفراد الأسرة من الفصيلة كينيسين 1-5. على الرغم من بعض الشحنات تتحرك باستمرار في كلا الاتجاهين، مOST الشحنات تتحرك في الاتجاهين وعكس كثير من الأحيان في طريقهم إلى وجهاتهم النهائية 1،5-13. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن المحركات معارضة الاتجاهية الزميلة في وقت واحد لشحنات، مما يثير السؤال عن كيفية يتم تنسيق حركة البضائع الخاضعة للتنظيم من قبل محركات عكس القطبية 5-7. معا، نقل الشحنات محور عصبي هو عملية منسقة الذي ينظمه تكوين المحركات والأنشطة البيوكيميائية الخاصة بها، والتي بدورها تعتمد على محولات مختلفة وشركاء ملزم التنظيمي 14.

لوصف بأمانة آلية نقل المحاور لشحنة محددة والكشف عن التنظيم الكامن وراء هذا النقل، فإن من الأهمية بمكان لتحديد تكوين البروتينات الحركية وشركاء ملزم التنظيمي المرتبطة الشحنات الفردية خلال نقلها المباشر. أساليب أخرى، على سبيل المثال مناهج الكيمياء الحيوية، وتوفر تقديرات متوسط ​​يذكرهأو التراكيب على النقى السكان حويصلة غير متجانسة، ولكن هذه التقديرات لا تكشف عن نوع أو كمية من المحركات المرتبطة الحويصلات واحدة متحركة. أيضا، إعادة تشكيل حويصلة النقل على طول الأنابيب الدقيقة مجمعة مسبقا في المختبر مكنت قياس كمية نوع واحد من السيارات على مستوى حويصلة واحدة 15. ومع ذلك، فإن هذه التجارب لا ترتبط بشكل مباشر على كمية من المحركات مع خصائص نقل تلك الحويصلات، وقياس النقل في غياب العوامل التنظيمية الخلوية.

بروتوكول يرد هنا، والذي يحدد تكوين المحرك (نوع وكمية النسبي للمحركات) من الحويصلات الانتقال من الفردية أعرب المناعي (IF) بيانات قياس التطور الطبيعي البروتينات الحركية، ويرتبط هؤلاء المعلمات إلى النقل المباشر لنفس الحويصلات بالضبط في الخلايا العصبية 16. ويستتبع هذا طريقة التعيين الدقيق لل-IF إلى العيش البيانات حركة البضائع. ويتم إنجاز ذلك من خلال growinز الخلايا العصبية قرن آمون في الماوس الأجهزة ميكروفلويديك بعد ثبوت بروتوكولات 17-19. هذه الأجهزة تسمح لتحديد والارتباط ("الخرائط") من المحاور والشحنات تتحرك واحدة في طرائق ضوء المجهر الثابتة والحية (الشكل 1). و transfected الخلايا العصبية مثقف مع fluorescently البروتينات المسماة البضائع التي تم تصويرها في القرار المكانية والزمانية عالية للحصول على معلومات مفصلة الحركة أن يتم رسم في kymographs النقل. أثناء التصوير، ويتم إصلاح الخلايا العصبية مع امتصاص العرق، وبعد ذلك الملون مع الأجسام المضادة ضد البروتينات الحركية الذاتية. يتم فرضه البضائع والسيارات صور ثابتة على kymographs الحركة الحية إلى "خريطة" (colocalize) لهم البضائع الحية مسارات حركة 16. لربط الحركة الحية للبضائع مع جمعية البروتينات الحركية، ويتم تحليل colocalization باستخدام العرف MATLAB حزمة برامج تسمى "موتور Colocalization "16،20. شحنات fluorescently المسمى ومحركات تولد محدودة حيود منقط الميزات التي يمكن أن تتداخل جزئيا. لحسم الموقف من نقاط ومتداخلة، البرنامج الأول تلقائيا يناسب ظائف جاوس إلى كل وظيفة انتشار نقطة، تمثل نقاط والفلورسنت الفردية، لتحديد موقف XY الفرعية بكسل دقة بهم تنسق وشدة سعة 21-23، ومواقف للسيارات والبضائع و بعد ذلك مقارنة مع بعضها البعض لتحديد colocalization 16،20. وبالتالي، هذا الأسلوب يكلف أكثر دقة colocalization بين نقاط والفلورسنت بالمقارنة مع الطرق الأخرى 24.

قوة هذه الطريقة هي القدرة على تقييم colocalization المحركات مع الشحنات الفردية في الخلايا الثابتة، والتي كانت مسارات الحركة الحية (على سبيل المثال، في الاتجاه الذي كانت تتحرك في وقت التثبيت) تفصيلأورديد. مع هذا الأسلوب، تم العثور على kinesins وdyneins لربط في الوقت نفسه إلى الحويصلات التي تحمل بروتين بريون العادي (بي ار بي -cellular C)، شحنة المخصب neuronally التي تتحرك في الاتجاهين أو تبقى ثابتة في 16 محاور. يسمح هذا التحليل في صياغة نموذج للعمل لتنظيم حركة C بي ار بي الحويصلة التي تقدمي (كينيسين) ورجعية (داينين) محركات تنسيق أنشطتها من أجل تحريك الحويصلات في كلا الاتجاهين أو أن تبقى ثابتة بينما المرتبطة البضائع . قوة أخرى هذه الطريقة هي إمكانية تطبيقه واسع محتمل للتميز colocalization / جمعية العديد من الشحنات fluorescently المسمى التي تتحرك في الواقع أي نوع من الخلايا، مع أي بروتين آخر (ق) من الفائدة. وبالتالي، يمكن أن يعيش / علاقة ثابتة يحتمل أن تسمح للكشف عن عابرة تفاعلات البروتين البضائع، العديد من الأفراد fluorescently المسمى تتحرك الجزيئات يمكن تحليلها على مدى ع المطلوبeriod من الزمن. نظرا لتطبيق واسع ونوع الأسئلة التي يمكن أن تعالج هذه الطريقة، فإن هذا البروتوكول تكون ذات فائدة لجمهور واسع من علماء الأحياء الخلايا بما في ذلك أولئك الذين يدرسون الاتجار والنقل في الخلايا العصبية أو في أنواع الخلايا الأخرى.

Protocol

أجريت جميع التجارب التالية البروتوكولات المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للرعاية الإنسانية للحيوانات التجارب. الموت الرحيم كانت الفئران حديثي الولادة بواسطة قطع الرأس.

1. إعداد الأجهزة ميكروفلويديك للثقافة الخلية

  1. إعداد polydimethyl siloxane (PDMS) أجهزة ميكروفلويديك لنمو الخلايا العصبية قرن آمون كما وصفه هاريس وزملاؤه 17-19. وفيما يلي بعض التعديلات التي تم تكييفها وفقا لبروتوكول رسم الخرائط البضائع.
    ملاحظة: الأجهزة ميكروفلويديك هي أيضا متوفرة تجاريا (قائمة المواد)، وبالتالي الوصول إلى منشأة لتصنيع ليست ضرورية.
  2. إعداد رقم 1½ غطاء نظارات (24 × 40 ملم) من خلال غسلها ثلاث مرات مع الأسيتون، تليها ثلاث غسلات مع الإيثانول بنسبة 100٪ وثلاث غسلات من الماء. متجر coverslips في الماء عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. هذه العلاجات تساعد على ضمان أن coverslips نظيفة من الحطام التي قد تتداخل مع الطلاء من سلليرة سورية، والتلوث، والبقاء على قيد الحياة.
    ملاحظة: الأسيتون والإيثانول قابلة للاشتعال والخطرة في حالة ملامسة الجلد (توتر)، اتصال العين (توتر)، من الابتلاع، استنشاق. التصرف وفقا للوائح الرسمية.
  3. عندما تصبح جاهزة للاستخدام، وضع غطاء زجاجي واحد في صحن 60 ملم ثقافة الخلية في الجهاز ميكروفلويديك، والسماح لها الهواء الجاف كشف لمدة 45 دقيقة داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لتجنب التلوث.
  4. بعد قطع الأجهزة الخروج من الماجستير وتم قطع اللكمات لإنشاء الخزانات (الشكل 1A، B)، ووضعها مع قنوات ميكروفلويديك جانب المتابعة داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 45 دقيقة للتعقيم.
    ملاحظة: الأجهزة تحت العلاج بالأشعة فوق البنفسجية ترك لفترة أطول من 2 ساعة قد تؤثر على سلامة PDMS.
  5. تجميع الأجهزة عن طريق وضع جهاز واحد على كل غطاء زجاجي داخل صحن 60 ملم ثقافة الخلية البلاستيكية بحيث تواجه القنوات ميكروفلويديك أسفل. تطبيق ضغط لطيف على س العلويو الجهاز (تجنب لمس و microchannels) لتوفير الختم غير دائم في الجهاز على الزجاج غطاء. تغطية كل 60 مم طبق ثقافة الخلية مع غطاء.
  6. باستخدام micropipette، هيدرات الأجهزة من خلال إضافة زراعة الخلايا الماء درجة إلى الأعلى خزانين ميكروفلويديك (1 و 2 في الشكل 1A)، والسماح لتدفق المياه من خلال. إزالة المياه مع ممص مكروى وإضافة 1 ملغ / مل بولي-L-يسين في خزان ميكروفلويديك 1 (200 ميكرولتر) و 2 (100 ميكرولتر). والفرق حجم يسمح للبولي-L-يسين في التدفق من خلال و microchannels (الشكل 1A، B).
  7. لضمان أن تكون الأجهزة داخل 60 ملم أطباق زراعة الخلايا لا يسقط داخل الحاضنة 37 درجة مئوية، وضع ثلاثة أطباق ثقافة خلية 60 ملم تحتوي على أجهزة إلى 150 ملم خلية البلاستيك صحن الثقافة وتغطية صحن مع غطاء. احتضان O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. عادة أكثر من 90٪ من القنوات التي يمكن استخدامها في الجهاز والقياملا تحتوي على أي فقاعات الهواء أو انسداد المادي.
  8. في اليوم التالي، استبدال بولي-L-يسين بالماء ويترك الجهاز في الحاضنة لمدة 1 ساعة على الأقل. تكرار هذا الغسيل ثلاث مرات. إزالة الماء وإضافة Neurobasal-A متوسطة النمو (التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحق و 500 ميكرومتر GlutaMAX) لكل جهاز. ترك O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  9. في اليوم التالي، لوحة خلايا قرن آمون كما هو موضح أدناه.

2. تصفيح من الفأر الخلايا العصبية الحصين الابتدائية في أجهزة ميكروفلويديك

ملاحظة: إعداد الخلايا العصبية الحصين مثقف من الفئران حديثي الولادة قد نشرت سابقا في إن الرب 25. وفيما يلي بعض التعديلات التي تم تكييفها لوحة الماوس الخلايا العصبية قرن آمون في أجهزة ميكروفلويديك، والتي كانت الأمثل لtransfections.

  1. قبل الماوس تشريح الدماغ، قبل الدافئ Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني(FBS، وبدون المضادات الحيوية)، خليط ألف (125 ملغ DL-السيستين، 125 ملغ ألبومين المصل البقري (BSA) و 3.125 غرام من مد الجلوكوز في 500 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)؛ فلتر تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون) وديوكسي ريبونيوكلياز أنا الحل (الدناز الأول: 50 ملغ من الدناز أنا و 0.5 مل من 1.2 M MgSO 4 الحل في 100 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) فلتر تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون) في 37 ° C حمام الماء.
    1. قبل الدافئ Neurobasal-A المتوسطة النمو داخل حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 للتوازن الرقم الهيدروجيني.
  2. تشريح الحصين 1-3 يوم الفئران حديثي الولادة القديمة وفقا للبروتوكولات المعمول 26. الحفاظ الحصين في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 10 مل تشريح عازلة (HBSS تحتوي على 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 50 ملي الجلوكوز، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين)، على الجليد. طرح 4 الحصين لكل 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  3. أداء بروتوكول المتبقية تحت شرط العقيمةS داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  4. تمييع 45 وحدة من غراء في 5 مل من خليط A، الدوامة، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى يذوب المسحوق غراء. إضافة 1 مل من محلول الدناز أنا. تصفية الخليط من خلال 0.22 ميكرون وحدة مرشح حقنة.
  5. نضح بعناية HBSS "من 15 مل المخروطية أنبوب يحتوي الحصين. إضافة 10 مل من البرد (4 درجات مئوية) HBSS إلى الحصين والسماح لهم تستقر في قاع الأنبوب. نضح بعناية HBSS من 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  6. إضافة 1 مل غراء / الدناز أنا مزيج لتصل إلى 4 الحصين واحتضان لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إمالة أنبوب مخروطي كل 5 دقائق ليستحم الحصين مع المزيج. وضع بدلا الحصين في 37 درجة مئوية ماء الحمام لطيف شاكر مع اهتزاز (~ 100 دورة في الدقيقة).
  7. نضح غراء / الدناز أنا خلط وغسل الحصين مرتين قبل تحسنت DMEM (37 ° C) تحتوي على 10٪ FBS.
  8. بعد غسل الثاني، إضافة 2 مل من قبل تحسنت DMEM تحتوي على 10٪ FBS إلى الحصين الحصين ويسحن يدويا من قبل pipettingصعودا وهبوطا ~ 10-12 مرات باستخدام ماصة 1 مل لفصل الخلايا العصبية.
  9. دعونا يسحن تسوية ل~ 1 دقيقة وهذا سوف يسمح الخلايا العصبية غير نأت لتستقر في قاع الأنبوب المخروطي. نقل طاف تحتوي على الخلايا العصبية فصلها إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد تجنب نقل الأنسجة الكبيرة التي استقرت في قاع الأنبوب.
  10. تدور الخلايا في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالتها بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية. الخلايا resuspend في 80 ميكرولتر Neurobasal-A المتوسطة النمو من قبل pipetting بلطف.
  11. إزالة المتوسطة من خزان ميكروفلويديك 1 و 1 '. تطبيق 20 ميكرولتر من الخلايا (~ 275000) إلى خزان ميكروفلويديك 1، والسماح لهم بالتدفق من خلال. وضع الجهاز في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 20 دقيقة.
  12. تبدو تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا انضمت إلى الزجاج غطاء. إضافة Neurobasal-A المتوسطة النمو إلى أعلى قبالة كل الخزانات. يعود الجهاز مع الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ 2.
  13. تحقق الأجهزة ~ كل 2-3 أيام وأعلى من الخزانات مع Neurobasal-A التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحق (بدون GlutaMAX) لتجنب التبخر. تبدأ الخلايا العصبية لتوسيع محاور من خلال قنوات ميكروفلويديك ~ 2-3 أيام بعد الطلاء. الخلايا العصبية تخضع لترنسفكأيشن عادة 7-10 أيام بعد الطلاء.

3. ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين يزرع في جهاز ميكروفلويديك

  1. لكل جهاز، وإعداد مزيج من 1.2 ميكرولتر Lipofectamine 2000 في 30 ميكرولتر Neurobasal-A، ومزيج من 0.5 ميكروغرام الفلورسنت الانصهار البضائع بلازميد في 30 ميكرولتر Neurobasal-A واحتضان 5 دقائق على RT. إضافة Lipofectamine المزيج لمزيج الحمض النووي واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. إضافة 60 ميكرولتر من Neurobasal-A التي تحتوي على 4٪ B-27 تكملة لDNA / Lipofectamine خلط ومزج عبها الأنبوب.
  2. إزالة جميع وسائل الإعلام من خزان ميكروفلويديك 2 و 2 "وملء بعناية الآبار مع Neurobasal-A التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحق دون إراقة على المدى المتوسط ​​الباحثس المقصورات الأخرى.
  3. إزالة وسائل الاعلام من خزان ميكروفلويديك 1 و 1 '. إضافة 120 ميكرولتر من الحمض النووي / Lipofectamine المزيج إلى خزان ميكروفلويديك 1 والسماح لها بالتدفق. يعود الجهاز إلى 37 درجة مئوية مع حاضنة CO 2 5٪ لمدة 3-4 ساعة.
  4. إزالة جميع وسائل الإعلام من خزان ميكروفلويديك 1 و 1 "واستبدالها مع Neurobasal-A التي تحتوي على 2٪ B-27 ملحقا لمدة 24 ساعة (أو حتى جاهزة للصورة). عادة، و transfected 5-7 المحاور التي تنمو من خلال microchannels في ظل هذه الظروف، والتي تمثل حوالي 1-3٪ كفاءة ترنسفكأيشن تتفق مع الكفاءات التي نشرت عن الخلايا المستزرعة الحصين 26.

4. "شحن رسم الخرائط" تحليلات

  1. التصوير المباشر لحركة البضائع
    1. إجراء التصوير على ضوء المجهر epifluorescence مقلوب مجهزة الحاضنة 37 درجة مئوية، وغرفة التحكم CO 2.
    2. جبل ساترة مع الخلايا العصبية قرن آمون نمت في ميكرجهاز ofluidic على خشبة المسرح المجهر. لتجنب موت الخلايا العصبية، والعمل على وجه السرعة للحفاظ على العينات في المجهر مدة لا تزيد عن 1 ساعة.
    3. باستخدام الهدف عالية الدقة (100X)، والعثور على محاور عصبية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عبر القنوات التي تمتد من غرف ميكروفلويديك وتسجيل عدد من القنوات التي تم العثور محور عصبي transfected. عد عدد من القنوات باستخدام عداد اليد رصيده.
      1. لتسجيل الأمثل للحركة الحية وتحليل colocalization لاحق، واختيار المحاور التي تنمو مسطح نسبيا من خلال القنوات بحيث تصوير معظم الحويصلات يمكن أن يؤديها في التركيز.
    4. إزالة معظم المتوسطة من الخزانات 2 و 2 'مع 1 مل نقل ماصة بلاستيكية. لتسهيل المواءمة اللاحقة من الصور الثابتة مع مسارات الحركة على kymographs، محاذاة الحافة اليمنى و microchannels مع مجال الرؤية أثناء التصوير (الشكل 1B، C).
    5. لتسهيل فيشينغرام من العينات أثناء التصوير، وأداء التصوير الحي مع شخصين. بدلا من ذلك، إذا يتم إجراء التصوير الحي من قبل شخص واحد، واستخدام نظام المجهر مجهزة تصحيح الانحراف.
    6. بدء تصوير حركة البضائع الحية مع مرور الزمن مواصفات محددة لديناميات نقل البضائع التي يجري تحليلها (المجهر مواصفات وإعدادات التصوير YFP بي ار بي-C المحددة في أسطورة الشكل 2 والمواد القائمة).
    7. بعد أن تم جمع بيانات حركة حية كافية، لدينا شخص واحد تملأ الخزانات 2 و 2 "مع تدفئته قبل بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.04 غ / مل السكروز لإصلاح الخلايا. تجنب لمس الجهاز ميكروفلويديك، لأن هذا سيؤدي إلى اختلال التركيز في التصوير الحي. يكون الشخص الآخر ضبط التركيز بينما يتم إضافة تثبيتي. تثبيت ناجحا عندما لوحظ توقف الفوري عن الحركة. إضافة تثبيتي إلى خزان 1 و 1 "بعد ذلك.
      ملاحظة: photoblea المؤقتةتشينغ من مضان البضائع ويمكن أيضا ملاحظتها، ولكن استمر مضان بعد اكتمال إذا تلطيخ للبروتينات السيارات (الخطوة التالية).
      ملاحظة: لامتصاص العرق هو ضار عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد، وإذا ابتلع. مهيجة للعيون والجهاز التنفسي والجلد. التصرف وفقا للوائح الرسمية.
  2. إذا تلطيخ البروتينات الحركية لتحليل colocalization
    ملاحظة: للحصول على الكميات النسبية من مستويات البروتينات الحركية (كما هو محدد من قبل تلوين الأجسام المضادة)، المرتبطة الشحنات تتحرك الفردية، والتحقق من صحة معايرة الأجسام المضادة للتأكد من أن الضد مستضد ملزمة مشبعة. يتم ذلك عن طريق تحديد خصوصية الأجسام المضادة باستخدام الخلايا العصبية التي البروتين من الفائدة وقد طرقت التدريجي إما أو طرقت إلى أسفل، وطريق إجراء تحليل IF مع زيادة تركيز الأجسام المضادة. لضوابط السلبية، هي ملطخة الخلايا العصبية مع الأجسام المضادة الثانوية في غياب الأجسام المضادة الأولية. أكثر تفصيلاوصف التحقق من صحة الأجسام المضادة يمكن العثور عليها في Encalada وآخرون 16، وSzpankowski وآخرون 20.
    1. إزالة ساترة مع الخلايا العصبية قرن آمون نمت في جهاز ميكروفلويديك من مرحلة المجهر. لا فصل الجهاز ميكروفلويديك من ساترة، كما تحتاج و microchannels لتبقى سليمة من أجل ركب الصور الحية والثابتة. تنفيذ الخطوات التالية في غرفة الرطوبة.
    2. لضمان تدفق إلى حلول و microchannels، والحفاظ على فارق حجم عازلة بين الخزانات 1، 1، و 2، 2 'من لا يقل عن 30 ميكرولتر. في جميع الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، إضافة حجم 100 ميكرولتر وسائل الإعلام إلى خزان ميكروفلويديك 2، 2 '، وحجم وسائل الإعلام 70 ميكرولتر إلى خزان ميكروفلويديك 1، 1'.
    3. إزالة تثبيتي من دوائر الجهاز ميكروفلويديك وغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني انتظار 10 دقيقة بين يغسل.
    4. Permeabilize خلايا بإضافة 0.1٪ تريتون X-100 diluتيد في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لجميع الخزانات.
    5. إزالة حل من كل الخزانات ويغسل مع برنامج تلفزيوني. تكرار الغسيل ثلاث مرات انتظار 10 دقيقة بين يغسل.
    6. إزالة حل من كل الخزانات وتطبيق حظر العازلة التي تحتوي على 10٪ مصل حمار عادي و 3٪ البروتيني الحر والغلوبولين المناعي G (مفتش) خالية BSA في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT.
    7. تدور حل الأسهم الأجسام المضادة الأولية في 20000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الرواسب. تمييع الأجسام المضادة للتركيز المناسب في عرقلة العازلة. استبدال عازلة تمنع من جهاز ميكروفلويديك مع الحل الضد. احتضان عينات لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية.
    8. إزالة حل من كل الخزانات ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، والانتظار 10 دقيقة بين يغسل.
    9. تدور حل الأسهم الضد الثانوية في 20000 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الرواسب. تمييع الأجسام المضادة للتركيز المناسب في عرقلة العازلة. استبدال برنامج تلفزيوني مع الحل الضد الثانوية. احتضانعينات لمدة 1 ساعة على RT.
    10. إزالة حل من كل الخزانات ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، والانتظار 10 دقيقة بين يغسل.
    11. استبدال برنامج تلفزيوني مع ~ 10-20 ميكرولتر المتوسطة المتزايدة من قبل pipetting مباشرة تصاعد المتوسطة في فتح قنوات ربط الخزانات. دعونا تصاعد الإعلام الجافة لل~ 20 دقيقة - 1 ساعة على RT.
    12. أجهزة تخزين عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء لتجنب photobleaching من ومحاور الصورة خلال يومين (بحد أقصى أسبوع واحد) من تلطيخ.
    13. بعد اكتمال التلوين، جبل ساترة مع الخلايا العصبية قرن آمون نمت في جهاز ميكروفلويديك على خشبة المسرح المجهر. تحديد موقع المنطقة من محور عصبي transfected تصويرها في خطوة 4.1.1-4.1.7.
    14. الحصول على صور Z كومة (300 الخطوات نانومتر) لكل واحدة من ثلاث قنوات: البضائع، والسيارات 1، 2 المحرك، وذلك باستخدام الهدف عالية الدقة (على سبيل المثال، فإن أحد الأهداف عالية النفط الفتحة العددية أو الماء).
      ملاحظة: شراء Z-مداخن لا يقل أهمية عن المحاور غالبا لا تنمو مسطحة تمامافي microchannels، وبالتالي ليس كل نقاط والفلورسنت الموجودة في نفس المستوى البؤري.
  3. رسم الخرائط البضائع
    1. توليد مخطاط التموج من حركة البضائع باستخدام برمجيات تحليل الصور. وأوصى البرنامج المساعد يماغيج التي وضعتها Rietdorf وسيتز (EMBL) لتوليد kymographs (للتحميل نرى قائمة المواد).
      ملاحظة: يماغيج هو المجال العام، جافا القائمة على برنامج معالجة الصور المتقدمة في المعاهد الوطنية للصحة 27،28 (للتنزيل رؤية قائمة المواد).
    2. محاذاة الصور الثابتة من البضائع الفلورسنت (إنشاؤها في الخطوة 4.2.14) يدويا بتركيب لهم على موقف مسارات في مخطاط التموج عند نقطة تثبيت (الشكل 2A، B)، وذلك باستخدام برنامج حاسوبي الرسوم البيانية المتاحة تجاريا (المواد القائمة). محاذاة يدويا بتركيب أول صورة ثابتة على البضائع مخطاط التموج واختيار نقاط والبضائع الذي يتوافق مع مسار معين على يدوياومخطاط التموج. للحصول على أفضل النتائج المحاذاة، استخدام شريحة Z الذي هو في أفضل التركيز على البضائع المعين. ويمكن استخدام عدة شرائح Z.
    3. لكل صورة في Z-كومة (البضائع والسيارات والمحركات 1 2، تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.14) تحديد XY تنسق وسعة كثافة لكل نقاط والفلورسنت باستخدام خوارزمية أنشئت لتناسب 2D Gaussians إلى انتشار وظيفة النقطة التي تمثل مصدر كل نقطة في كل من القنوات الثلاث 16،20،21 (الشكل 2D).
      ملاحظة: للحصول على XY تنسق، مجموعة برمجيات MATLAB عرف بني تسمى "موتور Colocalization" وقد وضعت 16،20، الذي يتضمن خوارزمية جاوس المناسب وضعتها Jaqaman، Danuser وزملاؤه 21-23. حزمة البرامج وتعليمات مفصلة لاستخدامها ويمكن الحصول على الطلب.
    4. لكل واحدة من نقاط والبضائع بشكل فردي التي تم تعيينها على مسارات النقالة أو الثابتة على مخطاط التموج، ر تحديدانه XY الإحداثيات وسعة كثافة من نتائج برنامج "موتور Colocalization" (وصفت هذه الشحنات بشكل فردي في الشكل 2B). استخدام عدة صور Z كومة المكتسبة في الخطوة 4.2.14) لتعيين المزيد من الشحنات التي تم العثور عليها على متن طائرات التنسيق المختلفة.
    5. مقارنة بتنسيق XY الفردية للشحن المعينة لتلك التي حصلت في كل من القنوات السيارات في المقابلة Z شريحة (الشكل 2D). تحديد وتحديد إحداثيات XY السيارات التي تقع ضمن دائرة نصف قطرها 300 نانومتر من البضائع. للبضائع والمحركات التي لها إشارة في نفس المستوى البؤري، واستخدام "موتور Colocalization" مجموعة من البرامج لتحديد نقاط والتي تقع ضمن دائرة نصف قطرها 300 نانومتر.

النتائج

ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن الجهاز ميكروفلويديك تستخدم لزراعة الخلايا العصبية قرن آمون (الشكل 1A، B). ومطلي الخلايا العصبية في خزان 1. حجم و microchannels يمنع نشر أجسام الخلايا (سوما) في حجرة محور عصبي في حين أن طول قنوات يمنع التوقعات شجيري من عبور على طول الط...

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا تمكن ارتباط الاتجاهية حركة الجزيئات الفردية الفلورسنت البضائع تتحرك على أساس أنيبيب مع نوع النسبي وكمية من البروتينات في الخلايا العصبية الحركية المرتبطة الحية. سابقا، كان يعاير إجمالي تكوين المحرك البضائع حويصلي محور عصبي على السك...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman, and Daniel Whisler for assistance with the adaptation and development of the software to quantitate cargo mapping analyses, and Emily Niederst for help in making the microfluidic devices. This work was supported in part by NIH-NIA grant AG032180 to L.S.B.G., and the Howard Hughes Medical Institute. L.S. was supported in part by a NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806, S.E.E. was supported by a Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216, and by a grant from The Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award, G.E.C was supported by an NIH/NCATS 1 TL1 award TR001114 and by the Achievement Rewards for College Scientists foundation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
poly-L-lysineSigmaP5899-20mg
D-MEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) High Glucose, w/ L-Glutamine, w/o Sodium Pyruvate (1x)Life Technologies11965092
FBS (Fetal Bovine Serum)Life Technologies10082147
Neurobasal-A Medium (1x)Life Technologies10888022
B-27 Serum Free SupplementLife Technologies10888022
GlutaMAX I Supplement (100x)Life Technologies35050061
HBSS (1x) (Hank’s Balanced Salt Solution)Life Technologies24020117
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, no Magnesium, no Calcium (1x)Life Technologies14190250
Penicillin/Streptomycin (100x)Life Technologies15140122
Corning cellgro Water for Cell Culture Fisher ScientificMT46000CM
PapainUSB Corporation19925
DL-cysteine HClSigma-AldrichC9768
BSA (bovine serum albumin)Sigma-AldrichA7906
D-glucoseSigma-AldrichG6152
DNAse I grade IIRoche Applied Sciences10104159001
Lipofectamine 2000Life Technologies 11668027
Formaldehyde Solution 16% EM GradeFisher Scientific50980487Caution: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to eyes, respiratory system and skin. Dispose according to official regulations.
SucroseFisher ScientificS5-500
HEPESSigmaH-3375
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research017-000-0121
BSA fatty acid and IgG freeJackson Immuno Research001-000-162
AcetoneFisher ScientificBP2403-4
EthanolFisher ScientificBP2818-100
ProLong Gold antifade reagentLife TechnologiesP36934
Cover Glass 1 1/2. 24 x 40 mmCorning2980-244
Axis microfluidic device, 450 µmMilliporeAX450
Adobe PhotoshopAdobe
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon
Coolsnap HQ camera Roper Scientific
60 mm cell culture dishFisher Scientific12-565-95
150 mm cell culture dishFisher Scientific12-565-100
Antibodies Used:
Anti-Kinesin light chain, V-17Santa Cruz sc-13362specificity verified using KLC1-/- neurons (Ref. 16), recommended dilution 1:100.
Anti Dynein Heavy Chain 1, R-325Santa Cruz sc-9115specificity verified using shRNA against DYN1HC1 (Ref. 16), recommended dilution 1:100
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG AntibodyLife TechnologiesA10042 recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA31573 recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody IgG AntibodyLife TechnologiesA11057 recommended dilution 1:200.
Alexa Fluor 647 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) AntibodyLife TechnologiesA21447 recommended dilution 1:200.
Plugins and Macros
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ Kymograph Pluginhttp://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.

References

  1. Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279, 519-526 (1998).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68, 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 682-696 (2009).
  5. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Curr. Biol. 14, 525-537 (2004).
  6. Bryantseva, S. A., Zhapparova, O. N. Bidirectional transport of organelles: unity and struggle of opposing motors. Cell. Biol. Int. 36, 1-6 (2011).
  7. Gross, S. P. Hither and yon: a review of bi-directional microtubule-based transport. Phys. Biol. 1, 1-11 (2004).
  8. Gross, S. P., et al. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell. Biol. 156, 855-865 (2002).
  9. Gross, S. P., Welte, M. A., Block, S. M., Wieschaus, E. F. Coordination of opposite-polarity microtubule motors. J. Cell. Biol. 156, 715-724 (2002).
  10. Kural, C., et al. Kinesin and dynein move a peroxisome in vivo: a tug-of-war or coordinated movement. Science. 308, 1469-1472 (2005).
  11. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M., Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. Mol. Biol. Cell. 17, 2057-2068 (2006).
  12. Shubeita, G. T., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
  13. Soppina, V., Rai, A. K., Ramaiya, A. J., Barak, P., Mallik, R. Tug-of-war between dissimilar teams of microtubule motors regulates transport and fission of endosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 19381-19386 (2009).
  14. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nat Rev. Mol. Cell. Biol. 10, 765-777 (2009).
  15. Hendricks, A. G., et al. Motor Coordination via a Tug-of-War Mechanism Drives Bidirectional Vesicle Transport. Current Biol. 20, 697-702 (2010).
  16. Encalada, S. E., Szpankowski, L., Xia, C. -. h., Goldstein, L. S. B. Stable kinesin and dynein assemblies drive the axonal transport of mammalian prion protein vesicles. Cell. 144, 551-565 (2011).
  17. Harris, J., et al. Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. 9 (410), (2007).
  18. Harris, J., et al. Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons. J Vis. Exp. 7 (261), (2007).
  19. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat. Methods. 2, 599-605 (2005).
  20. Szpankowski, L., Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Subpixel colocalization reveals amyloid precursor protein-dependent kinesin-1 and dynein association with axonal vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 8582-8587 (2012).
  21. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat. Methods. 5, 695-702 (2008).
  22. Thomann, D., Dorn, J., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag localization II: Improvement in super-resolution by relative tracking. J. Microsc. 211, 230-248 (2003).
  23. Thomann, D., Rines, D. R., Sorger, P. K., Danuser, G. Automatic fluorescent tag detection in 3D with super-resolution: application to the analysis of chromosome movement. J. Microsc. 208, 49-64 (2002).
  24. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  25. Nunez, J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J. Vis. Exp. 29 (19), (2008).
  26. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  27. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  29. Moore, D. S., McCabe, G. P. . Introduction to the Practice of Statistics. , (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

92

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved