plusTipTracker باستخدام برنامج لقياس ديناميكية في أنيبيب<em&gt; القيطم المورق</em&gt; المخاريط النمو

Summary

و، حزمة برمجيات المصدر المفتوح القائمة على MATLAB، plusTipTracker، ويمكن استخدامها لتحليل سلسلة صورة-fluorescently المسمى + نصائح لقياس ديناميات أنيبيب.

Abstract

أنيبيب (MT) زائد تتبع نهاية البروتينات (+ نصائح ل) تعريب لتزايد بالإضافة إلى الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف وتنظيم ديناميات MT ^1،2. واحدة من النصائح الأكثر معروفة وتستخدم على نطاق واسع + لتحليل ديناميات MT-ملزم هو نهاية البروتين، EB1، الذي يربط جميع MT زائد نهايات المتزايد، وبالتالي، هو علامة لMT البلمرة ^1. وقد استخدمت العديد من الدراسات من السلوك EB1 داخل مخاريط النمو تستغرق وقتا طويلا وبمساعدة الحاسوب متحيزة وطرق ناحية تتبع لتحليل فردي النظام التجاري المتعدد الأطراف ^1-3. نهجنا هو قياس المعلمات العالمية لديناميات MT باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker ^4، بعد اكتساب عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني ^5. هذا البرنامج هو ومفتوحة المصدر، حزمة سهلة الاستعمال تستند MATLAB الذي يجمع بين الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. هنا، نقدم بروتوكول لاستخدام plusTipTracker لتحليل + المذنبات TIP fluorescently المسمى في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا البرنامج لوصف ديناميات MT في مختلف أنواع الخلايا ^6-8.

Introduction

الهدف من هذه الطريقة هو الحصول على المعلومات الكمية المتعلقة أنيبيب (MT)، بالإضافة إلى تتبع نهاية البروتين (+ TIP) ديناميات يعيشون في مخاريط النمو. MT + النصائح هي مجموعة من البروتينات التي لتوطين زائد الغايات من النظام التجاري المتعدد الأطراف ^9،10. أنها تؤدي مجموعة من الوظائف لتنظيم المعلمات من عدم الاستقرار الديناميكي MT ^11، بما في ذلك معدلات البلمرة، كارثة، والإنقاذ. واحد الطريقة المستخدمة جيدا لتحليل ديناميات MT هو تتبع سلوك EB1 TIP +، الذي يربط خصيصا لتزايد MT زائد ^1،12 ينتهي. ومن المعروف EB1 لتجنيد عدة بروتينات أخرى لتزايد MT زائد ينتهي ^13،14، ومؤخرا تم تأسيس كعامل MT النضج ^15، وتعزيز كلا MT النمو وتردد كارثة ^15،16.

وقد استخدمت العديد من الدراسات ديناميات MT داخل مخاريط النمو طرق ناحية تتبع لقياس التغيرات في ديناميات EB1-GFP مع مرور الوقت ^1-3، وEB1 localizatiإلى MT زائد نهايات يمكن أن تستخدم كعلامة للMT البلمرة. ومن المزايا الرئيسية لدراسة المذنبات EB1-GFP كبديل للنمو MT هي أن ديناميات MT يمكن قياسها حتى في مناطق التداخل MT كبير. في حين أن طريقة المذنبات EB1-GFP تتبع ناحية قدمت معلومات مفيدة إلى MT السلوكيات ^1-3، فمن وقتا طويلا ويمكن أن يكون متحيزا. بالإضافة إلى ذلك، كما هي السلوكيات الشاذة النمو مخروط الأرجح نتيجة التحولات الدقيقة في ديناميات هيكل الخلية وتحليلها فقط مجموعة فرعية صغيرة من النظام التجاري المتعدد الأطراف (عادة اللازمة عند اليد تتبع) قد يغيب عن معلومات مهمة.

وبالتالي، فإننا قياس المعلمات ديناميات MT العالمية باستخدام حزمة البرامج، plusTipTracker ^4، بعد الحصول على عالية الدقة، والصور الحية من المعلمة EB1 في تربيتها مخاريط النمو الجنيني ^5. هذا البرنامج، وضعت في مختبر Danuser، وقد استخدم في العديد من الدراسات التي تميز ديناميكية MT في مختلف أنواع الخلايا ^6-8. وهو مفتوح المصدر، لنادية إيه، الحزمة استنادا MATLAB التي تشمل الكشف الآلي، وتتبع، والتصور، والتحليل للأفلام من fluorescently المسمى + النصائح. وهناك قائمة طويلة من تحسب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة هي MT مسار النمو سرعة (في / ميكرون دقيقة)، مسار النمو عمر (ثانية)، وطول مسار النمو (في ميكرون). البرنامج يمكن تحميلها مباشرة من موقع Danuser مختبر (تحت "البرنامج"). في حين مختبر Danuser تدعم حاليا واجهة تعليقات أحدث ل + تحليل تتبع TIP، والتي يتم تضمينها في حزمة البرمجيات دعا يو المسار 2.0، ستبقى الأصلي، قائمة بذاتها البرمجيات المتاحة. خوارزميات الكامنة بين البرنامجين هي نفسها (على الأقل عام 2014)، مع وجود اختلاف في واجهة وتحليل النواتج. بالنسبة للمستخدم المبتدئ مع قليل MATLAB و / أو تحليل الحسابية جتربةسينعقد، plusTipTracker ديه المزيد من الميزات سهلة الاستخدام، بما في ذلك الآلية مخرجات المعلمة الإحصائية.

هنا، نحن تصف الخطوات لتحليل الصور من ديناميات EB1-GFP في تربيتها القيطم المورق مخاريط النمو. تم استخدام هذا البروتوكول في ورقة حديثة دراسة ديناميات MT ^17. انظر أيضا لوري وآخرون 2012 ⁵ للحصول على تعليمات مفصلة عن مخاريط النمو زراعة معربا عن EB1-GFP. في حين أن هذه الورقة تركز في المقام الأول على دراسة ديناميات EB1-GFP في مخاريط النمو، نفس البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع الخلايا الأخرى ^17. لجميع أنواع الخلايا، يجب أن يكون الفاصل الزمني بين الإطارات بين 0.5-2 ثانية لتتبع الأمثل + TIP. فترة زمنية تصل إلى 4 ثواني بين الإطارات هو ممكن، ولكن هذه النتائج زيادة الفاصل الزمني في تتبع أخطاء إضافية.

Protocol

وتهدف هذا البروتوكول والفيديو لتكون بمثابة رفيق إلى الورقة الأصلية التي تصف مجموعة من البرامج في مزيد من التفاصيل ^4، وكذلك التقرير الفني الذي يأتي مع تحميل البرمجيات على الموقع Danuser مختبر. ويتم تشجيع القراء لمراجعة هذه الوثائق بعناية إذا كانت هناك أسئلة إضافية بشأن استخدام البرنامج.

1. قبل تحليل الصور

1. تحويل كل فيلم الوقت الفاصل في سلسلة من TIFF (تنسيق ملفات الصور ذات الكلمات الدلالية) ملفات الصور. إذا كان هناك مخاريط النمو متعددة / الخلايا في فيلم معين، المحصول الأول كل مخروط النمو / خلية لخلق تسلسل الصور الخاصة به.
   ملاحظة: هذا ليس من الضروري، كما يمكن اختيار مناطق من المصلحة الفردية (ROI) ضمن plusTipTracker. ومع ذلك، باستخدام أبعاد الصورة أصغر يزيد من سرعة المعالجة الحسابية، لذلك يوصى هذه الخطوة إذا كان هناك مساحة فارغة كبير في الصورة.
2. حفظ كل سلسلة TIFF في تلقاء نفسهامجلد يسمى "الصور" ضمن مسار التي تم تعيينها MATLAB للوصول (لاحظ أن "الصور" حساس لحالة الأحرف). لإضافة مسار جديد، انتقل إلى الدليل الملفات ذات الصلة في الإطار "المجلد الحالي"، انقر بزر الماوس الأيمن على أيقونة دليل، وحدد "إضافة إلى مسار - مختارة المجلدات والمجلدات الفرعية". من المهم أن يتم إضافة مجلد البرامج plusTipTracker إلى مسار، كذلك.

2. plusTipGetTracks

ملاحظة: الخطوة الأولى في تحليل الصور هي للكشف عن المذنبات-EB1 GFP، ربط المذنبات في المسارات، وتحديد معايير ديناميات أنيبيب. يتم الحصول على هذا مع "plusTipGetTracks" القيادة ^4.

1. لبدء تحليل، تطبيق مفتوح MATLAB واكتب "plusTipGetTracks" في إطار الأوامر. سيؤدي هذا إلى مربع حوار جديد لتظهر.
2. انقر على "إقامة مشروعات جديدة" واختيار واحد (أو موره) من TIFF صورة سلسلة السابقة عن طريق اختيار "الصور" المناسبة مجلد (أو الدلائل التي تحتوي على "صور" المجلدات). عند الانتهاء من هذه الخطوة، دليل الملف (roi_1) سيتم إنشاء (في نفس المجلد الذي يحمل "صور") التي سوف تحتوي على ملفات البيانات في المستقبل. ملاحظة: "تعيين مشروعات جديدة" خطوة يمكن أن تكتمل في وقت مبكر، خلال جلسة منفصلة.
3. سوف تظهر نافذة جديدة: "تحديد المضلع، انقر بزر الماوس الأيمن على النقطة الأخيرة، وانقر على 'إنشاء قناع". انقر على "OK". وبعد ذلك يتم عرض الصورة الأولى من سلسلة الصورة المحددة. استخدام الماوس للنقر وإنشاء المضلع الذي يشمل مجمل مخروط النمو. انقر نقرا مزدوجا فوق الماوس لإغلاق المضلع.
4. مرة واحدة تم إغلاق المضلع، سوف تظهر مربع حوار: "هل تريد تحديد العائد على الاستثمار أخرى؟" إذا كانت الصورة لديه مخروط النمو لتحليل آخر، حدد "نعم". ق غير ذلكالمنتخب "لا".
5. تحديد المشاريع التي سيتم تحليلها فورا. انقر على "تحديد المشاريع" وحدد المجلد (roi_X) لتحليل.
6. ستظهر شاشة listSelectGUI. حدد المشروع (ق) من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على "OK". اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق "حفظ".
7. حدد "الكشف"، "تتبع"، و "ما بعد المعالجة". مرة واحدة تم إجراء هذه الاختيارات، فإن الجانب الأيمن من مربع الحوار أصبح شكلي. تكوين كل خيار.
   1. وتستخدم هذه المعايير لربط الكشف عن المذنبات في المسارات MT. وترد تفاصيل لاختيار هذه المعايير تحكم لتتبع على صفحات 9-10 من التقرير الفني PDF التي ترافق حزمة برامج التحميل؛ قراءة هذا التقرير بعناية إذا واجهت المشاكل. لأغراض تتبع المذنبات EB1-GFP في Xenopلنا المورق مخاريط النمو، واستخدام إعدادات تتبع التالية: ابحث عن أنصاف المدى المدى (بكسل) 5-12، الحد الأدنى للطول المسار الفرعية (إطارات) 3. أقصى طول الفجوة (إطارات) 8؛ ماكس فاكتور انكماش 0.8، ماكس زاوية الأمام 50، ماكس زاوية الخلف 10، تذبذب الشعاع 2.5. وتظهر هذه الإعدادات في الشكل 1.
   
   ملاحظة: يتم تعيين انكماش ماكس فاكتور للحد من عدد من "الثغرات المتخلفة" الكشف، إذ أن "الثغرات المتخلفة" ليست مفيدة لتحليل في سياق مخاريط النمو، نظرا للظروف مزدحمة والأخطاء المحتملة في الروابط المسار. بالإضافة إلى ذلك، يتم تعيين كل من زاوية ماكس الأمام وكذلك تذبذب الشعاع عالية نسبيا، والنظام التجاري المتعدد الأطراف مخروط النمو تظهر translocations صغيرة متكررة بالإضافة إلى معدلات النمو والإنكماش، وزيادة هذه إعدادات التحكم تسمح هذه الحركة المتزايدة خلال خطوة الربط.
   1. ملء تجهيز بوست إعدادات تبعا لإعدادات محددة الحصول على الصور المطلوبة.
8. بمجرد تكوين الإعدادات، انقر على "ابدأ". سيتم تشغيل البرنامج أيهما إعدادات تم اختيارها. قد يستغرق هذا دقائق إلى ساعات، اعتمادا على عدد من المشاريع المختارة وأحجامها. يعرض إطار الأوامر الوقت المتبقي المقدر لكل وظيفة. عند اكتمال الخطوة plusTipGetTracks، وإطار الأوامر سيتم عرض "انتهى!"
   ملاحظة: هناك قائمة طويلة من الآن تم احتساب معايير محددة للديناميات MT بواسطة هذا البرنامج (انظر المرجع 4 لمزيد من التفاصيل)، ولكن لتحليل ديناميات MT في مخاريط النمو، المعلمات الأكثر فائدة لدراسة MT هي مسار النمو سرعة (في ميكرون / دقيقة)، عمر مسار النمو (في ثوان)، وطول مسار النمو (في ميكرون).

3. plusTipSeeTracks

ملاحظة: الآن وبعد أن المسارات أنيبيب تم تحديدها، فإن وظيفة "plustipSeeTracks" يستخدم لمسار التصور ^4. هذه الوظيفةيمكن أن توفر نواتج متعددة لتصور، بما في ذلك الخرائط الديناميكية MT المكانية والأفلام السرعة، ولكن هنا، يكون التركيز فقط على استخدام "الأفلام المسار" لعرض المسارات MT فرضه على الصور مخروط النمو. بينما يمكن plusTipGetTracks تحليل الأفلام متعددة في وقت واحد، يمكن plusTipSeeTracks تحليل فيلم واحد فقط في المرة الواحدة.

1. اكتب "plusTipSeeTracks" في إطار الأوامر.
2. بعد تحميل مربع الحوار، انقر على "المشروع أختر". حدد الدليل الأم يحتوي المشروع على تصور وانقر على "تحديد المجلد". سوف تظهر نافذة جديدة: "حدد المشروع الذي تريد تصور". اختيار ملف لتصور وانقر على "OK".
3. بعد ذلك، انقر على "حدد المحفوظة العائد على الاستثمار". انتقل إلى نفس المجلد roi_X بوصفها واحدة المختارة في الخطوة السابقة ثم حدد الملف المسمى "roiYX".
4. انقر على "تحديد دليل إخراج" لتعيين ثهنا سوف MATLAB حفظ الملفات التصور المسار. ملاحظة: نوصي باستخدام نفس المجلد الذي يحتوي على بقية البيانات.
5. حدد "جعل المسار فيلم" وسوف تظهر شاشة عرض كل plusTipGetTracks المسارات تحسب من المذنبات TIP +. هذه الخطوة يحفظ سلسلة زمنية تتبع في شكل فيلم، في ملف "allTracks_X_X_X". هناك خيار لإنقاذ الفيلم باعتباره AVI، وإلا فإن التنسيق الافتراضي هو كملف Quicktime.mov.

4. plusTipGroupAnalysis

ملاحظة: يتم استخدام هذه الدالة النهائية لإنشاء مجموعات من الأفلام لتحليل ومقارنة MT المعلمات مسارها.

1. اكتب "plusTipGroupAnalysis" في إطار الأوامر. لتحديد المجموعات يدويا للمقارنة، الأول دي حدد "مجموعة السيارات من التسلسل الهرمي". ثم، انقر على "تحديد المشاريع". انتقل إلى الدلائل الأصل تحتوي على جميع المجلدات roi_Xلتحليل.
2. ستظهر شاشة listSelectGUI. تحديد كافة المشاريع التي تدرج في مجموعات من الجانب الأيسر من الشاشة ونقلها إلى الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على "OK". اختيار موقع لحفظ القائمة المشروع ثم انقر فوق "حفظ".
3. سوف تظهر نافذة: "الرجاء تحديد المجموعة الأولى من القائمة". انقر على "OK". سوف نافذة listSelectGUI عرض مرة أخرى. هذا الوقت، حدد فقط تلك الملفات التي تتوافق مع المجموعة الأولى التي ينبغي تجميعها معا. انقر على "OK".
4. ثم، أدخل اسم المجموعة، وانقر على "OK". سوف تظهر نافذة: "حدد مجموعة أخرى؟" الإجابة وفقا لذلك وتستمر اختيار المجموعات. سوف تظهر نافذة: "حدد موقعا لحفظ قائمة مجموعتك". انتقل إلى الموقع وانقر على "حفظ".
5. انقر على "اختر الناتج دليل" لاختيار المجلدات حيث الناتج ستكونالمخزنة.
6. تحديد أي نوع من التحليل لإجراء مجموعة - سواء المسارات MT يجب تجميع لكل مجموعة أو لكل خلية التحليل يجب أن يتم تنفيذ. تم تعيينها بالفعل الاختبارات الإحصائية الموصى بها. لتشمل جميع المسارات في التحليل، وعدم اختيار "إزالة المسارات في بداية / نهاية فيلم". خلاف ذلك، وجود هذا الإطار المحدد يزيل أي مسارات النمو MT التي هي في العملية حيث يبدأ الفيلم أو ينتهي.
7. بعد إجراء تحليل اختيار المجموعة، حدد "قارن مجموعات".

النتائج

باستخدام هذا البرنامج كما هو موضح هنا سيقدم عدة ملفات من المعلومات التي قياس ديناميكية TIP + في الخلايا الحية.

وplusTipGetTracks ظيفة يحدد المسارات (باستخدام إعدادات سبيل المثال هو موضح في الشكل 1)، ثم تقدم المعلمات بشأن المسارات T...

Discussion

يوفر PlusTipTracker واضحة، واجهة المستخدم الرسومية بسرعة وتلقائيا للكشف مرئية تقريبا جميع المذنبات EB1-GFP في زنزانة أو النمو مخروط، ربط المذنبات في المسارات، وحساب المعلمات MT. وذكرت وغيرها من المطبوعات تصميم أنواع مماثلة من البرامج (على سبيل المثال، ماركس وآخرون. تستخد...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
plusTipTracker software	Danuser Lab	http://lccb.hms.harvard.edu/software.html	This software may be hosted by another website in the future.  If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site.
MATLAB software	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/