متعددة الفوتون بين الخلايا التصوير الصوديوم جنبا إلى جنب مع بوساطة الأشعة فوق البنفسجية Uncaging البؤري من الغلوتامات في الخلايا العصبية الهرمية CA1

Summary

وصفنا الجمع بين البؤري الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية الصور تفعيل مركبات العصبية نشطة مع خلية كاملة التصحيح، المشبك والتصوير متعدد الفوتون من العابرين الصوديوم داخل الخلايا في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية قرن آمون في شرائح الأنسجة الحادة للدماغ الفأر.

Abstract

وقد مكن متعددة الفوتون مضان المجهري تحليل المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية للخلايا الدماغ في أنسجة سليمة مع القرار المكانية والزمانية عالية. جنبا إلى جنب مع الكهربية، ويستخدم على نطاق واسع لدراسة اشارات الكالسيوم المتعلقة النشاط في مقصورات التحت خلوية صغيرة مثل التشعبات والعمود الفقري شجيري. بالإضافة إلى العابرين الكالسيوم، النشاط متشابك يدفع أيضا إشارات الصوديوم بعد المشبكي، خصائص التي تفهم بشكل هامشي فقط. هنا، نحن تصف طريقة لمجتمعة خلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد الفوتون التصوير الصوديوم في المجالات الخلوية الصغيرة من الخلايا العصبية المركزية. وعلاوة على ذلك، ونحن نقدم إجراء تعديل لفوق البنفسجية (UV) uncaging خفيفة الناجم عن الغلوتامات، والذي يسمح موثوق بها وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة. ولهذه الغاية، أجريت تسجيلات خلية كاملة على كورنو آمون تقسيم 1 (CA1) الخلايا العصبية الهرمية في شرائح الأنسجة الحادة للالحصين الماوس. امتلأت الخلايا العصبية مع صبغة الفلورسنت SBFI الحساسة الصوديوم من خلال التصحيح، ماصة، ومتعدد الفوتون الإثارة من SBFI تمكين التصور من التشعبات والعمود الفقري المجاورة. لإنشاء uncaging البؤري الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية، وجرى اختبار العديد من المعلمات بما في ذلك شدة الضوء، وحجم المتضررين من شعاع uncaging الأشعة فوق البنفسجية، وتحديد المواقع من الحزم وكذلك تركيز المركب في قفص والأمثل. نتائجنا تظهر ان نضح المحلي مع الغلوتامات قفص (MNI-الغلوتامات) والتنسيق نتيجة للأشعة فوق البنفسجية uncaging في تيارات الداخل والعابرين الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري. بالطبع الوقت وسعة كل التيارات الداخل وإشارات الصوديوم ترتبط مع مدة نبض uncaging. وعلاوة على ذلك، تظهر نتائجنا أن الإشارات الصوديوم داخل الخلايا يتم حظر بحضور حاصرات مستقبلات الغلوتامات لionotropic، مما يدل على أنهم بوساطة تدفق الصوديوم على الرغم من هذا المسار. باختصار، يوفر طريقة لدينا أداة موثوقة لالتحقيق في إشارات الصوديوم داخل الخلايا الناجم عن تنشيط مستقبلات البؤري في أنسجة المخ سليمة.

Introduction

وقد مكنت التحسينات الأخيرة في التقنيات المجهرية الخفيفة مثل متعدد الفوتون المجهري دراسة المعلمات المورفولوجية والفسيولوجية للخلايا الدماغ في أنسجة سليمة مع القرار المكانية والزمانية عالية. جنبا إلى جنب مع الكهربية، والآن تستخدم على نطاق واسع هذه التقنيات لتحليل الإشارات ذات الصلة النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية وكذلك إشارات الكالسيوم مصاحبة في مقصورات التحت خلوية صغيرة، وبالتحديد في التشعبات الدقيقة والعمود الفقري شجيري. بالإضافة إلى العابرين الكالسيوم، النشاط متشابك يدفع أيضا إشارات الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري، والخصائص التي هي غير مستكشفة إلى حد كبير. ويمكن تحليل هذه الإشارات بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الصوديوم داخل الخلايا ([نا ^+] _ط) والتي تمكن القياس على الخط من [نا ^+] _ط العابرين لفترات طويلة دون تبييض صبغة كبير أو الصور الضرر ^1،2.

للتصوير من [نا ^+] _ط ، ليست سوى عدد قليل من الأصباغ الكيميائية مؤشر المتاحة، مثل كورونا الأخضر أو الأخضر اشانتي الصوديوم ^3،4. التحقيق الفلورسنت الأكثر استخداما لنا ⁺ التصوير هو isophthalate benzofuran (SBFI) ملزم الصوديوم. وهو ratiometric، الأشعة فوق البنفسجية صبغ متحمس مماثل لمعروفة الصبغة الحساسة للالكالسيوم FURA-2، وقد استخدمت لالتقليدي نا ⁺ التصوير في العديد من أنواع الخلايا (على سبيل المثال ^5،6). هناك احتمالات مختلفة من المثير للصباغة وجمع مضان لها. إذا كان مطلوبا قرار زمنية عالية (أي معدل الإطار التصوير عالية) في تركيبة مع المعلومات المكانية، ويمكن SBFI تكون سعيدة مع مصباح زينون قوس أو عالية الطاقة الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) وجهاز الكشف عن الانبعاثات ذات شحنة عالية السرعة -coupled جهاز (CCD) وكاميرا ^7،8. عن القرار المكانية القصوى في عمق الأنسجة، والمسح الضوئي ليزر متعدد الفوتون المجهري هو الأسلوب المفضل ^9. وefficie الكم منخفضة نسبياNCY من SBFI يتطلب تركيزات عالية نسبيا صبغ (0،5-2 ملم)، وتحميل مباشر من شكل غشاء كتيمة من SBFI عبر حادة مسرى مكروي ¹⁰ أو التصحيح ماصة ^1.

باستخدام SBFI أظهر العمل في وقت سابق أجريت في شرائح الأنسجة الحادة للالحصين القوارض العابرين الصوديوم ذات الصلة النشاط في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية CA1 الهرمية التي هي سبب رئيسي من تدفق الصوديوم من خلال ionotropic NMDA مستقبلات ^1،2. لدراسة خصائص هذه الإشارات الصوديوم المحلية في مزيد من التفاصيل، وتفعيل محدد من المستقبلات بعد المشبكي بتطبيق منبهات مستقبلات هي طريقة مناسبة تماما في الاختيار. لتقليد النشاط قبل المشبكي وإطلاق الإرسال، يجب أن يكون تطبيق وجيزة نسبيا، وركز لتمكين التحفيز المحلي. هذا، ومع ذلك، يبرهن على أن تكون صعبة جدا في أنسجة سليمة. تطبيق الضغط المحلي للمنبهات مستقبلات باستخدام ماصة ذات الرؤوس غرامة تمكن ا ف ب البؤري جداالثني، ولكن يستضيف المخاطر المحتملة لإنتاج حركة هيكل الفائدة (على سبيل المثال مثل التغصنات أو العمود الفقري شجيري)، وبالتالي يعيق التصوير ذات الدقة العالية. مدى ملاءمة الرحلان الشاردي للمواد العصبية نشطة تعتمد على خصائصها الكهربائية وسعة الحالية المرتفعة قد تنتج القطع الأثرية الخلوية أيضا.

طريقة واحدة للتغلب على هذه العقبات هي توظيف المركبات تنشيط التحلل الضوئي للصور وفلاش بهم. أساسا، وتستخدم اثنين من مبادئ مختلفة عن الصور تفعيل المواد قفص: I) حقل واسع التحلل الضوئي فلاش ¹¹ والثاني) uncaging البؤري توظيف وحدات المسح في تركيبة مع الليزر ^12. في حين يستخدم واسعة المجال التحلل الضوئي فلاش لتنشيط مناطق أكبر من الفائدة، مثل خلية بأكملها، ويعمل uncaging البؤري لتحفيز تحديدا مقصورات الخلوية الصغيرة. في هذه الدراسة نظهر إجراء لخلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد صالتصوير الصوديوم hoton في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية المركزية، جنبا إلى جنب مع إجراء تعديل لالناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ضوء uncaging الغلوتامات، والذي يسمح موثوق بها وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة.

Protocol

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية لهاينريش هاينه جامعة دوسلدورف، ألمانيا، فضلا عن توجيه مجلس الجماعة الأوروبية (86/609 / EEC). وقد أبلغت جميع التجارب لوالموافقة عليها من قبل مكتب رعاية الحيوان في مرفق رعاية الحيوان واستخدام هاينريش هاينه جامعة دوسلدورف، ألمانيا (عدد الفعل المؤسسي: O52 / 05). وفقا لقانون رعاية الحيوان الألمانية (Tierschutzgesetz، المادتين 4 و 7)، لم ترد أي موافقة رسمية إضافية لإزالة أنسجة المخ بعد الوفاة من الضرورية.

لتوليد شرائح الحادة، تم مخدرة الفئران مع CO ₂ و بسرعة مقطوعة الرأس (بناء على توصية من المفوضية الأوروبية نشرت في: القتل الرحيم للحيوانات التجارب، لوكسمبورغ: مكتب المنشورات الرسمية للجماعات الأوروبية، 1997، ISBN 92-827-9694 -9).

1. إعدادحلول

1. تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) للتشريح تحتوي على (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 0.5 CaCl ₂ و 6 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26 NaHCO _3، و 20 الجلوكوز، فقاعات مع 95٪ O ₂ و 5٪ CO _2، مما أدى إلى درجة الحموضة من 7.4.
2. إعداد ACSF للتجارب التي تحتوي على (مم): 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2 CaCl _2، 1 MgCl _2، 1.25 ناه ₂ ص _4، 26 NaHCO _3، و 20 الجلوكوز، فقاعات مع 95٪ O ₂ و 5٪ CO2، مما أدى في الرقم الهيدروجيني من 7.4.
3. إعداد الحل داخل الخلايا (ICS) يحتوي على (مم): 150 KMeSO _3، 12.5 هيدروكسي إيثيل ببيرازين حمض السلفونيك الإيثان (HEPES)، 40 بوكل، 5 كلوريد الصوديوم، 1.25 الاثيلين جلايكول حمض tetraacetic (EGTA)، 5 ملغ-ATP، 0.5 تستحث GTP. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3. مخزن aliquots من 1 مل في -20 درجة مئوية.
4. تمييع isophthalate benzofuran ملزم الصوديوم (SBFI) -salt في الماء المقطر المزدوج وإعداد aliquots من 5 ميكرولترمن محلول المخزون 10 ملي.
5. ICS ذوبان الجليد وإضافة SBFI محلول المخزون في تركيز النهائي من 1 ملم. دوامة والصغرى الترشيح (0.22 ميكرون). الحفاظ على 4 درجات مئوية حتى المستخدمة في التجربة. لا اعادة تجميد وتستخدم فقط ليوم واحد.
6. إعداد محلول المخزون MNI الغلوتامات من 50 ملي عن طريق إذابة المركب في الماء المقطر المزدوج. MNI تمييع الحل الأسهم الغلوتامات إلى تركيز النهائي من 5 ملم في ACSF العادي. الحفاظ على 4 درجات مئوية حتى المستخدمة في التجربة. لا اعادة تجميد وتستخدم فقط ليوم واحد. متجر مأخوذة، التي لا تستخدم مباشرة في التجربة، في -20 درجة مئوية.

2. تشريح الأنسجة

وقد وصفت إعداد شرائح قرن آمون في الدماغ الحادة القوارض بالتفصيل في وقت سابق ^13،14: ملاحظة. باختصار، كان يعمل البروتوكول التالي في هذه الدراسة.

1. بعد قطع الرأس، وإزالة بسرعة الدماغ من الجمجمة.
2. وضع على الفور الدماغ في طبق بتري مع الجليد الباردة ACSF وتشريح تشريح نصف الكرة عن طريق إجراء خفض السهمي على طول خط الوسط.
3. إجراء الخفض الثاني في التوجه على النحو المرغوب فيه سطح الحجب وإرفاق ذلك إلى مرحلة قطع من vibratome مع superglue.
4. تأخذ قطع الغرفة وعنصر التبريد (سواء أبقى في -20 ° C) من vibratome من الثلاجة ومكان القطع المسرح مع قسم الدماغ في الغرفة. ثم وضع عنصر التبريد في الغرفة ويغرق في الأنسجة الجليد الباردة ACSF تشريح. لتحقيق الاستقرار في التحضير، يمكن للمرء أن ترغب في مواجهة كتلة الأنسجة مع هلام أجار.
5. قطع 250 ميكرون سميكة، المجاور للسهمي من شرائح الحصين مع vibratome. التأكد من أن جميع السوائل ACS وفقاعات في جميع الأوقات.
6. بعد التقطيع، والحفاظ على النسيج على شبكة في كوب مع ACSF العادي واحتضان عند 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم الحفاظ على درجة حرارة الغرفة.

3. إعداد الأجهزة

ضمن الصفحات = "دائما">
الرقم يتم إنتاج 1. مخطط يبين مسارات الضوء والتحكم التجريبية من منصة تتألف من التصوير متعدد الفوتون، ليزر المسح الضوئي للأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي فلاش، والكهربية، ومتعدد الفوتون شعاع (أحمر) من قبل نابض، الانضباطي الأشعة تحت الحمراء (IR) ليزر (تيزا). يمر مفتاح ميكانيكي، خلية Pockels، وكاشف الأشعة تحت الحمراء (الكشف عن كثافة شعاع)، والتي تمكن السيطرة على قوة الليزر ومدة إدارته. يعمل فيها / الوجه خارج يزر ديود اختياري الوجه في لمحاذاة الأساسية لشعاع الليزر. المتوسع شعاع يمكن استخدامها في تركيبة مع أهداف مع طائرة للغاية واسعة العودة التنسيق. والتحكم فيها عن بعد عجلة تصفية ND يمكن استخدام إضافة أو بدلا من الخلية Pockels "للسيطرة على السلطة شعاع الليزر. بعد اجتياز الرأس المسح الضوئي، ويسترشد في IR-نابض الضوء على العينة. تنبعث منهاتيد ضوء مضان (الضوء الأخضر) يتم جمعها سواء من قبل الخارجية أو الداخلية للكشف عن مضخم (فرق إدارة المشاريع PMT). تتم مزامنة أجهزة الكشف عن الخارجية بشكل كامل مع هذه الفرق الداخلية من خلال التبديل عالية التردد (وحدة تحكم PMT). يتم إنتاج شعاع uncaging (الضوء الأزرق) بواسطة ليزر الحالة الصلبة للأشعة فوق البنفسجية (UV-DPSS الليزر). ثم أنها موجهة إلى وحدة المسح يحركها galvo في أعلى الظهر من المكثف برنامج التحصين الموسع ومضان بدليل الضوء. تمكين تحديد المواقع بدقة (انحراف لوني بين التصوير والحزم uncaging) من uncaging بقعة أو منطقة من تصدير صورة من برامج التصوير. يتم التحكم في إدارة توقيت تزامن التصوير، والكهربية، والتحلل الضوئي فلاش إلكترونيا. كاشف تضوء (TL-PMT) هو من الحاجة إلى توثيق المواقع من الماصات داخل الأنسجة. وحدات التحكم والبرمجيات من نظام التصوير الذي تم تعديله، ويستخدم للسيطرة ومزامنة كافة الأجهزة الأخرىاللازمة لتشغيل النظام. مكونات نظام وصفت بأنها "العرف" تم تصميم وبناء / تكييفها من قبل المؤلفين. تم تكييف بعض المكونات لتلبية متطلبات العرف بناء نظام متعدد الفوتون وصفت بأنها "تعديل". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. التبديل على مكونات نظام متعدد الفوتون. اختبار وضبط محاذاة شعاع الليزر تحت الحمراء.
   1. شعاع السيطرة المواقع عن طريق التقليب في موشور تركز بدلا من الهدف. إذا تم خلع شعاع، إعادة ضبط من قبل المرايا في المنظار. لاحظ أن الطائرة تركز من منظور يجب أن يكون في نفس مستوى البؤري الخلفية للهدف في حين التصوير.
   2. التبديل على طيف والتحقق من وجود خصائص متعددة الفوتون للشعاع.
   3. تعيين المعلمات من برامج التصوير إلى القيم التالية: اخترحجم إطار 512 X 512 بكسل للصور محة عامة عن خلية (مربعات أصغر كليب مع عامل التكبير من 2.5 لارتفاع معدل الإطار، والقرار مكانية عالية، على التوالي). ضبط سرعة التصوير لوضع سريع ووضع المسح الضوئي لXYT. يجب أن يكون Z-1 ميكرون خطوة للمداخن نظرة عامة و 0.2 ميكرون لأكوام مفصلة لمطابقة متطلبات أخذ العينات المكانية لأداء deconvolution وقت لاحق.
2. ضبط شعاع الليزر متعددة الفوتون (790 نانومتر) كثافة عن طريق تغيير إعدادات الخلية Pockels "(السلطة النهائية في إطار الهدف: ≈ 14-16 μW) والصور مضاعفات (فرق إدارة المشاريع PMT).
3. تشغيل ومعايرة نظام uncaging عن طريق وضع عينة الشريحة الفلورسنت تحت عدسة الهدف.
   1. باستخدام المنظار، وضبط تركيز الأشعة فوق البنفسجية البصريات ومكانيا لحد من الأشعة فوق البنفسجية بقعة الليزر إلى حجم من 2 ميكرون في القطر كحد أقصى عن طريق استخدام وحدة تركز على رأس المسح UGA.
   2. بدء روتين معايرة uncaging وحدة التحكم سوفتواريه.
      1. تعيين ليزر الأشعة فوق البنفسجية إلى عدة نقاط ضمن مسح مجموعة، في حين يتم التقاط مضان مع كاميرا CCD. بالنقر على بقعة الليزر الأشعة فوق البنفسجية في كل نقطة، وضبط المواقع من المرايا المسح كلفاني لتتوافق مع بعض التنسيق في البرنامج.

الشكل 2. مخطط تفصيلي يوضح خصائص الإثارة، ومسارات الانبعاثات شعاع uncaging. شعاع الأشعة تحت الحمراء الإثارة (أحمر) يمر شعاع الجمع مزدوج اللون مرآة على مستوى لبرج المدون في المكثف برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر والهدف هو الوصول إلى العينة. يتم تسليم شعاع uncaging (الازرق) عن طريق الكوارتز ضوء الألياف البصرية إلى إيزاء وشعاع التركيز الوحدة ثم قاد بعد ذلك إلى ميل المسح الضوئيrrors في وحدة المسح الضوئي، ويمر مرآة مزدوج اللون لشعاع الجمع مزدوج اللون المرآة. هنا يتم دمجها مع شعاع المسح الإثارة. الضوء المنبعث من العينة يتبع مسار مسار الشعاع الضوئي الإثارة في الاتجاه المعاكس نحو الرأس مسح التصوير. يتم استخدام الكاميرا لمراقبة البصرية من ماصة التصحيح والمواقع من شعاع uncaging في تركيبة مع متحد البؤر المجهر المسح الضوئي ليزر (لا يظهر). يمثل مسار الضوء الأخضر اختياري إضاءة برنامج التحصين الموسع ومضان التي قد تكون ذات استخدام مع تطبيقات أخرى.

3. 2. 2. استخدام نظام فلاش التحلل الضوئي في وضع الفور للحصول على التطبيقات المحورية. تأكد من أن التعديل البؤري للشعاع uncaging (متوسط ​​القوة تحت الهدف: 0.55 ميغاواط) النتائج في حجم البقعة من 1.5 ميكرون في القطر (تمديد س ص) كما كشفت في شريحة الفلورسنت المتمركزة على مستوى z المتوافق مع أن من الأنسجةشريحة (لا يظهر).
   3. يتم تحقيق دقة تحديد المواقع من البقعة بواسطة uncaging استيراد صورة من نظام التصوير عبر شبكة اتصال بين أجهزة الكمبيوتر والتصوير uncaging-.
      1. باستخدام البرمجيات الشاشة المختطف، وقراءة مستمرة خارج الأطر للبرامج التصوير (بدلا من تغذية الكاميرا) وضبط إطارات التصوير وuncaging بشكل متطابق. تصدير كل إطار ^ال 10 من برنامج التصوير كصورة إشارة إلى وحدة فلاش لضمان التكيف السليم خلال التجربة بأكملها.

الرقم 3. تعديل بقعة uncaging: لوضع بالضبط بقعة uncaging، لقطة شاشة من برامج التصوير (الإطار الأصفر) يتم استيرادها إلى البرنامج uncaging (اطار الأخضر). والصورة اليسرى داخل الإطار الأصفر يمثل صورة مرحبا، لو مشفرة (الازرق: بكسل الأسود والأحمر: المشبعة بكسل) للخلية CA1 الهرمي بأكملها. ومضافين الصورة عن طريق الشبكة معايرة البرنامج uncaging (الأخضر "X" ق). إلى اليمين، يظهر جزء المكبرة من الخلية التي تحتوي على بقعة uncaging مضافين (الصليب الأحمر). البقعة الصفراء هي صورة مضافين تلقائيا من الحزم uncaging. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. بدوره على micromanipulators، والمكونات الكهربية، وجهاز تطبيق ضغط لتسليم المجمع قفص للمنطقة المستهدفة.
5. تثبيت جهاز تطبيق الضغط البؤري للنضح المحلي من المركبات في قفص. وهذا سوف يقلل التكاليف بشكل كبير بالمقارنة مع حمام نضح من هذه المواد. ضبط الضغط التمسك الضغط الجوي نظرا لمنع السحب من ACSF داخل أو تسرب المواد قفص من ماصة التطبيق.
   ملاحظة: الجهاز تطبيق الضغط يستضيف صمام الصغيرة عالية الدقة وفائق السرعة في حامل ماصة. يتيح هذا لتوظيف الحد الأدنى من ضغوط الطلب ويقلل من حركة القطع الأثرية إلى أدنى حد ممكن خلال نضح المحلي مع مجمع قفص بالتالي.
6. سحب الماصات لخلية كاملة التصحيح، المشبك ونضح المحلي باستخدام الشعيرات الدموية البورسليكات الزجاج المصقول النار. وينبغي أن يكون ماصات قطرها غيض من ~ 1 ميكرون ومقاومة R ≈ 3 MΩ (تحديد القيم مع _K-3 المتوسط ​​المستندة ICS).
7. شريحة مكان في الحمام التجريبية ويضعوا مع شبكة (إطار البلاتين 250 ميكرومتر سميكة، وامتدت مع خيوط الجراحية، OD 40 ميكرون) (الشكل 4A، B). استخدام مقلوب، للكسر غيض، ومصقول النار ماصة باستير (شفط الكرة في جانب الطرف المكسور) لنقل شريحة. تجنب ثني أي تعامل قاس والآخر من شريحة.

الرقم 4. مكونات الحمام التجريبية وتحديد المواقع من الحمام في مرحلة المجهر. (A) ويتكون حمام التجريبي للغرفة حمام نفسها (المربع الأزرق)، والتي تحيط بها حلقة معدنية المغناطيسية. أنابيب يضمن نضح المستمر للحمام مع المالحة (ACSF). يتم وضع الشبكة إلى باستمرار وإصلاح شريحة في غرفة الحمام. (B) الحاد إعداد شريحة وضعه داخل غرفة الحمام. يتم إصلاح شريحة من المواضيع من الشبكة. (C) لتحديد المواقع وهندسة حمام التجريبي في مرحلة المجهر خلال التجارب.

8. وضع الحمام في مرحلة المجهر ودائم يروي شريحة مع ACSF.

4. خلية كاملة التصحيح، لقط

1. تحميل ماصة التصحيح مع ICS تحتوي SBFI وتحميل ماصة نضح المحلية مع مركب قفص. إرفاق الماصات لmicromanipulators المقابلة. وضع الإلكترود المرجعي في الحمام. تأكد من أن ترتكز لك بشكل دائم لتجنب الأضرار التي لحقت مرحلة الرأس (راجع الشكل 4C).
2. خفض كل من الماصات في الحمام ووضعها فوق منطقة الحصين CA1. تطبيق ضغط لطيف على ماصة التصحيح (+40 م بار) لتجنب التخفيف من ICS مع ACSF.
3. تعويض إمكانية إزاحة ماصة التصحيح باستخدام برنامج الكهربية.
4. الاقتراب من خلية هرمي CA1 مع ماصة التصحيح توظيف-IR مدينة دبي للإنترنت الفيديو المجهري. تطبيق الشفط لطيف حتى يتم الحصول على جيجا الختم. اختيار خلية سوما الذي يقع 30 -70 ميكرون تحت سطح شريحة لضمان مورفولوجيا الخلايا سليمة على الجانب من جهة وتشتت منخفضة وتوهين شعاع uncaging على الجانب الآخر.
5. تعويض القدرة السريعة. استراحة membranالإلكترونية والخلايا المفتوحة للحصول على تكوين خلية كاملة.
6. تعويض القدرة بطيئة والمقاومة السلسلة.
7. السماح للخلية أن مدال مع SBFI-ICS لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل البدء في تجارب التصوير.

التصوير 5. متعدد الفوتون والتحفيز

تم تعيين الرقم 5. البروتوكول التجريبي. لتهيئة تجربة، نبض الزناد (المشار إليها بواسطة علامة حمراء (ᴨ) والخط الأحمر) لبدء التصوير في وقت واحد (الأزرق)، والكهربية (الأخضر)، وإدارة محبوس مركب (الصفراء) في وقت نقطة 0 ثانية. خلال هذه الفترة الأولى، شعاع التصوير يجب خافتة تماما (الضوء الأزرق). بعد 4.5 ثانية (خط متقطع)، يتم إنهاء نضح المحلي للمجمع في قفص ويجب تعيين شعاع التصوير لفي العكثافة الملك للحصول على البيانات (الازرق). 1.5 ثانية فيما بعد (الساعة 6 نقطة ثانية)، نبض الزناد الثاني وتعطى (المشار إليها بواسطة علامة حمراء (ᴨ) والخط الأحمر)، الذي تهيئة وحدة فلاش للأشعة فوق البنفسجية (مدة فلاش: 300 ميللي ثانية، يتبين من فلاش الأصفر ) ويضع علامات في الكهربية وبروتوكول التصوير.

1. إضافة سم الأسماك الرباعية الأسنان (TTX، 500 نانومتر) لACSF لمنع تفعيل قنوات الصوديوم الجهد بوابات وتوليد إمكانات العمل.
2. تصور التشكل الخلوي باستخدام متعدد الفوتون الإثارة والناتجة SBFI مضان واختيار التغصنات شائك للتجربة. لتكبير الصور بدقة أعلى ووضع مربع مشبك حول التغصنات.
3. ملء ماصة التصحيح القياسية مع 10 ميكرولتر ACSF تحتوي على الغلوتامات في قفص. ربط ماصة لتطبيق نظام الضغط وإرفاقه مياداة مجهرية.
4. وضع ماصة مع مجمع قفص بالقرب من التغصنات (~ 30 ميكرون). ضع ماصة للسماحنضح المحلي الفعال للالتغصنات في الاختيار. ضبط الليزر uncaging: وضع بقعة uncaging قريبة (~ 1 - 2 ميكرون) إلى بنية الفائدة.
5. مناطق محددة من الفائدة على التغصنات المختار والعمود الفقري المجاورة باستخدام برامج التصوير.
6. الاقتراب من المنطقة من اهتمام والوزراء البريطانى حقن مركب قفص لعدة ثانية مع ضغط منخفض (<3 PSI). بدء المشبك التصحيح والتسجيلات مضان (في 790 نانومتر متعدد الفوتون الإثارة) عن طريق إشارة الزناد.
   ملاحظة: خلال نضح المحلي للمجمع في قفص، خافتا شعاع الإثارة تماما لمنع تبييض.
7. وقف نضح المحلي للمجمع في قفص. زيادة كثافة الليزر ثنائي الفوتون الإثارة لتمكين كفاءة SBFI وتطبيق فلاش للأشعة فوق البنفسجية لتهيئة uncaging (uncaging مدة 300 مللي ثانية).
8. رصد التغيرات في SBFI مضان. إيقاف التسجيل بعد تعافى SBFI مضان العودة الى الاساس.

6. الصيدلة

1. لاختبار إشراك مستقبلات الغلوتامات ionotropic في توليد التيارات و / أو إشارات الصوديوم التي حركها فوق البنفسجية فلاش التحلل الضوئي من الغلوتامات في قفص، حاصرات مستقبلات توظيف.
   1. التبديل إلى ACSF تحتوي على مستقبلات أمبا مانع سيانو-nitroquinoxaline-ديون (CNQX، 10 ميكرومتر) وNMDA مستقبلات مانع الأمينية phosphonopentanoate (APV، 50 ميكرومتر) بالإضافة إلى TTX (انظر أعلاه) ويروي شريحة لا يقل عن 10 دقيقة.
   2. إجراءات التحفيز تكرار (انظر 5.4 و 5.5.)
2. الانعكاسية من آثار مثبطات "
   1. التبديل إلى ACSF العادي تحتوي على TTX الوحيد.
   2. يروي شريحة لمدة 20 دقيقة.
   3. إجراءات التحفيز تكرار (انظر 5.4 و 5.5).

7. المورفولوجيا

1. تسجيل XYZ كومة من مقطع مربع المنطقة مجموعة للقياسات التي يؤدونها. تأكد من أن هذا المكدس هو oversampleد مكانيا (0.2 ميكرون على الأقل لكل بكسل) لتمكين الأمثل صورة deconvolution وزيادة جودة الصورة والقرار.
2. تسجيل XYZ كومة من الخلية بأكملها لتقييم مورفولوجيا الخلايا.
3. الخوارزمية deconvolution تشغيل.

النتائج

في هذه الدراسة، نحن يبرهن على وجود إجراءات متعددة الفوتون المجهري للديناميات الصوديوم الخلوية مع الفلورسنت SBFI صبغ تعتمد على الصوديوم في الخلايا العصبية الهرمية CA1 من الماوس الحاد شرائح الأنسجة قرن آمون. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا كيفية الجمع بين هذه التقنية التصوير مع uncaging على الليزر المسح الضوئي للمركبات العصبية نشطة (مثل الغلوتامات قفص) ولها دقة استهداف الخلوية المجالات الدقيقة.

تحميل الخلايا العصبية مع SBFI من خلال التصحيح، ماصة مكنت تصور الخلية بأكملها بما في ذلك العمود الفقري والتشعبات غرامة المجاورة عن طريق استخدام متعدد الفوتون الإثارة (الشكل 6A، B، D و الشكل 7A).

الرقم 6. إشارات الصوديوم والتيارات متشابك الناجمة عن التحلل الضوئي فلاش الغلوتامات في قفص. (A) مكسيمآل صورة الإسقاط من الخلايا العصبية الهرمية CA1 محملة SBFI عبر ماصة التصحيح (PP). يشير مربع المساحة المبينة الموسع في B. LP تدل على موقف وتوجه من ماصة للنضح المحلي من الغلوتامات في قفص. (B) عالية الطاقة الإسقاط أقصى كومة من المقاطع البصرية من التغصنات مع العمود الفقري شجيري المجاورة. خضعت رزمة من المقاطع البصرية Z-المواءمة وdeconvolution. الصليب الأحمر إلى المنطقة المستهدفة من الحزم uncaging. خط منقط البرتقال يحدد المنطقة من الاهتمام من الذي سجلت الانبعاثات مضان. المربع يشير إلى المنطقة الموضحة في توسيع D. (C) اليسار: إشارة الصوديوم (الصف العلوي) وجسدية الداخل الحالي (الصف السفلي) الناجمة عن التحلل الضوئي فلاش الغلوتامات قفص (المشار إليها فلاش الأصفر). الخط الأحمر يمثل نوبة من البيانات التجريبية. وتمثل المنطقة الرمادية الفترة التي فلاش uncaging (300ميللي ثانية) عرقلة التصوير من SBFI مضان اليمين:. دون شروط مسبقة، نضح مع الغلوتامات في قفص، نفس UV-FLASH لا أثار تغييرا في الانبعاثات SBFI، ولا تيار الداخل (D) اليسار: صورة السلطة العليا من التغصنات والمناطق المجاورة العمود الفقري كما يرسم في B. جانب، ونفس الصورة مع القيم الرمادية مقلوب. الخطوط المنقطة تشير إلى مناطق الاهتمام الذي سجلت الانبعاثات مضان. الصليب الأحمر يشير إلى توطين شعاع uncaging اليمين:. العابرين الصوديوم الناتجة عن التحلل الضوئي للأشعة فوق البنفسجية فلاش الغلوتامات في قفص. الأزرق التتبع: إشارات الصوديوم في التغصنات. أثر الأحمر: متوسط ​​استجابة من ثلاثة أشواك المحاذية للبقعة uncaging. أثر الأخضر: متوسط ​​استجابة من ثلاثة أشواك بعيدة. يرجى النقر هنا لنسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد نضح المحلي مع محبوسالغلوتامات، تطبيق الأشعة فوق البنفسجية فلاش قريب من التغصنات أدى إلى انخفاض عابر في مضان الانبعاثات من SBFI، مما يعكس زيادة في تركيز الصوديوم داخل الخلايا (الشكل 6C، D والشكل 7B). في الوقت نفسه، سجلت تيار الداخل في سوما (الشكل 6C والشكل 7B). زيادة مدة فلاش الأشعة فوق البنفسجية نتج عنها زيادة في سعة من كل من أثار الداخل التيارات والإشارات الصوديوم (البيانات لا تظهر)، مشيرا الى ان النظام كان جيدا داخل النطاق الديناميكي والتي كانت مشبعة الردود لا uncaging ولا الخلوية. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية فلاش لمدة مماثلة أو أطول للشرائح التي لم perfused لقبل مع الغلوتامات في قفص، أبدا أثار التغيرات في SBFI مضان ولا التيارات الداخل، مشيرا إلى أن هذه الإشارات هي نتيجة لuncaging من الغلوتامات (الشكل 6C). وعلاوة على ذلك، تظهر هذه النتائج أنه لا يوجد ترابط مكونات imaging- وuncaging لوحظ شالتانجو الظروف التجريبية لدينا. ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن إشارات الصوديوم في العمود الفقري شجيري (الشكل 6D). في حين أننا لم محاولة لتحقيق التحفيز من العمود الفقري واحد فقط مع الغلوتامات uncaging، تميل سعة الذروة إلى أن تكون أعلى قليلا في العمود الفقري بالقرب من بقعة uncaging، في حين أن العمود الفقري بعيدا أظهرت التغيرات مضان متطابقة تقريبا كما التغصنات الأم (الشكل 6D).

أخيرا، درسنا مسارا لتدفق الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري ردا على uncaging من الغلوتامات. ولهذه الغاية، قمنا بتوظيف CNQX وAPV، التي هي حاصرات انتقائية للمستقبلات الغلوتامات الصوديوم قابلة للاختراق، ionotropic من AMPA- وNMDA-النوع الفرعي، على التوالي. نتائجنا تظهر أن الإشارات بين الخلايا الصوديوم الغلوتامات التي يسببها والتيارات الجسدية أثارت حذفت في وجود هذه حاصرات (الشكل 7B). عند غسل التدريجي من حاصرات، واستعاد الإشارات. هذا يدل ثار uncaging ينشط مستقبلات الغلوتامات الغلوتامات ionotropic على الخلايا العصبية الهرمية CA1، الذي توسط في تدفق الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري، مما أدى إلى العابرين الصوديوم داخل الخلايا والتيارات الداخل.

الرقم 7. الشخصية الدوائية إشارات الصوديوم أثار والتيارات الداخل. (A) مليئة SBFI CA1 الخلايا العصبية الهرمية مع ماصة التصحيح (PP) الملحق سوما (B) اليسار: عابر الصوديوم والتيار الجسدية الناجمة عن الصور تفعيل الغلوتامات في قفص في التغصنات والعمود الفقري مركز المرفقة: الإرواء مع ionotropic حاصرات مستقبلات الغلوتامات CNQX وAPV يمنع كل من إشارة الصوديوم والتيار الداخلي الناجم عن uncaging اليمين: وعند غسل التدريجي من حاصرات، تتم استعادة الإشارات. وتمثيلا خط أحمرنهاية الخبر نوبة من البيانات التجريبية. وتمثل المنطقة الرمادية الفترة التي فلاش uncaging (300 ميللي ثانية) عرقلة التصوير من SBFI مضان. يرجى النقر هنا لنسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وتظهر هذه الدراسة أن SBFI مناسب تماما لاثنين من الفوتون التصوير من العابرين الصوديوم داخل الخلايا في مقصورات الخلوية الصغيرة. لا بد من وضعها في الاعتبار، مع ذلك، أن كفاءة الكم من SBFI منخفضة نوعا ما ¹⁵ والنسبية تغييرات في تركيز الصوديوم صغيرة جدا مع النشاط الفسيولوجي. وبالتالي، عالية الدقة قياس نا ⁺ العابرين في عمليات الجميلة هو مهمة شاقة نسبيا، وbinning أو المتوسط ​​من عدة محاكمات قد يكون من الضروري الحصول على إشارات مرضية. بالإضافة إلى ذلك، حركية العابرين الصوديوم بطيئة المستغرب، مما يجعلها واجبة لتسجيل لفترات زمنية ممتدة. هذه الملاحظة يتوافق مع تلك في الدراسات السابقة، حيث تميزت تسوس monoexponential العابرين الصوديوم في التشعبات العصبية والخلايا النجمية من الثوابت في الوقت تسوس كبيرة في حدود 10 ثانية في درجة حرارة الغرفة ^1،2،6. هكذا يبدو العابرين الصوديوم لممارسة أبطأ بكثير الساعة شاركurse وأكبر من ذلك بكثير الثوابت الوقت تسوس بالمقارنة مع العابرين الكالسيوم ^16.

تخصيص هذه العيوب، والتصوير الصوديوم يبرهن على أن تكون أداة قيمة للتحقيق في الخصائص الفيزيولوجية العصبية من النطاقات الفرعية. على سبيل المثال، يمكن التصوير الصوديوم يخدم لمراقبة نشاط متشابك مثير في أو بالقرب من نقاط الاشتباك العصبي نشطة. لأن الصوديوم أساسا لا مخزنة ^8،17، العابرين الصوديوم الناجم عن النشاط ترتبط خطيا إلى مجموعة واسعة من الافراج عن الغلوتامات متشابك أو تطبيقها خارجيا الغلوتامات. وبالتالي فإنها تمثل المؤشرات المباشرة وغير متحيزة النشاط الجلوتامين العصبية. وعلاوة على ذلك، والأصباغ مؤشر الصوديوم تظهر ارتفاع K ل _د (K _د SBFI هو في حدود 25 ملي ^1). حتى في تركيزات عالية نسبيا صبغ الخلايا المستخدمة لتحقيق سطوع كافية (عادة 0،5-1 ملم)، وارتفاع K _'د ق يعني أن الأصباغ أنفسهم لا تعمل كحواجز لقالكراهية. وبالتالي، فإنها لا تشوه بالطبع السعة ولا وقت العابرين الصوديوم، الذي هو دائما مصدر قلق عندما يتم إدخال الأصباغ الحساسة الكالسيوم في الخلايا ^18. ومن ثم يمكن افتراض أن الكشف عن إشارات تمثل مقياسا جيدا للتغييرات "حقيقية" في الصوديوم داخل الخلايا. البطيء دوام ثم يعني أن سرعة الانتشار داخل الخلايا للالصوديوم في الخلايا العصبية هي أصغر بكثير مما كان يفترض سابقا ^19.

وهناك شرط حاسم للتنفيذ الناجح من التجارب معالجة خصائص مثير متشابك انتقال وتدفق الصوديوم مسارات في العمود الفقري والتشعبات هو تحريض على تفعيل سريع وموضعي للغاية من الهياكل بعد المشبكي. هذا ويمكن الحصول على التطبيق السريع والمحلية من الغلوتامات أو الغلوتامات منبهات في المنطقة المجاورة مباشرة من العمود الفقري أو التغصنات قبل التحلل الضوئي فلاش من المركبات في قفص. فلاش التحلل الضوئي لا داما لا ميكانيكياجنرال الكتريك الأنسجة، خالية من القطع الأثرية الحركة وراسخة للتحقيق في المسائل ذات الصلة (مثل إشارات الكالسيوم المحلية). كان قطرها من 1.5 ميكرون uncaging بقعة في الطائرة س ص. على مقربة Uncaging إلى إشارات الصوديوم شائك يسببها التغصنات في كل من العمود الفقري والتغصنات الأم. في حين أن إشارات تميل إلى أن تكون أكبر في العمود الفقري الأقرب إلى بقعة uncaging، لا تزال السعات في التغصنات الأم والعمود الفقري وليس بعيدا مماثلة لتلك الموجودة في المناطق المجاورة مباشرة للبقعة uncaging. تم تنفيذ Uncaging ل300 ميللي ثانية خلالها زيادة في السعة التيارات الداخل. الغلوتامات Uncaged قد تنتشر في الأنسجة خلال نفس الفترة الزمنية، وتفعيل مستقبلات الغلوتامات ionotropic وتدفق الصوديوم في المناطق شجيري العمود الفقري وبعيدا عن بقعة uncaging.

مشكلة الجوهرية التي تحدث عند استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لالتحلل الضوئي للمركبات في قفص تدار من خلال حل الاستحمام خليةهو 'تصفية الداخلية. بسبب ارتفاع معدل امتصاص من القفص، والموهن ضوء الأشعة فوق البنفسجية بقوة على طول الطريق من الهدف الى الموقع التحفيز ^20،21. وهناك طريقة ممكنة لتجنب ذلك هي نضح المحلي مع القفص الذي يقتصر فقط على الموقع التحفيز، مما يقلل كذلك كمية مركب قفص بحاجة إلى الحد الأدنى. بالمقارنة مع uncaging بوساطة الليزر المسح الضوئي للأشعة فوق البنفسجية، القريب من الأشعة تحت الحمراء ثنائي الفوتون uncaging ²² غير مكانيا أكثر دقة، وذلك بسبب دقة التحفيز هو زيادة في محور ض. من ناحية أخرى، وذلك بسبب شريحة صغيرة من أقفاص تستخدم عادة لأطوال موجية أطول كما يعمل مع اثنين من الفوتون الإثارة، إما على نسبة عالية من المركب قفص أو عالية للغاية، وهناك حاجة شدة الضوء يحتمل الضوئية. أيضا، واثنين من الفوتون uncaging يتطلب استثمارا أكبر بكثير في المعدات؛ من بين أمور أخرى، وهناك حاجة ليزر الأشعة تحت الحمراء إضافية بالإضافة إلى المكونات البصرية المطلوبة،.

كلا SBFI وMNI-الغلوتامات ومنفعل في نطاق الطول الموجي متطابقة. وهذا قد يؤدي إلى الاعتماد المتبادل غير مقصود من الأشعة فوق البنفسجية والليزر uncaging SBFI أو ليزر الأشعة تحت الحمراء والتصوير MNI-الغلوتامات، مما أدى إلى تبييض SBFI من قبل فلاش uncaging و / أو uncaging المستمر من الغلوتامات بواسطة شعاع الأشعة تحت الحمراء. لكن، وكما هو مبين في الشكل 6C، لا الأشعة فوق البنفسجية ومضة في حد ذاته ولا الفوتون التصوير متعددة تسبب هذه الآثار المتبادلة تحت ظروف تجريبية لدينا.

وتستخدم أنظمة الأشعة فوق البنفسجية فلاش مماثلة لتلك الموصوفة هنا بصورة روتينية في العديد من المختبرات الأخرى، ويمكن بسهولة نسبيا أن تدمج في أي المجهر التصوير متعدد الفوتون القائمة. فهو يقدم ميزة أن شعاع الليزر لالتحلل الضوئي يمكن وضعه بحرية في مجال الرؤية. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح النظام لاعادة تموضع سريع والآلي من شعاع الليزر وحجم الإصدار، على التوالي، في مجال الرؤية أثناء التجربة. أويحييص التعديل يبسط ويحسن دقة تحديد المواقع من بقعة uncaging، بحيث إطارات من برامج التصوير يمكن أن تخدم لضبط الإطارات التصوير وuncaging بشكل متطابق.

أخذت معا، خلية كاملة التصحيح، المشبك ومتعدد الفوتون التصوير الصوديوم في التشعبات والعمود الفقري من الخلايا العصبية المركزية، جنبا إلى جنب مع إجراء تعديل للأشعة فوق البنفسجية التي يسببها الخفيف uncaging الغلوتامات، يسمح موثوقة وتفعيل التنسيق مستقبلات الغلوتامات في الأنسجة. وبالتالي فإنه يمكن أن تعمل على تحليل خصائص انتقال متشابك مثير والإشارات الصوديوم بعد المشبكي في الخلايا العصبية في أنسجة سليمة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borosilicate-glass capillaries	Hilgenberg	1405059	75 x 2 mm, wall thickness 0.3 mm
Camera	Jenoptik	ProgRes MF	IR-DIC compatible camera
Deconvolution software	SVI	Huygens Pofessional X11
Fiber optic spectrometer	Ocean Optics	USB 4000	Miniature fiber optic spectrometer
Filter tubes	VWR		cenrifugal filter, 0.2 µm
Imaging software	Olympus Europe	Flowview Ver 5.0c, Tiempo
IR beam power controller	Custom built		Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell
IR laser	SpectraPhysics	Mai-Tai	fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710 - 990 nm); CAUTION
IR power monitor	Custom built
Micromanipulator	Burleigh	PCS 5000
Microscope/Imaging System	Olympus Europe	BX51WI/FV300	Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified
ND filter wheel	Newport	50Q04AV.2	UV fused silica, optical density 0.05 - 2.0
Objective	Nikon Instruments Europe	NIR Apo 60x/1.0w
Patch clamp amplifier	HEKA	EPC-10
Pipette puller	Narishige	Model PP-830
Pneumatic drug ejection system	NPI Electronic	PDES-DXH
Pockels cell	Conoptics	350-80 LA-BK	EOM, used as fast switch and for power adjustment
Pockels cell driver	Conoptics	M302-RM	High voltage differential amplifier
Shutter	Vincent Associates	LS6ZM2	ALMgF2-coated BeCu blades
Shutter controller	Custom built
Shutter driver	Vincent Associates	Uniblitz VCM D1
Slicer/Vibratome	Thermo Scientific	Microm HM 650 V
Uncaging software	Rapp OptoElectronic	UGA40 1.1.2.6 + NetCam
UV laser	Rapp OptoElectronic	DL-355/10	cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION
UV laser scanning system	Rapp OptoElectronic	UGA 40	Galvanometric scanning system
Name of Compound	Company	Catalog Number	Comments/ Description
CNQX	Sigma Aldrich	C-127	AMPA receptor antagonist; CAUTION
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	NMDA receptor antagonist; CAUTION
SBFI K+ salt	Teflabs	OO32
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION
NMI-caged-L-Glutamate	Torcis	1490	Caged glutamate released upon UV absobtion