JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Abstract

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the “pilus”5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

Introduction

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer1. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet11. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression12. Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host’s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis13. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease14. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion15. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer1. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes.

Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains14. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili.

We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle10.

Protocol

1. ه. بيلوري النمو في مختلف الظروف من الحديد الشواغر والمشارك الثقافة مع خلايا الإنسان الظهارية المعدة

  1. حدد H. بيلوري سلالة PMSS1 لهذه الدراسات لأنه يحتوي على حالها جزيرة المساعدة النقدية المرضية ويعبر عن نوع عمل نظام إفراز الرابع. الاستفادة أيضا قفص متحولة إسوي (PMSSI Δ قفص) كوسيلة لمراقبة سلبية. تنمو البكتيريا على لوحات TSA تستكمل مع 5٪ الأغنام الدم (لوحات أجار الدم) لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2.
    ملاحظة: إعداد الكواشف وتجميع المواد على النحو المبين في الجدول المواد والمعدات. يتم سرد تركيزات النهائية لكل كاشف بين قوسين.
  2. تتخلص من البكتيريا لوحة باستخدام القطن ذات الرؤوس قضيب معقمة وتلقيح في تعديل مرق البروسيلا المحضرة من المكونات (انظر الجدول المواد والمعدات) وتستكمل مع الكولسترول. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 37° C في هواء الغرفة تستكمل مع 5٪ CO 2 مع اهتزاز عند 200 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة).
    يستخدم الكولسترول في مكان مصل بقري جنيني يرجع ذلك إلى حقيقة أن المصل معقد، ملاحظة: تحتوي على مصادر عديدة من المواد الغذائية مثل الحديد الهيم الذي يسبب تقلبات في النتائج.
  3. في يوم من زراعة البكتيرية، البذور AGS الخلايا الظهارية في المعدة البشرية (آي تي سي سي CRL-1739) على بولي D يسين coverslips المعالجة في لوحات 12-جيدا (حوالي 1 × 10 5 خلايا لكل بئر).
  4. في اليوم التالي، وتمييع الثقافات البكتيرية إلى OD600 من 0.3 في تعديل مرق البروسيلا وحدها أو تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3، 200 ميكرومتر dipyridyl (أ خالب الحديد الاصطناعية)، أو 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3. احتضان هذه الثقافات لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية في هواء الغرفة تستكمل مع 5٪ CO 2 مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  5. البكتيريا الطرد المركزي في 1000 x ج لجمع الخلايا وإزالة supernatants قبل إعادة التعليق طن حجم مساو من جديد مرق البروسيلا تعديل تستكمل مع الكولسترول. قياس OD600 الثقافة (OD600 = 1.0 = 5.5 × 10 8 خلية / مل) وإضافة البكتيريا إلى الخلايا الظهارية في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 20: 1. إجراء التخفيفات التسلسلية والخلايا البكتيرية على لوحة لوحات أجار الدم لتقييم بقاء الخلية البكتيرية.
  6. احتضان ه. بيلوري وAGS الخلايا الظهارية في المعدة البشرية شارك الثقافات لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2 في ظروف ثابتة قبل تنفيذ المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) إعداد العينة.

2. SEM إعداد نموذج لتصور H. بيلوري CAG-T4SS بيلي

  1. إزالة H. بيلوري وAGS شارك الثقافات من طاف صب الحاضنة والثقافة (انقاذ لIL-8 ELISA). غسل بلطف ثلاث مرات مع الصوديوم 0.05 M عازلة كاكوديلات (الرقم الهيدروجيني 7.4). إصلاح عينات لمدة 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة في حل من 2.0٪ امتصاص العرق، 2.5gluteraldehyde٪، و 0.05 M الصوديوم عازلة كاكوديلات. بعد التثبيت الأولي، وغسل العينات ثلاث مرات مع الصوديوم 0.05 M عازلة كاكوديلات.
  2. إجراء تثبيت الثانوي باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم 0.1٪ بما يعادل 0.05 M الصوديوم عازلة كاكوديلات في اثنين خطوات متتابعة 10 دقيقة التثبيت. بعد تثبيت الثانوي، وغسل العينات ثلاث مرات مع الصوديوم 0.05 M عازلة كاكوديلات.
  3. بعد تثبيت الابتدائي والثانوي، يذوى العينات عن طريق الغسيل متسلسل مع زيادة تركيزات الإيثانول كما في الجدول 1.
  4. بعد الإيثانول الجفاف، نفذ ثلاثة يغسل متتابعة من ثاني أكسيد الكربون السائل. عينات الجافة ثم عند نقطة حرجة باستخدام آلة مجفف النقطة الحرجة عند درجة حرارة 31.1 درجة مئوية وضغط 1073 PSI.
  5. جبل coverslips على الألومنيوم SEM عينة بذرة والطلاء مع خط رفيع من الفضة الغروية على حافة عينة لتحقيق التأريض المناسب وتجنب فرض SEM أثناء التصوير.
  6. عينات معطف مع 5 نانومتر للالذهب والبلاديوم باستخدام آلة معطف تفل لزيادة عينة إشارة الإلكترون الثانوية وتأثير الحافة.

3. معلمات التصوير للتحليلات عالية الدقة SEM

  1. عرض العينات مع حقل الانبعاث الضوئي بندقية الإلكترون مجهر (FEG-SEM).
  2. صورة في وضع فراغ عالية على مسافة العمل من 5-10 ملم.
  3. تعيين الجهد المتسارع إلى 5 كيلو فولت.
  4. تحديد حجم البقعة إلى 2-2.5.
  5. إمالة العينة بين 15-25 درجة لتحقيق رؤية أفضل واجهة المضيف الممرض.
  6. أولويات التصوير البكتيريا الملتصقة إلى حواف الخلايا الظهارية للعرض عالية التكبير، كما يتم إثراء هذه المناطق من التفاعل المضيف الممرض للبكتيريا المكونة للالشعرة.

4. التحليلات الإحصائية في تقييم بيلي Quantifications

  1. تحليل H. بيلوري CAG-T4SS الشعرة باستخدام برنامج يماغيج لقياس عدد من الشعرة / خلية، وكذلك في المئة من خلايا اظهار مشعر PHEnotype في التعليمات أدناه.
  2. ملفات مفتوحة مجهرية في برنامج يماغيج. تحديد بيلي عن الهياكل التي تشكلت بين الخلية البكتيرية والخلية المضيفة، مع عرض موحد (10-13 نانومتر) وطول (60-150 نانومتر).
    ملاحظة: هيكل شعرة موجود على السلالات البكتيرية WT، ولكن غاب عن سلالات إسوي مثل Δ قفص سلالات متحولة، التي ترعى وتعطيل في جين ترميز أتباز كبير أن القوى نوع إفراز الرابع شعرة التجمع.
  3. معايرة أدوات القياس عن طريق رسم خط باستخدام أداة خط مستقيم ثم النقر على علامة التبويب "تحليل". تحديد "جدول تعيين" من القائمة المنسدلة وأدخل القيمة شريط التكبير في المربع المسمى "المسافة المعروفة" وتعيين وحدة طول إلى الإعداد المناسب (نانومتر). انقر على "موافق".
  4. قياس CAG-T4SS الشعرة باستخدام أداة رسم خط مستقيم على طول أو عرض شعرة ثم اضغط على "السيطرة-M" لقياس كل شعرة. مراقبة مربع الحوار مع القيم المقاسة. تسجل هذه القيم أو نسخ ولصق في برنامج جداول البيانات.
  5. استخدام الطول والعرض ضعت من قبل المعلمات 24، ملامح التجاهل التي لا تناسب مكانة CAG-T4SS. ثم تحديد عدد بيلي على أساس القيم التي هي ضمن انقطاع 10-13 نانومتر 60-150 نانومتر العرض والطول.
  6. تحليل الكمي لبيلي إحصائيا كتبها t الطالب اختبار ثنائي الطرف باستخدام برنامج GraphPad بريزم.

5. اختياري: تقييم IL-8 إفراز لربط مع شعرة الإنتاج

  1. باستخدام supernatants من الخطوة 2.1، إجراء IL-8 ELISA في تعليمات الشركة الصانعة مع عدة (انظر الجدول المواد والمعدات).
  2. تحليل IL-8 تفرزها الخلايا المضيفة وحساب المئة IL-8 الاستقراء فيما يتعلق WT PMSS1 نمت في المتوسط ​​وحده. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ثنائي الطرف اختبار ر الطالب باستخدام GraphPad بريزم ذلكftware.

النتائج

في هذا التقرير، لقد أثبتنا أن ظروف متفاوتة توافر الحديد لديها القدرة على تعديل H. بيلوري CAG-T4SS شعرة نشوء حيوي في واجهة الممرض المضيف. عندما مثقف في المتوسط ​​وحده، H. بيلوري تشكل ما معدله 3 بيلي / الخلية. عندما H. ويزرع في بيلوري الحديد تستنزف الظروف (ب...

Discussion

الحديد هو المغذيات الدقيقة الأساسية لمعظم أشكال الحياة، بما في ذلك مسببات الأمراض البكتيرية. في محاولة للحد من قابلية غزو الكائنات الحية الدقيقة، ويستضيف الفقاريات بتنحية الحديد المغذيات في عملية تعرف باسم "مناعة الغذائية" (18). ردا على ذلك، تطورت مسببات ا...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This research was supported by the Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 and the CTSA award UL1TR000445 from the National Center for Advancing Translational Sciences. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent official views of the National Center for Advancing Translational Sciences or the National Institutes of Health. Scanning electron microscopy experiments were performed in part through the use of the VUMC Cell Imaging Shared Resource, supported by NIH grants CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 and EY08126.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L)Sigma70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L)Sigma70174
Yeast extract (2 g/L)Sigma92144
Dextrose (1 g/L)SigmaD9434
Sodium chloride (5 g/L)Thermo FisherS271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L)Life Technologies12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM)Sigma157740-100G
Dipyridyl (200 uM)SigmaD216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L)Life Technologies10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous)Electron Microscopy Sciences15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous)Electron Microscopy Sciences16220
Sodium cacodylate (0.05 M)Electron Microscopy Sciences12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous)Electron Microscopy Sciences19150
Ethanol (absolute)SigmaE7023
Colloidal silver paintElectron Microscopy Sciences12630
SEM sample stubsElectron Microscopy Sciences75220
CoverslipsThermo Fisher08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kitR&D SystemsD8000C

References

  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
  3. Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
  4. Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
  5. Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
  6. Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
  7. Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
  8. Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
  9. Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17 (2012).
  10. Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
  11. Cover, T. L., Peek, R. M. Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
  12. Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420 (2013).
  13. Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
  14. Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
  15. Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M., Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
  16. Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
  17. Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
  18. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  19. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
  20. Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
  21. Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
  22. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  23. Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
  24. Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
  25. Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

93 CAG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved