JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

Abstract

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Introduction

A cell culture system has been established in which mouse embryonic stem cells (mESC) are differentiated to T cells in vitro.1 This system exploits the ability of Notch signaling to drive T cell differentiation.2 The OP9-DL1 cell line was created by transducing bone marrow-derived OP9 cells3 with a Notch ligand, Delta-like 1 (DL1).4 Activation of the Notch signaling cascade in vitro facilitates T cell development to the exclusion of other cell lineages. With the inclusion of appropriate cytokines, this system provides a cell culture “microenvironment” that supports the sequential advancement of mESC toward hematopoietic and ultimately T cell lineages. This system supports the flow cytometric identification of T cells at the various developmental stages seen during normal T cell ontogeny in the thymus. For investigating selected questions relating to T cell development, this procedure has become an attractive alternative to in vivo whole mouse models5 and in vitro fetal thymic organ culture methods used to elicit T cell development from mouse embryonic stem cell derived hematopoietic precursors.6 The major advantage of the OP9 co-culture system is that it involves standard and straightforward cell culture techniques and does not depend on the continual use of experimental animals.

We follow a detailed, previously published protocol in our experiments using this approach.7 We have utilized this technology to examine the hematopoietic differentiation products of non-manipulated mESC clones, high quality mESC clones handpicked to make chimeric embryos8 and stably-transfected ESC clones coming directly out of drug selection.9 We have noted that the temporal kinetics of initial in vitro differentiation from mESC to mesoderm-like colonies in this model can be variable among individual clones. The mESC-OP9 co-cultures can be visually assessed for progression to mesoderm. While this will usually be completed by the fifth day of co-culture, among individual clones, completion can be delayed for one or two days. Quantitative (~80-90%) mesoderm formation must be achieved prior to transfer in order to obtain optimal hematopoietic progenitor cell (HPC) formation and robust lymphopoiesis. Thus, when working with multiple mESC clones, this “day 5” passage is best delayed until all clones complete the transition to mesoderm-like colonies. This enables synchrony of subsequent development among the clones after their transfer into hematopoietic differentiation conditions. Three days after the passaging of the 80-90% mesodermal formations, HPCs are collected from the OP9 monolayers. HPCs can be seeded on new OP9 cells to allow differentiation of monocytic, erythroid and B cell lineages. Alternatively, HPCs can be seeded on OP9-DL1 cells and driven towards T cell development. All in vitro differentiation cultures are provided Flt-3L beginning at day 5, with further addition of IL-7 beginning at day 8. Flow cytometry analyses performed at various time points during the experiment enable monitoring of progress through the stages and lineages of hematopoietic differentiation and T cell development. CD4/CD8 double positive (DP) T cells begin emerging by day 16 of the co-culture, and both DP and CD8 single positive (SP) cells are abundant by day 20. The general outcome and robustness of co-culture is greatly dependent on the ability to visually ascertain the completion of the significant developmental turning points that occur. This protocol aims to be a guide to the recognition of these milestones, as well as the other critical parameters, that are key to successful differentiation.

Protocol

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، ومركبات السيتوكينات مهيلم

  1. إعداد وسائل الاعلام الخلية ES باستخدام تعديل Dulbecco لمن النسر المتوسطة (DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز والصوديوم البيروفات. إضافة 20٪ ESC المؤهلين الجنين مصل بقري (FBS) و 1٪ البنسلين / الستبرتوميسين، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ HEPES العازلة، الأحماض الأمينية 1٪ غير الضرورية، 0.1٪ جنتاميسين (50 ملغ / مل) و 0.1٪ ( 55 ميكرومتر) β-المركابتويثانول. تعقيم وسائل الاعلام الخلية ES عن طريق الترشيح.
  2. إعداد وسائل الاعلام OP9 بجعل 1 L ألفا الأساسية الدنيا متوسط ​​(α-MEM) من مسحوق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين. عكس إلى المزيج. تعقيم عن طريق الترشيح إلى قسمين 500 مل مأخوذة.
    ملاحظة: ينصح استخدام وسائل الإعلام مصنوعة من مسحوق، ومن المرجح أن تسفر عن تحسين صيانة الخلايا OP9 والتمايز في نتائج المختبر. وقد أصبح هذا النهج الإجراء لدينا معيار. ومع ذلك، نلاحظ أيضا ثار قمنا في بعض الأحيان يستخدم السائل مسبقة الصنع α-MEM مع النجاح الكافي.
  3. إعداد تجميد وسائل الإعلام من خلال إضافة 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى 90٪ FBS. دوامة بلطف وتعقيم عن طريق الترشيح. تخزينها في 4 درجة مئوية.
  4. إعداد 2،000x العميد بحري 3 يجند (10 ميكروغرام / مل) عن طريق إذابة البشري المؤتلف العميد بحري 3 يجند (العميد بحري-3L) في كامل وسائل الإعلام OP9 إلى 10 ميكروغرام / مل. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع توصيات المورد بشأن الاستقرار والتخزين.
    ملاحظة: استقرار العميد بحري-3L قصيرة (1 شهر في 4 درجات مئوية أو 3 أشهر في -80 درجة مئوية).
  5. إعداد 1،000x IL-7 (1 ميكروغرام / مل) باستخدام وسائل الإعلام OP9 الكامل. قسامة إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية. اتبع توصيات المورد على الاستقرار والتخزين (IL-7 غير مستقر لمدة تصل إلى 12 شهرا في -80 درجة مئوية).
  6. إعداد 1،000x اللوكيميا التثبيطي عامل (LIF) (10 ميكروغرام / مل) من 1:10 تخفيف من 10 7 وحدات من LIF طن وسائل الإعلام خلية ES. متجر قسامة في 4 درجات مئوية. تأكد من ملاحظة تاريخ انتهاء الصلاحية المقدمة من قبل الشركة المصنعة على قارورة قسامة.
    ملاحظة: المنتج هو مستقر في مركزة أو مخففة شكل لا يقل عن 18 شهرا من تاريخ الصنع.
  7. إعداد مهيلم 6 لوحات جيدا قبل إضافة 1.5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين في كل بئر من لوحة 6 جيدا. ترك الأطباق في غطاء العقيمة في درجة حرارة الغرفة مع أغطية على، مما يسمح لا يقل عن 30 دقيقة للطلاء. ويمكن أيضا أن تترك الأطباق في الحاضنة بين عشية وضحاها مرطب. إزالة أي حل الجيلاتين بقايا الحق قبل البذر الخلية. لا تدع حل الجيلاتين يجف تماما في البئر.

2. إعداد وصيانة الخلايا المغذية والفأر الخلايا الجذعية الجنينية (مسك)

ملاحظة: احتضان كل الخلايا في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.

  1. ذوبان الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF)
    1. سريعة الذوبان قارورة المجمدة (~ 5 × 10 6 خلايا / قارورة) من ميتوميسين (أو القبض ميتوتيكلي المعالجة C) MEFs ونقلها إلى أنبوب 15 مل.
    2. إضافة 8 مل من وسائل الاعلام الخلية ES لإذابة الخلايا، بطريقة الإفلات من الحكمة أن تضعف تدريجيا DMSO المتوسطة من التجمد.
    3. خلايا الطرد المركزي في 400 ز س في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية وطاف resuspend الكرية خلية في 3 مل من وسائل الاعلام الخلية ES.
    4. إعداد أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع 33 مل من قبل تحسنت وسائل الاعلام الخلايا ES. إضافة 3 مل من MEFs معلق لجلب الحجم النهائي إلى 36 مل.
    5. توزيع 3 مل من MEFs معلق في كل بئر من صفيحتين مهيلم 6 جيدا. وضع لوحات في الحاضنة لمدة ست ساعات على الأقل للسماح للخلايا لإرفاق وانتشرت قبل بذر mESCs عليها. قد تكون هذه الطبقات المغذية القبض ميتوتيكلي صالحة للاستعمال لعدة أيام بعد البذر الأولي، إن وسائل الإعلام الخاصة يتم تغيير كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: يمكن أيضا MEFs القبض طازجة استخدامها.
    6. mESCs البذر
      1. سريعة الذوبان قارورة مع استنساخ مسك المجمدة في 37 ° C حمام المياه وإعداد الخلايا كما هو موضح في 2.1.1-2.1.3.
        ملاحظة: نحن تجميد 2 قارورة من مسك من بئر متموجة من لوحة 6 جيدا.
      2. إزالة وسائل الاعلام من جانب واحد (لكل مسك استنساخ) من لوحة 6 جيدا مع الطبقات الوحيدة MEF اعتقال (المعد في الخطوة 2.1.5) وبذر مل 3 من mESCs على رأس أحادي الطبقة MEF. إضافة 3 ميكرولتر من 1،000x LIF (10 نانوغرام / مل). العودة الأطباق في الحاضنة.
    7. ES صيانة الخلية والتربسين بوساطة مرور
      ملاحظة: تغيير وسائل الإعلام يوميا، أو تقسيم على أساس التقاء مسك. على النحو الأمثل، والحصاد وانقسام / إعادة لوحة الخلايا كل يوم.
      1. إزالة الخلايا ES سائل الإعلام ويغسل mESCs مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقيقة.
      2. جمع الخلايا trypsinized وتحويلها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. بقوة الماصة تعليق خلية لتفتيت كتل من مالمجالس الاقتصادية والاجتماعية. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الخلية ES الكامل لتعليق خلية لتحييد التربسين.
      3. تدور في الخلايا ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 3 مل ES سائل الاعلام الخلية.
      4. إزالة وسائل الاعلام من 6 لوحات جيدا تحتوي على إعداد الطبقات الوحيدة MEF المعتقلين. إضافة كمية مناسبة من تعليق خلية (استنادا إلى نسبة الانقسام المطلوب) في 3 مل من وسائل الاعلام الخلية ES إلى كل بئر إلى أن المصنف. إضافة 3 ميكرولتر من 1،000x LIF. ومتموجة مسك تقسيم جيدا 1: 6 وسوف يكون جاهزا للمرور في 2 يوما.
    8. OP9 / OP9-DL1 صيانة الخلايا
      1. ذوبان الجليد قارورة من الخلايا OP9 (اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.3 باستخدام وسائل الإعلام OP9)
      2. إضافة 7 مل سائل الإعلام OP9 إلى 10 سم صحن زراعة الأنسجة. إضافة 3 مل من الخلايا معلق بطريقة الإفلات من الحكمة، وتوزيع الخلايا في جميع أنحاء اللوحة. وضع الخلايا بين عشية وضحاها في الحاضنة.
      3. تحقق التقاء الخلايا OP9 في اليوم التالي. إذا كان الطبق يحتوي على العديد من خلايا ميتة طافية، ريمولقد وسائل الإعلام وإضافة 10 مل من وسائل الإعلام OP9 الطازجة. إعادة الإناء إلى الحاضنة إذا لم يتم ملاحظة التقاء كامل تقريبا. سبليت (باستخدام التربسين) 1: 4 في القريب أحادي الطبقة متموجة OP9.
        ملاحظة: يجب أن تصل إلى نفس المستوى لوحات التقاء مرة أخرى في حوالي 2 يوما. والحرص على عدم السماح لخلايا OP9 تصبح أكثر متموجة.
      4. تجميد المقاطع الأولى من خلايا OP9 كما أسهم التوسع.
        ملاحظة: نحن تجميد 2 قارورة من الخلايا OP9 متكدسة بالقرب من واحدة 10 سم الطبق. كل قارورة من الأسهم التوسع يمكن نشر مزيد من العمل لخلق الأسهم التي يتم استخدامها لاحقا في مسك التجارب ثقافة مشتركة. إبقاء جميع الأسهم OP9 مجمدة في النيتروجين السائل وليس في الفريزر -80 درجة مئوية، لأن التقلبات في درجات الحرارة يمكن أن تؤثر سلبا على جودة يتجمد.

    3. OP9-DL1 الإجراءات المشارك الثقافة

    1. الاستعدادات ثقافة مشتركة
      1. ما يقرب من أسبوع واحد قبل الشروع في الثقافة المشتركة، ذوبان الجليد MEFs، mESCs وستو الخلايا OP9 العملCKS. بما أنه لا حاجة خلايا OP9-DL1 حتى اليوم ثقافة مشتركة 8، ذوبان الجليد الخلايا OP9-DL1 خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد ثقافة مشتركة البدء. المحافظة أو تجميد جميع الخلايا حسب الحاجة.
      2. تحديد العدد الأولي من 10 سم لوحات مع الطبقات الوحيدة الخلية OP9 أعدت لتصل إلى 80٪ على التقاء شارك في ثقافة اليوم 0 بناء على حجم التجربة (على سبيل المثال، عدد من الحيوانات المستنسخة مسك أن تكون متباينة، وعدد من النقاط الزمنية ثقافة مشتركة ل يتم تحليلها). للتحضير لالثقافة المشتركة، وتقسيم بالقرب طبق متموجة من OP9 الخلايا بين 1: 4 و 1: 6 قبل يومين من متى تكون هناك حاجة إلى الطبقات الوحيدة.
        ملاحظة: يحتاج المرء لوحة واحدة على الأقل في ESC استنساخ. عادة، المصنف على ESC استنساخ واحد على لوحة واحدة (كما هو موضح أدناه) يوم 0 ينبغي أن تسفر خلايا كافية لبذر ست لوحات في اليوم مرور 5. كل يوم سوف 5 لوحة تمكين نقطة زمنية لاحقة تحليل واحد.
      3. انه ستكون هناك حاجة باستمرار الطبقات الوحيدة لOP9 شارك في ثقافة المرور، ورعاية لmainta دائمافي عدد كاف من لوحات إضافية الثقافة OP9 بالتوازي مع الثقافة المشتركة.
    2. 0 اليوم: بدء شارك في ثقافة
      1. جمع مسك كما في 2.3.1-2.3.4. عد الخلايا.
      2. لكل استنساخ مسك إعداد 5 × 10 4 مسك في 10 مل من وسائل الإعلام OP9 لكل لوحة.
        ملاحظة: على الرغم من أننا لم تستخدم، نلاحظ أن وسيلة بديلة تتكون من α-MEM 10٪ FBS، و5 × 10 -5 M تم الإبلاغ أيضا عن β-المركابتويثانول لاستخدامها في التمايز المشترك الثقافات 10.
      3. إزالة وسائل الإعلام القديمة من OP9 الأطباق وإضافة 10 مل من تعليق لمسك الأطباق مع الحرص على توزيع الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء اللوحة. ضع الأطباق في الحاضنة 37 ° C.
    3. يوم 3: تغيير وسائل الإعلام
      1. إزالة الأطباق من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر. يجب المستعمرات تبدأ لانقاص اللمعان ويبدو بالارض.
      2. إزالة وسائل الاعلام من أطباق بلطف وإضافة 10 مل من OP9 جديدةوسائل الاعلام.
      3. العودة الأطباق المشارك الثقافة الحاضنة. مراقبة بصريا تشكيل مستعمرة مثل الأديم المتوسط ​​يوميا إبلاغ توقيت OP9 إعداد أحادي الطبقة المغذية للمرور القادم (يوم 5)، والتي لا ينبغي أن تنفذ حتى ~ 80-90٪ من المستعمرات عرض بصريا مثل الأديم المتوسط ​​التشكل. تأجيل الأقصى للخطوة نقل خلية يوم 5 هو 2 يوما.
    4. يوم 5: التربسين مرور بوساطة مع ما قبل الطلاء.
      ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من أطباق 10 سم مع الخلايا OP9 متكدسة على النحو الأمثل. المضي قدما في الخطوات المقبلة إلا إذا كانت الثقافات المشتركة بصريا عرض الميزات الموضحة في الخطوة 3.3.3 (انظر ممثل النتائج أيضا).
      1. إزالة وسائل الاعلام من الأطباق ثقافة مشتركة. إضافة 4 مل PBS لغسل. دوامة PBS وإزالتها. إضافة 4 مل من 0.25٪ التربسين ووضع الأطباق في الحاضنة لمدة 5 دقائق ~.
      2. تعطيل طبقة من الخلايا trypsinized من قبل pipetting قوية، مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء المفرطة، حتىويتحقق متجانسة، تعليق خلية في الغالب واحد.
      3. إضافة 4 مل من وسائل الإعلام OP9 كاملة ومزيج من قبل pipetting. نقل الخلايا إلى جديد وفارغ 10 سم طبق وضعها في الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا OP9 التمسك الطبق. هذا "ما قبل الطلاء" خطوة يقلل من عدد الخلايا OP9 نقل إلى الخطوة التالية من ثقافة مشتركة.
      4. تحضير 50 ​​مل أنابيب الطرد المركزي مع مصافى الخلية 40 ميكرومتر.
      5. جمع الخلايا غير ملتصقة من طبق مطلي قبل وتمريرها من خلال مصفاة الخلية في أنبوب. غسل الطبق برفق مع 6 مل من برنامج تلفزيوني وتمريرها من خلال نفس مصفاة، وترك الخلايا OP9 المرفقة خلف.
      6. خلايا الطرد المركزي في 400 ز × 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend الخلايا مكعبات في 3 مل من وسائل الإعلام OP9 الكامل. عد الخلايا.
      7. إزالة وسائل الإعلام من 10 سم لوحات مع خلايا OP9 متكدسة على النحو الأمثل.
      8. عن كل نقطة زمنية التحليل، البذور 5 × 10 5 خلية أحادية على OP9طبقة في 10 مل الحجم النهائي.
      9. إضافة 5 نانوغرام / مل البشري المؤتلف العميد بحري-3L ووضع الأطباق في الحاضنة.
    5. يوم 8: لدم السلف الخلية (HPC) جمع
      ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من 6 لوحات جيدا مع الطبقات الوحيدة OP9 أو OP9-DL1 الخلية بحيث أنها ستكون ~ 80٪ متكدسة في الوقت المناسب لهذه الخطوة.
      1. تحضير 50 ​​مل أنابيب الطرد المركزي مع 40 ميكرون المصافي.
      2. إزالة الأطباق من الحاضنة ومراقبة تحت المجهر. عناقيد لامعة من HPCS يجب أن يرفق فضفاضة لأحادي الطبقة OP9. جمع أكبر عدد ممكن من هذه الخلايا ممكن عن طريق غسل (ولكن ليس بشكل مفرط تعطيل) أحادي الطبقة OP9 مع ماصة ووسائل الإعلام الموجودة على الطبق. لمنع الرغوة، وترك دائما لا يقل عن 1 مل من وسائل الإعلام في غيض من الماصة خلال هذه المجموعة HPC / خطوة الغسيل.
      3. تمر الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرومتر في أنبوب. إضافة 8 مل PBS لنفس لوحة وتحقق تحت المجهر إذا كان كل HPCS نحنإعادة جمعها. كرر الخطوة الغسيل / جمع مع برنامج تلفزيوني و(إذا لزم الأمر) مع الغسيل أكثر قوة. سلالة الخلايا في الأنبوب الذي يحتوي بالفعل على خلايا من نفس اللوحة.
      4. خلايا الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      5. إعداد مزيج الرئيسي من 3 مل (لكل لوحة المصنفة في يوم 5) وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل IL-7.
      6. إزالة وطاف بيليه resuspend في وسائل الإعلام OP9 مع العميد بحري-3L + IL-7 مزيج الرئيسي (3 مل لكل 10 سم طبق معالجتها). نقل الخلايا التي جمعت من كل لوحة في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا مع الخلايا OP9.
        1. من أجل دفع الخلايا نحو حيدي، خلية B أو الأنساب محمر، خلايا البذور التي تم جمعها على خلايا OP9. لاستخلاص خلايا T، خلايا البذور على الطبقات الوحيدة الخلية OP9-DL1.
      7. وضع 6 لوحات جيدا في الحاضنة.
    6. يوم 10: تغيير وسائل الإعلام
      1. إعداد أنبوب الطرد المركزي 15 مل لكل متميز مسك استنساخ نوع من الخلايا المغذية-combinaنشوئها في ثقافة مشتركة.
      2. إعداد مزيج الرئيسي من وسائل الاعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل من العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل من IL-7. إعداد 3 مل لكل بئر.
      3. جمع بلطف وسائل الإعلام من كل بئر من لوحة 6 جيدا يجمع بين وسائل الإعلام من آبار متعددة تحتوي على نفس ESC-استنساخ نوع من الخلايا المغذية الجمع.
      4. إضافة 2 مل من مزيج الرئيسي وسائل الإعلام OP9 (انظر 3.6.2) في كل بئر.
      5. الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 400 ز س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend كل بيليه (صغير جدا إذا مرئية) في 1 مل من مزيج الرئيسي OP9 سائل الإعلام (انظر 3.6.2) لكل بئر جمعها أصلا في الخطوة 3.6.3.
      6. توزيع 1 مل من الخلايا مرة أخرى في كل بئر من التي تم جمعها وسائل الإعلام أصلا ليصل حجم في كل بئر إلى 3 مل. العودة الأطباق إلى الحاضنة.
    7. اليوم 12: لا التربسين مرور
      ملاحظة: إعداد مقدما عدد كاف من الأطباق 6 جيدا مع الخلايا OP9 أو OP9-DL1 بحيث سيتم متموجة على النحو الأمثل في الوقت المناسب لهذا لياليتيب. يوم 12 هو المثل الأعلى للالتدفق الخلوي تحليلات محمر النامية، وحيدي، وخلايا T مرحلة مبكرة.
      1. إعداد مزيج الرئيسي (3 مل لكل بئر التي ستستمر في التعاون ثقافة) وسائل الإعلام OP9 مع 5 نانوغرام / مل من العميد بحري-3L و 1 نانوغرام / مل من IL-7.
      2. تحضير 50 ​​مل أنابيب الطرد المركزي مع 40 ميكرومتر مصافى (واحد لكل ESC استنساخ-المغذية نوع من الخلايا في الجمع المشارك الثقافة).
      3. بقوة ماصة وسائل الإعلام الموجودة في كل بئر إلى تفصيل جميع الخلايا (بما في ذلك أحادي الطبقة) في البئر. تواصل مع pipetting لقوي حتى يتحقق حالة تشبه تعليق خلية واحدة.
      4. تمر الخلايا التي تم جمعها من خلال مصفاة في أنبوب. أضف 3 مل من برنامج تلفزيوني في كل بئر لغسل وجمع كل الخلايا المتبقية. تمر الخلايا من خلال نفس مصفاة. الجمع بين الخلايا من آبار متعددة تحتوي على نفس ESC-استنساخ نوع من الخلايا المغذية الجمع.
      5. تجاهل مصفاة الخلية المستخدمة وإزالة ما يعادل قسامة إلى بئر واحدة (~ 6 مل) لأي المطلوبالتدفق الخلوي (أو غيرها) التحاليل التي يتعين الاضطلاع بها في ذلك اليوم. تخزين هذه مأخوذة على الجليد قبل الاستخدام.
      6. خلايا الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. resuspend الكرية من 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 3 مل من مزيج الرئيسي لكل بئر لإعادة المصنف. إضافة 3 مل لكل بئر من كل تعليق الخلية إلى نوع من الخلايا المغذية المناسبة ووضع الأطباق في الحاضنة.
    8. يوم 14: تغيير وسائل الإعلام
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.6.
    9. اليوم 16: لا التربسين مرور
      ملاحظة: إعداد مقدما أطباق 6 جيدا الخلايا OP9 أو OP9-DL1 متكدسة على النحو الأمثل لهذه الخطوة.
      ملاحظة: يوم 16 هو المثالي لتدفق تحليل الخلوي من الخلايا الليمفاوية B وخلايا T المرحلة المتوسطة.
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.7.
    10. يوم 18: تغيير وسائل الإعلام
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.6.
    11. اليوم 20: لا التربسين مرور
      ملاحظة: يوم 20 طق مثالية لتحليل التدفق الخلوي من منتصف إلى أواخر مرحلة تطوير خلايا T.
      1. اتبع الخطوات المذكورة في القسم 3.7. إذا رغبت في ذلك، وتحمل تمييز الخلايا الماضي يوم 20 التغيير سائل الإعلام بالتناوب ولا التربسين الممرات كل يومين، مع الرصد اليومي لمعدل التوسع اللمفاويات.

النتائج

عندما نمت على MEFs بحضور LIF، mESCs يمكن الحفاظ في حالة غير متمايزة. في ظل ظروف مثالية، فإنها تبدو وكأنها مستعمرات المدمجة للخلايا تحيط بها هالة لامعة في المرحلة النقيض المجهر (الشكل 1). يجب مراقبة هذه الثقافات يوميا. اعتمادا على التقاء الخلايا، وسائل الإعلام يمكن ?...

Discussion

وقد استخدمت نظام OP9-DL1 ثقافة مشتركة لدراسة دور الجينات منتجات مختلفة خلال تطوير أنواع خلايا الدم من الخلايا الجذعية. 8،12،13 وقد ثبت أيضا نموذج فعال لدراسة وظيفة الجين DNA التنظيمي خلال تمايز الخلايا. 9،14 باستخدام هذا النهج كبديل لنماذج الماوس كلها يمكن أن تسف...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Joon Kim for expert flow cytometry assistance. Research in the authors’ labs is supported by the SCORE program of the National Institutes of Health (grant SC1-GM095402 to B.D.O) and the Canadian Institutes of Health Research (to J.C.Z.P.). J.C.Z.P. is supported by a Canada Research Chair in Developmental Immunology. The biomedical research infrastructure of Hunter College is supported in part by the NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) program via grant MD007599. We also acknowledge the New York State Stem Cell Science Program (NYSTEM) for its support of the initiation of stem cell research at Hunter College via grant C023048.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning15-013-CV
Stem cell qualified FBSGemini100-125Heat inactivated
Penicillin/StreptomycinCorning30-002-CI
L-alanyl L-glutamineCorning25-015-CI
HEPES buffer MilliporeTMS-003-C
Non-Essential Amino AcidsThermoScientificSH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)Life Technologies 15750-060
β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBSLife Technologies 21985-023
Filter UnitMilliporeSCGPU05RE0.22 μm PES membrane
Cell Culture Grade WaterCorning25-055-CM
α-MEM Life Technologies 12000-022Powder, reconstitute per manufacture recommendation
Sodium bicarbonate SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03Testing of individual lots required 
Dimethyl Sulphoxide SigmaD2650
Recombinant Human Flt-3 LigandR&D Systems308-FK
Recombinant Murine IL-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
Utrapure water with 0.1% gelatinMilliporeES-006-B
MEFs mitomycin C treatedMilliporePMEF-CFAny mitotically arresteded MEFs can be used
DPBSCorning21-031-CV
Cell strainer (40 μm)Fisher22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-wellBD Falcon353046
1.5 ml microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500
15 ml centrifuge tubesBD Falcon352096
50 ml centrifuge tubesBD Falcon352070
5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer CapBD Falcon352235Tubes for FACS 
ES R1 cellsATCCSCRC-1011
OP9 cellsCells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan).
OP9-DL1 cells    Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory.
FlowJo software Tree StarFACS data analyses
Flow CytometerBDFACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab

References

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

92 OP9 1 DLL 1 T

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved