يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Summary

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Abstract

العمليات الكامنة للتنمية العذراء ذبابة الفاكهة يمكن أن تحول وتشويه ظهارة العين في السبل التي تجعل سلوك الخلية الفردية الصعب تتبع أثناء التصوير الخلية الحية. وتشمل هذه العمليات: دوران في شبكية العين، نمو الخلايا وحركة عضوي. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما طيات قدم مخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفية وكما يتم إعداد خادرة للتصوير، وجعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور أكثر من عدد قليل من ommatidia في طائرة الوصل واحدة. سير العمل أوجز هنا العلاجات هذه القضايا، مما يسمح للتحليل سهل من العمليات الخلوية خلال ذبابة الفاكهة تطوير العذراء العين. يتم ترتيب الشرانق نظموا بشكل مناسب، في تلاعب التصوير التي يمكن تجميعها بسهولة في معظم المختبرات اليوبيكويتين-DE-كادهيرين: GFP وGMR-GAL4 -driven UAS-α-كاتينين: GFP تستخدم لتصور حدود الخلية في العين ظهارة ^{1 -3.} بعد إزالة التفاف هوتطبق على صور الفلورسنت القبض على طائرات التنسيق متعددة، يتم إنشاء القصوى الصور الإسقاط لكل نقطة زمنية وتعزيز استخدام برامج تحرير الصور. وتستخدم خوارزميات المواءمة لتحقيق الاستقرار بسرعة الحركة زائدة، مما يجعل سلوك الخلية الفردية أسهل لتتبع.

Introduction

يتميز المجمع ذبابة الفاكهة العين عن طريق ترتيب نمطي لها ~ 750 ommatidia مفصولة العسل شعرية من الخلايا الصبغية التبعي ^4،5. ونمط هذه الخلايا الصبغية من قبل مجموعة منسقة من الأحداث: حركات خلية محلية، نمو الخلايا، والتغيرات في شكل الخلية، وموت الخلايا المبرمج. التصور المباشر لهذا ظهارة يسمح احد لدراسة الآليات الجزيئية التي تقوم عليها هذه الأحداث في سياق ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ورابط الجأش.

وعلى النقيض من البروتوكولات السابقة ^6،7، والتقنية المذكورة هنا تتضمن وسيلة فعالة لتحقيق الاستقرار في حركة الأنسجة الغريبة التي لا يمكن أن تكون. فصل من عملية التصوير. هذه الطريقة يعزز دراسات سلوك الخلية في تطوير ذبابة الفاكهة العذراء العين ظهارة - الأنسجة التي تنمو، بالتناوب، والتحولات على مدار التصوير. وبالإضافة إلى ذلك الحركة استقرار تقنية ديمكتوب هنا سوف تكون مفيدة لدراسة الخلايا في سياقات أخرى حيث تحدث حركة دخيلة.

لتصور حدود الخلية في مجال الشبكية ذبابة الفاكهة، تم إنشاء خطوط الطيران المعدلة وراثيا التي تعبر عن يو بي آي-DE-كادهيرين: GFP وكذلك UAS-α-كاتينين: GFP تحت سيطرة السائق العين محددة GMR-GAL4 ^1-3. استخدام اثنين من الموسومة GFP علامات غشاء يسمح لتصور حدود الخلية في انخفاض كثافة الضوء. هذا يقلل من تلف الأنسجة وphotobleaching من على التعرض المتكرر للموجات عالية الطاقة، مما يتيح زيادة معدل الإطار، ومدة الفيلم. لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، تأسست UAS-DCR-2 أيضا في خط الطيران الثانية ^8.

في التحديث الثالث من البروتوكولات السابقة، وصفت تلاعب التصوير أسهل أن يتم تجميعها بسهولة في معظم المختبرات. هذا الجهاز يغني عن اشتراط أن يكون لها ص التصوير المتخصصةIG الناتجة عن "آلة متجر" جامعة أو خدمة مماثلة. هذا تلاعب التصوير مماثلة لتلك التي تستخدم لصورة العذراء الأنسجة الأخرى ^9،10.

المقدمة هنا هي الخلية الحية بروتوكول التصوير البسيطة التي يمكن استخدامها لتقييم مباشرة أحداث التخلق التي تسهم في الزخرفة العين من ~ 17-42 ساعة بعد تشكيل puparium (ساعة APF). على وجه التحديد، هذا البروتوكول يتيح احدة لتحديد الآثار المترتبة على تعديل التعبير الجيني خلال تطوير العذراء.

Protocol

ويبين الشكل 3 ملخصا لإجراء التجارب.

1. إعداد الأنسجة

1. لتحديد عواقب التعبير معدلة من الجينات في المصالح، وإنشاء الصليب التالية في مكررة والحفاظ على درجة حرارة 25 درجة C: UAS-التحوير (ذكور) X-GMR GAL4. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. + / SM5-TM6b (الإناث البكر) ملاحظة: للحصول على السيطرة الأنسجة عبر UAS-lacZ الذكور GMR-GAL4. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: إناث GFP. β غالاكتوزيداز يولد عدم وجود عيوب في سلوك الخلية في شبكية العين.
2. لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، عبر UAS-رني الذكور إلى GMR-GAL4، UAS-DCR-2. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. + / SM5-TM6b الإناث البكر.
   ملاحظة: العيوب العرضية في سلوك الخلية في الشبكية التعبير لوحظت خارج الرحم DCR-2 (لا تظهر البيانات). ويوصى اليقظة في حالة استخدام هذا النهج.
3. Sالمنتخب الأبيض قبل الشرانق من التراكيب الوراثية المناسبة ومكان في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إذا الشرانق التعبير عن DCR-2، حدد الشرانق إما ذكرا أو أنثى: التعبير عن UAS-DCR-2، وهو إدراج على كروموسوم X، هو أقوى في الذكور. الشرانق يجب بالغت في 0 ساعة APF قبل تصبغ في حالة العذراء - الغدد التناسلية للذكور واضحة كما الكرات شفافة كبيرة على الجانبين الجانبية للخادرة (حوالي ثلث من الخلفي).
4. احتضان أنابيب microcentrifuge تحتوي على الشرانق، في بلاغ البلاستيك مربع نظيفة في 25 ° C. لمنع جفاف مكان الشرانق قطعة 10 سم ² من الأنسجة، وينقع في الماء المقطر، في مربع تلميح.
   ملاحظة: إذا كانت الرطوبة في مربع طرف تصبح مرتفعة جدا قد تصبح حالة العذراء فطير ويصعب تشريح في الخطوات اللاحقة.
5. احتضان لمدة الوقت المناسب. لالتقاط السلوكيات الخلية المرتبطة الزخرفة العين، وإعداد الشرانق للتصوير في حوالي 17 ساعة APF، 20 ساعة APF أو 24 ساعة APF. انظر ممثل النتائج لمزيد من المناقشة في حين لوحظ السلوكيات خلية معينة أفضل.
6. ضع قطعة من الشريط على الوجهين الطازج على طبق تشريح sylgard الأسود. ضع الجانب خادرة، الظهرية يصل، مع رئيس خادرة انضمت إلى الوجهين الشريط (الشكل 1A) وليس محاولة التمسك الصدرية ومناطق البطن من خادرة إلى الشريط على الوجهين. مع ملقط رفع بعناية وإزالة الغطاء الخيشومي لفضح رئيس العذراء. المسيل للدموع على طول الجانب من حالة العذراء لفضح منطقة حول عين واحدة.
7. بلطف إزالة خادرة من شريط لاصق. إذا بقيت ملتصقة خادرة، وتطبيق كمية صغيرة من الماء المقطر إلى تقاطع بين حالة العذراء والشريط لإضعاف التصاق.

2. تركيب

1. بناء صغير 15 مم ² الإطار من الورق النشاف وكمة ثقب في middlethat هو 5.5 ملم وقطرها (الشكل 1B). تزج في الماء المقطر ومكان فيوسط شريحة المجهر. باستخدام حقنة 30 سم مكعب، اخراج حلقة موحدة من الفازلين لتطويق إطار ورقة النشاف. تأكد من أن عصابة الفازلين أعلى هامشيا من عرض خادرة وأن قطر الدائري هو أقل هامشيا من عرض زلة غطاء.
2. إضافة حبة صغيرة من الفازلين مباشرة على الشريحة، في حفرة لكمات في ورقة النشاف (الشكل 1C) .Carefully ترتيب خادرة، على جانبها، بدعم من حبة الفازلين (1D الشكل).
3. وضع ساترة على رأس عصابة الفازلين بحيث إنها تجري اتصالات مع ظهارة فوق الظهارة العصبية العين (الشكل 1D). ضغط بلطف إعداد لختم ساترة ضد الفازلين وتوليد سطح التماس شقة صغيرة بين منطقة العين العذراء وساترة.

3. الإسفار التصوير

1. صورة إعداد العذراء باستخدامالمجهر الفلورسنت. كل القبض على 7 دقائق أقسام التسلسلية من خلال المجال قمية من الظهارة العصبية العين، في منطقة تقاطعات الملتصقة.
   ملاحظة: أ) أقسام مسلسل المناسبة وعادة ما تكون 4-5 في ض المكدس تتألف من 0.2 ميكرون ض الخطوات. ب) المخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفيفة وطيات، قد جعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور من مناطق واسعة من الأنسجة. بينما التصوير، ويمكن للمرء أن يجد جزء من مجال اهتمام أن تكون في التركيز، ومنطقة مجاورة ليكون خارج نطاق التركيز. يمكن أن تشمل قطرات صغيرة من الماء المقطر بين العين العذراء وساترة القضاء على بعض طيات النسيج الحادة ولكن ليس سمة طوبولوجيا تفاوت أقل ما يقال من المراحل المبكرة من العذراء التشكل العين. في هذه الحالات oversample الأنسجة من خلال توسيع ض المكدس حتى في التركيز يتم الحصول على شرائح للحقل بأكمله. ج) الحصول أقسام التسلسلية يجب على كل 7 دقائق تمكن الحية التصوير لمدة 3 إلى 4 ساعات من دون redu كبيرةction في شدة GFP مضان يمكن أن تكون ضارة جودة الصورة. -فترات زمنية أقصر قد يقلل من الوقت الإجمالي من التصوير.
2. يستمر التصوير لمدة 3 إلى 4 ساعات. لا تستخدم التركيز التلقائي وظيفة الوقت الذي يتوفر على العديد من المجاهر الفلورية منذ نمو العذراء وضخ الدملمف يتحرك الموقف من شبكية العين والحذر مطلوب كل 14-21 دقيقة إعادة تركيز. ملاحظة أن التصوير ما بعد 4 ساعات قد تبطئ أو المماطلة التشكل من العين.
3. استخدام برامج إزالة التفاف المناسب للحد من خلفية وتعزيز النقيض من الصور قسم التسلسلية. لكل ملف ض المكدس، نفذ ما يلي في برنامج LAS AF (انظر جدول المواد): انتقل إلى لوحة الأدوات، حدد 3D إزالة التفاف وانقر فوق تطبيق.
4. توليد أقصى قدر من الإسقاط (MP) صورة لكل ملف كومة deconvoluted: انتقل إلى لوحة الأدوات، حدد 3D الإسقاط وانقر فوق تطبيق.
   ملاحظة: قد تفشل الخوارزمية الإسقاط القصوى لتوليد موحدةلاي في التركيز على الصورة لالأنسجة التي تم oversampled. ويرد وهناك تقنية لشحذ مناطق خارج نطاق التركيز في الخطوة 5.2.

4. ما بعد التصوير العذراء الانقاذ والنمط الظاهري التأكيد

1. لمعالجة ما إذا تم إدخال القطع الأثرية أو خادرة أذى أثناء التصوير، وإزالة بعناية خادرة من تلاعب التصوير: باستخدام ملقط إزالة ساترة ونقل خادرة إلى قارورة نظيفة من المواد الغذائية. يخزن في درجة حرارة الغرفة أو 25 ° C حتى يظهر الطاير الكبار.
2. تدرس بعناية النمط الظاهري من العين الكبار ومقارنة لعيون الذباب الكبار الناشئة عن الصليب ذبابة الأصلي.

تجهيز 5. صورة

1. التلقائي محاذاة الصورة:
   ملاحظة: سوف الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة التحول والنمو في جميع مراحل عملية التصوير. ونتيجة لذلك، تجمع مراكز الصور في نقاط زمنية متتالية قد لا تتوافق مع نفس النقطة في الأنسجة ذبابة الفاكهة. وبالإضافة إلى ذلكالقرص شبكية العين بأكمله يدور حول 30 درجة بين ~ 21 و 23 ساعة APF. لتسليط الضوء على السلوكيات خلية فردية والحد من الانحرافات الناجمة عن النمو العضوي، محاذاة كل MP image.While هذا لا يمكن أن يؤديها يدويا، وبرامج تحرير الصور المستخدمة هنا (انظر جدول المواد) وقد بنيت في الخوارزميات التي يمكن تسريع هذه العملية.
   1. من علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية، مخطوطات المفتوحة والملفات تحميل مختارة في المكدس.
   2. استيراد ملفات الصور النائب في لوحة الطبقات تحميل واختر موافق. تأكد من أن محاولة خيار الصور المصدر إلى محاذاة تلقائيا لم يتم تحديد.
      ملاحظة: إذا تم تحديد هذا الخيار، فإن البرنامج قد يستخدم خوارزمية المحاذاة أن يشوه بيانات الصورة.
   3. بمجرد تحميل جميع ملفات MP إلى جزء الطبقات، تأكد من أن جميع الصور هي حسب الترتيب الزمني بحيث أقرب نقطة زمنية هي في الجزء العلوي من طبقة المكدس. إذا كانت الطبقات ليست في الصحيح النظام، وسحب وإسقاط لهم حتى يتم أمروابشكل صحيح.
   4. تحديد الطبقات لصناعة السيارات في محاذاة من علامة التبويب تحرير من القائمة الرئيسية. اختر تعديل وانقر فوق موافق.
   5. إذا فشلت خوارزمية لصناعة السيارات في محاذاة لتوجيه الإطارات إلى نقطة محورية ذات الصلة، إجراء تعديلات طفيفة باستخدام أداة التحريك.
2. شحذ مركب:
   ملاحظة: خارج نطاق التركيز مناطق صورة النائب الأولية يمكن شحذ التي كتبها 'الزراعة' كومة المقابلة deconvoluted في مجال البرمجيات LAS AF. الاقتصاص ملف كومة يسمح احد لتقييد فترة من كومة ض أن تخضع لخوارزمية الإسقاط القصوى يدويا.
   1. موقع الدالة المحاصيل في لوحة الأدوات (ضمن علامة التبويب عملية). تقييد يدويا شرائح الأولية والنهائية بحيث أنها تغطي فقط الحزام التصاق داخل المنطقة في البداية خارج نطاق التركيز. انقر فوق تطبيق لإنشاء ملف كومة الجديد الذي هو الأمثل لهذه المنطقة.
   2. توليد إسقاط الحد الأقصى الجديد لكومة الأمثل محليا وتصدير كملف TIFF.
   3. في الالبريد تحرير الصور البرمجيات (انظر جدول المواد)، مخطوطات المفتوحة (الموجود في علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية) وحدد تحميل الملفات إلى المكدس.
   4. استيراد الأولي ملف الصورة MP وملف النائب الأمثل محليا لنقطة زمنية معينة في لوحة الطبقات تحميل واختر موافق. تأكد من أن محاولة خيار الصور المصدر إلى محاذاة تلقائيا لم يتم تحديد.
   5. تحديد كل الطبقات في الطبقات جزء ثم اختيار الطبقات لصناعة السيارات في مزيج (الموجود في علامة التبويب تحرير من القائمة الرئيسية) لإخفاء المناطق المناسبة من الصورتين تلقائيا، مما أسفر عن موحد في مجال التركيز في شبكية العين. حفظ هذه الصورة المركبة كملف TIFF.
   6. كرر الخطوات من 5.2.1 خلال 5.2.5 لجميع الصور النائب دون المستوى الأمثل.
3. مزيد من التعديلات: تدوير، والمحاصيل، وضبط مستويات من الطبقات الفيلم:
   1. مع كل من الطبقات المحددة، استخدم أداة التحويل (تحرير> تحويل حر) لتدوير الصور بحيث محور الظهري البطني من شبكية العين هو الانحيازإلى ذ محور الإطار الفيلم.
   2. إذا لزم الأمر، استخدم أداة الاقتصاص للحد من مجال الرؤية إلى الحجم المطلوب والشكل.
   3. استخدام تعديل مستوى (الإطارات الفردية) للمساعدة في تعزيز التباين بين غشاء الخلية وخلايا الجسم.
   4. لأغراض الأسلوبية والتأكيد على السلوكيات خلية معينة، وإدخال اللون كاذبة لتسليط الضوء على النقاط المثيرة للاهتمام في كل إطار.
4. الرسوم المتحركة: تحويل الصور إلى الفيلم:
   1. فتح جزء الرسوم المتحركة من علامة التبويب ويندوز من القائمة الرئيسية. حدد جعل إطارات من طبقات من القائمة الموجودة في الزاوية اليمنى العليا من جزء الرسوم المتحركة.
   2. لاحظ أن طبقات تضاف إلى جزء الرسوم المتحركة في ترتيب تسلسلي بدءا من أسفل المكدس. لعكس ترتيب إطارات، أولا تحديد كافة الإطارات ثم حدد عكس إطارات من قائمة لوحة الرسوم المتحركة.
   3. تحديد الإطار الزمني تأخير لكل إطار باستخدام القائمة المنسدلة أدناه إطار الإبهامالأظافر.
      ملاحظة: تأخير الإطار لأفلام 1-4 المقدمة في هذه الورقة هو 0.8 ثانية.
   4. من علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية، وفتح التصدير وتحديد تجسيد الفيديو. اختر تصدير QuickTime تحت خيارات الملف وتحديد تنسيق الفيديو المطلوب. تحت تجعل تحديد خيارات معدل الإطار إلى مخصص، أدخل معدل الإطار 15، ثم انقر تجعل.

النتائج

يعيش التصوير من العين العذراء هو استراتيجية ناجحة لمراقبة سلوكيات الخلية التي تساهم في الزخرفة من الظهارة العصبية. دور بروتينات معينة يمكن تقييمها بسهولة عن طريق التعبير عن الجينات المحورة التي تعدل مستويات البروتين خلال تطوير العين. للقيام بذلك GMR-GAL4 يستخدم ل?...

Discussion

وصف للتنمية البرية من نوع (أعلاه) يشكل الأساس لمقارنات بين الأحداث الزخرفة في رني أو الأنماط الجينية overexpression. مقارنات التنمية الأنسجة الحية لا تقدر بثمن عند تحديد بالضبط التي تنظم سلوك الخلية عن طريق بروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، وليس وصفها هنا، تصوير الخلايا ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b	Available on request from authors
Scotch double stick tape	3M	665
Black Sylgard dissection dish			Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize
Sylgard	Dow Corning	SYLG184
Sylgard (Black)	Dow Corning	SYLG170
Glass petri dish	Corning	7220-85
25 x 75 x 1 mm glass microscope slide	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40 mm glass coverslip	VWR	48393-172
Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3mm Chromatography Paper	Fisher Scientific	05-713-336
Vaseline	Fisher Scientific	19-086-291	Or purchase at local pharmacy.
30 ml syringe	Fisher Scientific	S7510-30
Leica TCS SP5 DM microscope	Leica Microsystems
LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software	Leica Microsystems