JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Centrosomes هي عضيات صغيرة ولكنها مهمة التي تشكل أقطاب الإنقسامية المغزل للحفاظ على سلامة الجينوم أو التجمع أهداب الأساسي لتسهيل مهام الحسية في الخلايا. يجوز تنظيم مستوى بروتين مختلف في centrosomes من في مواقع .cellular أخرى، والاختلاف في مستوى centrosomal من عدة بروتينات في نقاط مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم السليم التجمع مريكز. قمنا بتطوير مضان الكمي المجهري الفحص الذي يقيس التغيرات النسبية في مستوى البروتين في centrosomes في الخلايا الثابتة من عينات مختلفة، مثل في مراحل مختلفة من دورة الخلية أو بعد العلاج مع مختلف الكواشف. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة، وتطبيع أن قياس ضد نفسه للبروتين آخر لا تختلف تحت ج التجريبية المختارةondition. استخدام هذا الاختبار في تركيبة مع نبض BrdU واستراتيجية مطاردة لدراسة دورات خلية رابط الجأش، لدينا التحقق من صحة كميا الملاحظة الأخيرة في أن ينظم التجمع centrosomal من VDAC3 في centrosomes خلال دورة الخلية، من المحتمل بسبب تدهور بوساطة proteasome وتحديدا في centrosomes.

Introduction

تتكون Centrosomes من زوج من centrioles محاطة المواد محيط بالمريكز (PCM). يجري المراكز الرئيسية أنيبيب المنظمة (MTOCs) في خلايا الثدييات، centrosomes بمثابة قطبي مغزل الإنقسامية في تقسيم الخلايا، وبالتالي تساعد على الحفاظ على سلامة الجينوم 1. في الخلايا هادئة (على سبيل المثال، خلال مرحلة G0)، واحد من اثنين من centrioles من الجسيم المركزي، وهي مريكز الأم، وتحويلها إلى هيئة القاعدية لتجميع هدب الابتدائي، عضية الحسية جاحظ الخروج من سطح الخلية 2. مرة واحدة الخلايا إعادة إدخال دورة الخلية، ويتم تفكيكها أهداب الابتدائي وكل مريكز يوجه التجمع من طليعة المريكز في نهايته القريبة أن يستطيل تدريجيا لتشكيل مريكز ناضجة 3. في بداية S-المرحلة، يتم تشكيل بنية تشبه عجلة العربة التي توفر التماثل 9 أضعاف إلى مريكز على سطح كل مريكز القائمة وسوف تصبح قاعدة كل طليعة المريكز. Sas6 رقبعة أمر لا غنى عنه ليتم تجنيده التجمع مريكز لتشكيل محور عجلة العربة 4-6. ثم يتم تجميع البروتينات مريكزي أخرى على عجلة العربة في درجة عالية من التنظيم، الأقرب إلى الطريقة البعيدة 7. بعد الانتهاء بالضبط الازدواجية مريكز، وخلايا تجميع المواد محيط بالمريكز إضافية لبناء اثنين centrosomes وظيفية بحلول نهاية المرحلة G2 8. وبالإضافة إلى المكونات الأساسية مريكزي 9-11، والعديد من البروتينات الأخرى بما في ذلك تحركات، الفسفاتازات، مرافقين، مكونات سقالة، غشاء البروتينات المرتبطة بها والآلات تدهور ترتبط مع centrioles والهيئات القاعدية وPCM في أوقات مختلفة من دورة الخلية 12-16. ويلاحظ في كثير من الأحيان أن مستويات centrosomal من العديد من البروتينات تنظم زمنيا من قبل آليات الاستهداف centrosomal و / أو تدهور proteasomal في centrosomes. الأهم من ذلك أن التقلبات في مستوى centrosomal من عدة بروتينات مثل Plk4، Mps1، Sas6، وCP110 لنقاط ر مختلفة من دورة الخلية ويبدو أن تكون حاسمة لتنظيم التجمع مريكز 5،17-22، وفي حالة Mps1 منع هذا التدهور centrosomal يؤدي إلى تشكيل centrioles الزائدة 19. من ناحية أخرى، فإن الكسور centrosomal من عدة بروتينات أقل عطوب بالمقارنة مع حمامات عصاري خلوي. على سبيل المثال سيرنا بوساطة أسفل تنظيم Centrin 2 (Cetn2) أدى إلى سوى انخفاض معتدل من مستوى البروتين في centrioles على الرغم من انخفاض كبير في مستوياته خلية كاملة 23. ولذا فمن الأهمية بمكان لقياس التغيرات في مستوى البروتينات centrosomal في الجسيم المركزي بدلا من قياس مستويات البروتين خلية كاملة عند تقييم وظائف الجسيم المركزي الخاصة بهم.

في هذه الدراسة قمنا بتطوير فحص باستخدام المناعي غير المباشر (معهد التمويل الدولي) لتحديد المستوى النسبي للبروتين في centrosomes. تم تطوير هذا الفحص بشكل خاص لتحليل الخلايا التي هي من عينات مختلفةوبالتالي لا يمكن تصويرها في نفس الوقت. ويمكن لهذه العينات أن تكون الخلايا التي تم التعامل مع الكواشف المختلفة (أي المخدرات مقابل السيطرة)، التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة (أي نبض مقابل مطاردة)، أو هي في مراحل مختلفة من دورة الخلية. مبدأ هذا الاختبار يكمن في قياس الخلفية تصحيح كثافة الفلورسنت المقابلة لبروتين في منطقة صغيرة وتطبيع تلك القيمة ضد نفسه للبروتين آخر والتي لا تختلف في ظل الظروف التجريبية اختيار المستويات. وقد استخدمت العديد من الدراسات في علم الأحياء الجسيم المركزي مؤخرا مختلف تقنيات المجهر الكمية، في كل الخلايا الحية أو الثابتة، لتحديد وظيفة الجسيم المركزي محددة من البروتينات مرشح 24-27. مماثلة لتلك المقايسات، والتقنية الحالية أيضا يقيس الخلفية تصحيح كثافة مضان من البروتين الاختبار. ومع ذلك، فإن إدراج تطبيع باستخدام معيار الداخلي في هذا الاختبار من المرجح تقديم أكبردقة وثقة في تحليل عينتين المختلفة التي هي على اثنين من coverslips مختلفة. وعلاوة على ذلك، بالإضافة إلى فحص مستوى البروتين في centrosomes، مع تعديلات طفيفة هذه الطريقة يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية أو في مواقع الخلوية الأخرى.

هنا، ونحن لدينا الجمع بين الكمي المجهري الفحص مع استراتيجية نبض مطاردة BrdU لمقارنة الخلايا من مختلف مراحل دورة الخلية. بدلا من استخدام التقنيات القياسية اعتقال دورة الخلية وإطلاق لدراسة مختلف نقاط زمنية دورة الخلية، وخلايا المتزايد بشكل غير متزامن يتم تحضين مع BrdU لتسمية الخلايا في S-المرحلة، ومطاردة الخلايا المسمى لأوقات مختلفة (عادة 4-6 ساعة). ومعظم الخلايا المسمى يكون في S-المرحلة مباشرة بعد النبض. يتم اختيار طول مطاردة وذلك بعد مطاردة، الخلايا المسمى سيكون في أواخر S، G2، أو الانقسام، والتي يمكن التحقق منها من قبل الخصائص المورفولوجية مثل هذا الموقف الفلك من centrosomes فيما يتعلق مجلس التوحيد الوطنىليو، وبعد المسافة بين centrosomes، والتكثيف من الكروموسومات الخ وهكذا، وطول مطاردة يعتمد على متوسط ​​مدة S، M G2 ومرحلة من نوع خلية معينة. منذ هذا النهج يتجنب مثبطات دورة الخلية مثل هيدروكسي يوريا، aphidicolin، نوكودازول، وما إلى ذلك، يتيح تحليل دورة الخلية أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.

وبالتالي، علينا أن نظهر هنا أن الكمية الفحص المجهري مضان وحدها، أو بالاشتراك مع BrdU نبض مطاردة الفحص، هي تقنية بسيطة لكنها قوية لقياس بدقة التغيرات النسبية في مستوى centrosomal من بروتين مرشح خلال دورة الخلية رابط الجأش. قمنا بقياس مستوى centrosomal من VDAC3، وهو البروتين الذي حددنا مؤخرا في centrosomes بالإضافة إلى الميتوكوندريا 16،28، وذلك باستخدام هذه المقايسات. النتائج التي تم الحصول عليها هنا تحقق من ملاحظتنا السابقة أن تجمع centrosomal من VDAC3 ينظمه تدهور، وتختلف أيضا في dependen دورة الخليةر بطريقة 16 والتأكد من صحتها وعلاوة على ذلك إمكانية تطبيق هذا الأسلوب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. استخدام التيلوميراز البشري الناسخ العكسي (hTERT) الصباغ الشبكية الخلايا الظهارية خلد (hTERT-RPE1، المشار إليها هنا كما RPE1).
    ملاحظة: خلايا RPE1 هي شبه مضاعفا الخلايا البشرية، غير حولت التي تستخدم عادة لدراسة التجمع المركزيه وتكون الأهداب. هذه الخلايا تتبع دورة الازدواجية مريكز طبيعية منسقة مع دورة الخلية الخاضعة للتنظيم.
  2. مرور على شبه متموجة 100 مم طبق ثقافة خلية من خلايا RPE1 في 1: 5 التخفيف من الثقافة الأصلية إلى الطازج 100 ملم طبق تحتوي على 10 مل من بورصة دبي للطاقة / F-12 (1: 1) متوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل G و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (ويشار المتوسطة كاملة كما DME / F-12 متوسطة). زراعة خلايا في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2.
    1. احتضان 12 مم coverslips الزجاج مستديرة في 50 مل من حمض الهيدروكلوريك N 1 في كوب من الزجاج مغطى، O / N دون أن تهتز، في 60 درجة مئوية في حمام مائي أو الحاضنة.
    2. AFثالثا التخلص من محلول حمض، وغسل لل coverslips ثلاث مرات في 100 مل من الماء المقطر التي يحتضنها لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في بعض الأحيان. تكرار غسل بالمثل في 70٪ من الإيثانول و 95٪ من الإيثانول.
    3. تجفيف coverslips عن طريق نشر بشكل فردي بها على ورقة النشاف مختبر في خزانة السلامة البيولوجية، تليها التعقيم مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة.
  3. ضع 2-4 coverslips الجافة في 35 مم طبق ثقافة الخلية. تمييع الحل فبرونيكتين أو فبرونيكتين مثل البوليمر هندسة (تركيز المخزون من 1 ملغ / مل) إلى تركيز 25 ميكروغرام / مل في زراعة الخلايا PBS.
    1. ضع 80-100 ميكرولتر من محلول مخفف على كل ساترة واحتضان لمدة 60 دقيقة لمعطف الجانب العلوي من ساترة. غسل لل coverslips ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني قبل إضافة المتوسطة كاملة.

2. خلايا تزايد وعلاج الخلايا مع proteasome ومثبطات

  1. مرور 2 × 10 5 تنمو بشكل غير متزامنخلايا جي RPE1 في كل 35 ملم صحن يحتوي على coverslips وتنمو الخلايا في 2 مل المتوسطة كاملة. استبدال مستنبت كل 24 ساعة مع قبل تحسنت الطازجة المتوسطة كاملة.
    1. لتحليل تأثير proteasome وتثبيط على مستوى centrosomal من البروتين اختبار (هنا VDAC3 أو γ تويولين)، وتنمو الخلايا في اثنين من 35 ملم أطباق لمدة 44 ساعة. استبدال الثقافة المتوسطة مع المتوسطة كاملة وإما إضافة أو MG115 DMSO مثل المذيبات تحكم في تركيز النهائي من 5 ميكرومتر أو 0.05٪ على التوالي. في نفس الوقت، إضافة BrdU إلى الخلايا في تركيز النهائي من 40 ميكرومتر واحتضان الخلايا لمدة 4 ساعات.
    2. نقل كل ساترة في 24 لوحة جيدا. إضافة الميثانول 500 ميكرولتر المبردة إلى كل بئر واحتضان لوحة عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإصلاح الخلايا على لل coverslips. يغسل فورا لل coverslips ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر غسل العازلة (1X PBS تحتوي على 0.5 ملي MgCl 2 و 0.05٪ تريتون X-100).
  2. حصاد المتبقيةالخلايا من الطبق 35 مم وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق. استخدام بيليه خلية لتحليل البروتين الكلي من قبل النشاف الغربي (الخطوة 6).

3. BrdU نبض وتشيس الفحص لتحليل مستويات البروتين في مختلف مراحل دورة الخلية

  1. لتحليل التباين في مستوى بروتين (هنا VDAC3، Sas6 أو Cep135) في centrosomes في مراحل مختلفة من دورة الخلية، وتنمو الخلايا في اثنين من 35 ملم الأطباق التي تحتوي على coverslips لمدة 44 ساعة. استبدال الثقافة المتوسطة مع المتوسطة كاملة تحتوي على 40 BrdU ميكرومتر واحتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في حاضنة الثقافة الخلية.
  2. من طبق واحد، ونقل لل coverslips إلى لوحة 24-جيدا لإصلاح الخلايا باستخدام الميثانول المبردة كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
  3. بعد 4 ساعات BrdU النبض، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على BrdU، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة مع المتوسطة كاملة، إضافة متوسطة جديدة، ومن ثم تنمو الخلايا في غياب BrdU لأوقات مختلفة (عادة ساعة أخرى 4لخلايا RPE1) قبل تحديد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.1.2.
    ملاحظة: للحصول على خلايا RPE1، والغالبية العظمى من الخلايا BrdU إيجابي هي في أواخر S أو G2-المرحلة بعد مطاردة 4 ساعة. وهذا يجب أن يتم تحديدها بشكل مستقل لكل نوع من الخلايا.

4. المناعية

  1. احتضان الخلايا الثابتة coverslips على في 200 ميكرولتر العازلة حظر (2٪ BSA و 0.1٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 30 دقيقة.
    1. احتضان الخلايا مع مزيج من الأجسام المضادة الأولية (عادة أثار واحدة في أرنب ورفع آخر في الماوس) المخفف في عرقلة العازلة O / N عند 4 درجات مئوية في غرفة ترطيب.
    2. لجعل غرفة ترطيب، ووضع منشفة ورقية مبللة في النصف السفلي من 1،000 ميكرولتر فارغة مربع ماصة. وضع شريط من بارافيلم على سطح الرف، وبقعة قطرات (15-20 ميكرولتر) من الحل الأجسام المضادة على بارافيلم لكل ساترة لتكون المحتضنة. عكس ساترة على قطرات من محلول الأجسام المضادة (بحيث تغمر خلايا) وعلى مقربةغطاء مربع تلميح.
    3. عكس coverslips مرة أخرى والعودة إليها مرة أخرى إلى الطبق 24 بئرا. غسل coverslips ثم احتضان لهم في 150 ميكرولتر مزيج الأجسام المضادة الثانوية (هنا الأخضر الفلورسنت صبغ مترافق المضادة للأرنب وصبغ أحمر فلوري مترافق المضادة للماوس المخفف في عرقلة العازلة) لمدة 1 ساعة على RT. غسل لل coverslips ثلاث مرات.
      ملاحظة: إن الأجسام المضادة الثانوية-fluorophore مترافق خفيفة حساسة. حماية العينات من الضوء خلال الخطوات 4.1.3-5.1.2.
  2. الاستعداد لتلطيخ مكافحة BrdU عن طريق تحديد الخلايا RPE1 الملون مرة أخرى مع 500 ميكرولتر الميثانول المبردة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، كما هو موضح في الخطوة 2.1.2. غسل لل coverslips ثلاث مرات.
    ملاحظة: هذا التثبيت يؤمن وضع العلامات الأجسام المضادة الأولية والثانوية من البروتين (ق) من الفائدة خلال عملية التحلل الحمضي في الخطوة التالية.
    1. احتضان الخلايا في 200 ميكرولتر من 2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 دقيقة في RT. تحييد مع 300 ميكرولتر من 1 M تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 8 لد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام غسل العازلة.
    2. منع الخلايا مرة أخرى باستخدام 200 ميكرولتر العازلة حظر لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمكافحة الفئران BrdU (المخفف في عرقلة العازلة) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة ترطيب. العودة لل coverslips إلى الطبق 24-جيدا، وغسلها ثم احتضان مع صبغ مترافق مكافحة الفئران الضد الثانوية زرقاء فلوري (مخففة في 150 ميكرولتر العازلة حظر في صحن 24-جيدا لمدة 1 ساعة على RT.
  3. غسل لل coverslips ثلاث مرات. بقعة قطرة (حوالي 3-6 ميكرولتر) من الحل المتصاعدة التي تحتوي على antifade كاشف على شريحة المجهر والزجاج. عكس ساترة، مع الجانب الخلية أسفل، على حل المتصاعدة. مسح السائل الزائد عن طريق الضغط بلطف ساترة ضد الشريحة باستخدام الأنسجة التنظيف الناعمة. تطبيق طلاء الأظافر الشفاف على طول حافة ساترة لختم وضعها على شريحة المجهر.

5. المناعي صورة Acquisition وتحليل

  1. استخدام هدفا الغمر النفط 100X خطة آبو (مع 1.4 الفتحة العددية) للحصول على الصور من خلايا RPE1-BrdU إيجابي عند درجة حرارة الغرفة.
    1. وضع الشريحة على المجهر (انظر المعدات) المرفقة مع الكاميرا قادرة على التصوير الرقمي. لكل fluorophore، وتحديد زمن التعرض المناسب (عادة بين 300-1،000 ميللي ثانية) عن طريق فحص جميع العينات من تجربة يدويا. قبل الحصول على الصور من خلية، وتحديد رأس المناسب والمستوى البؤري أسفل على طول المحور Z (عادة 0.2 ميكرون خطوة حجم) يدويا. الحصول على صور من العينات المختلفة التي هي coverslips على منفصلة باستخدام متطابقة زمن التعرض للfluorophores مختلفة على طول المحور Z باستخدام حزمة برامج التصوير المجهري الرقمية.
  2. أداء إزالة التفاف (في هذه الحالات باستخدام خوارزمية لا الجار) من جميع مداخن صورة استحوذت على طول Z-المحور.
    1. الحصول على الإسقاط كثافة الكلي للكل صورة كومة على طولوZ-المحور.
  3. في الخلايا حيث centrosomes قريبة (المسافة بين اثنين من centrosomes أقل من 2 ميكرون)، رسم مربع صغير (عادة 20-30 بكسل لكل جانب) حول كل centrosomes وبمناسبة المنطقة المحددة.
    1. رسم مربع أكبر (عادة 24-35 بكسل لكل جانب) المحيطة المربع الأول ووضع علامة المساحة المحددة للمربع كبير.
    2. الحصول على منطقة (A) وكثافة مضان الإجمالية (F) من كل fluorophore في كل مربع (S يدل على مربع صغير وL يدل على المربع الكبير).
    3. تحليل الخلفية تصحيح كثافة مضان من كل fluorophore باستخدام الصيغة التي وصفها هاول وآخرون 29: F = F S - [(F L - F S) × A S / (A L - A S)].
    4. الحصول على كثافة مضان تطبيع للبروتين من الفائدة (هنا VDAC3 أو Sas6) عن طريق حساب نسبة كثافة مضان لتصحيح خلفية فلوريدا لهاuorophore إلى أن من fluorophore المستخدمة في معيار اختيار الداخلي (هنا γ تويولين، Sas6 أو Cep135).
  4. في حالة تحليل الخلايا حيث يتم فصل centrosomes جيدا (المسافة بين اثنين من centrosomes أكبر من 2 ميكرون)، وتحليل كل الجسيم المركزي بشكل منفصل عن طريق رسم مجموعتين منفصلتين من الصناديق. رسم مربع صغير (عادة 15-25 بكسل لكل جانب) حول كل الجسيم المركزي وبمناسبة المنطقة المحددة. رسم مربع أكبر (20-30 بكسل لكل جانب) المحيطة المربع الأول وبمناسبة المنطقة المحددة.
    1. الحصول على منطقة (A) وكثافة مضان الإجمالية (F) من كل fluorophore في كل مربع، وحساب الخلفية تصحيح كثافة مضان من كل fluorophore، بشكل منفصل لكل الجسيم المركزي، كما هو موضح في الخطوة 5.3.3.
    2. الجمع بين الخلفية تصحيح كثافة مضان من كل من البروتين من centrosomes اثنين للحصول على المستوى الإجمالي centrosomal من أن البروتين في تلك الخلية.
    3. الحصول علىكثافة تطبيع للبروتين من الفائدة عن طريق حساب نسبة من إجمالي شدته centrosomal إلى إجمالي كثافة centrosomal من المعيار الداخلي.
  5. تحليل 15-25 على الأقل خلايا لكل حالة تجريبية ورسم على الرسم البياني في جدول بيانات.

6. تحليل البروتين الكلي عن طريق الغربية التنشيف

  1. resuspend الخلايا في الترسيب المناعي الشعاعي فحص (RIPA) العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ Nonidet P-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)، واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد لليز الخلايا.
    1. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة، فصل المحللة من جزء بيليه وقياس تركيز البروتين الكلي لكل المحللة باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) طقم الفحص.
  2. خلط 40 ميكروغرام من المحللة مع 4X SDS-PAGE العازلة تحميل (50 ملي تريس، الكلور، ودرجة الحموضة 6.8، 2٪ SDS، الجلسرين 10٪، و 100 ملي Dithiothreitol، 0.1٪ بروميتش البيونophenol الأزرق).
    1. غلي العينات لمدة 10 دقيقة وتشغيل العينات على 12.5٪ تغيير طبيعة SDS-PAGE في الجهد المستمر من 200 V.
  3. نقل البروتينات فصل على SDS-PAGE على غشاء النيتروسليلوز باستخدام تقنية النشاف الغربية (في الجهد المستمر من 90 V لمدة 1 ساعة في البرد).
    1. منع الغشاء مع 3٪ الحليب الخالي من الدسم في برنامج تلفزيوني 1X، ثم احتضان الغشاء مع حلول الأجسام المضادة الأولية مخففة (في هذه الحالة أرنب مكافحة VDAC3، أرنب مكافحة γ تويولين والفأر مكافحة α تويولين) لمدة 1 ساعة على RT.
    2. بعد غسل غشاء ثلاث مرات (كل حضانة 5 دقائق تحت الهز) باستخدام PBS-T عازلة (1X PBS و 0.2٪ توين-20)، واحتضان الغشاء في خليط من القريب من الأشعة تحت الحمراء (IR) صبغة الفلورسنت مترافق المضادة للأرنب و صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء الأجسام المضادة مترافق المضادة للماوس الثانوية (المخفف في PBS-T) لمدة 1 ساعة.
    3. يغسل الغشاء ثلاث مرات ثم مسح الغشاء لتحليل العصابات باستخدام الأشعة تحت الحمراء ونظام التصوير luorescence مناسبة للكشف عن طخة مناعية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

حددت لدينا دراسات حديثة توطين centrosomal الرواية وظيفة VDAC3، واحدة من porins الميتوكوندريا 16،28. أظهر المناعية من عدة خلايا الثدييات بما في ذلك الخلايا RPE1 باستخدام الأجسام المضادة VDAC3 محددة تلطيخ centrosomal بارز وضعيفة نسبيا تلطيخ الميتوكوندريا. أظهرنا أيضا أن VDAC3 centrosomal يرت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المجهر الكمي في بيولوجيا الخلية ويرتبط عادة مع فحوصات التصوير الخلية الحية، مثل نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق)، الإسفار الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP)، وما إلى ذلك، هناك أمثلة متزايد من علماء الأحياء الخلايا نامية مختلفة المقايسات المجهري الكمية لثابت الخلايا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
FibronectinSigmaF8141Stock of 1 mg/ml in water
DMSOSigmaD2650
MG115SigmaSCP0005Stock of 10 mM in DMSO
BrdUSigmaB5002Stock of 10 mM in DMSO
Anti-γ-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)SigmaT 65571:200 in IIF blocking buffer 
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) Aviva Systems BiologyARP35180-P0501:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal) Santa cruz biotechnologysc-814311:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)Abcamab-750051:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal) Abcamab63261:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)Life technologiesA210931:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212021:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212031:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212061:1,000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife technologiesA212071:1,000 in IIF blocking buffer
Anti-γ-tubulin (rabbit polyclonal)SigmaT51921:1,000 in WB blocking buffer
Anti-α-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)SigmaT90261:20,000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Life technologiesA100431:10,000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW ConjugatedRockland antibodies610-731-0021:10,000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent Life technologiesS36936Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1Fisherbrand12-545-80
Olympus IX-81 microscopeOlympus
Retiga ExiFAST 1394 IR cameraQImaging 32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objectiveOlympus1.4 numerical aperture
Slidebook software packageIntelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging SystemLi-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assayThermo Scientific23227
U-MNU2 Narrow UV cubeOlympusU-M622Filter
U-MNU2 Narrow Blue cubeOlympusU-M643Filter
U-MNU2 Narrow Green cubeOlympusU-M663Filter

References

  1. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  2. Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
  3. Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
  4. Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
  5. Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
  6. Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
  7. Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9(2011).
  8. Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976(2009).
  9. Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
  10. Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
  11. Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
  12. Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
  13. Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
  14. Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
  15. Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
  16. Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
  17. Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
  18. Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
  19. Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
  20. Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
  21. Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
  22. Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
  23. Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287(2002).
  24. Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291(2011).
  25. Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
  26. Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
  27. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
  28. Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
  29. Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
  30. Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
  31. Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
  32. Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
  33. Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
  34. Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
  35. Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
  36. Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
  37. Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
  38. Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
  39. Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
  40. Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
  41. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
  42. Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

94 centrosomal VDAC3 BrdU

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved