نموذج الزرد ممكن من مرض الكلى المتعدد الكيسات: ضربة قاضية لل<em&gt; wnt5a</em&gt; أسباب الخراجات في الكلى اسماك الزرد

Summary

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Abstract

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع الزرد (دانيو rerio) الأجنة كنموذج لدراسة تطوير الكلى ومرض الكلى المتعدد الكيسات. وهناك العديد من المزايا لاستخدام الزرد كنموذج للحيوانات: جدوى دراسة التفاعلات الوراثية، والقدرة على استخدام العقاقير morpholinos (MO) للبروتين ضربة قاضية، وفرصة لفحص بسرعة أعداد كبيرة من الأجنة، وسهولة عرض الظواهر الجهاز في اليرقات ¹ الحية. وسليفة الكلوة هي الكلى الأول لتطوير في الفقاريات وهي وظيفية في الزرد اليرقات ^2. هيكل سليفة الكلوة الزرد مقارنة بسيطة نسبيا إلى الكلوة التالية الثدييات، والكلى الثالث والأخير لتطوير في الثدييات. نفرون هو وحدة عمل الكلى، مع كل الكلى البشرية تحتوي على ما بين 500،000-1،000،000 النيفرون ^3،4 وكل الكلى الماوس وجود ما يقرب من 13،000 النيفرون ^5، مما يجعل من الصعب مراقبة هيكل كليون واحد طن كلى الانسان أو الماوس. الزرد اثنين فقط النيفرون، ولكل كليون الزرد يحتوي على كافة المكونات الرئيسية وجدت في الكبيبة والأنابيب من الفئران والبشر ⁶ وأنواع الخلايا الكلوية المتخصصة مماثلة. بالمقارنة مع النماذج الفقاريات الأخرى مثل الضفدع، وكليون الزرد أكثر شبها نفرون الثدييات لأنه يحتوي على نظام مغلق ^7.

في السنوات الأخيرة، تم التسلسل الجينوم الزرد، والسماح للمقدمة واسعة من الأدوات الوراثية، والموارد متحولة واسعة، ومجموعات من خطوط مراسل المعدلة وراثيا في نماذج الزرد. أشكال سليفة الكلوة الزرد بين 12-72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ويمكن تصور بسهولة في الأجنة شفافة. بروتين ورم في WILM في WT1 هو عامل أساسي للتنمية الكلى. خطوط الزرد المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج wt1b تيراغرام (wt1b: GFP) تظهر GFP expression تقع تحديدا في المناطق سليفة الكلوة في الأجنة الزرد، بدءا من 17 HPF ^8. سحاف الكلية (NPHP)، جسمية متنحية أمراض الكلى الكيسي، والتي تسببها طفرات الجينات NPHP ^9. NPHP4 ضربة قاضية من قبل morpholino تسبب تشكيل الكيس في تيراغرام (wt1b: GFP). الأسماك ¹⁰ لذلك، هذا السمك المعدلة وراثيا هو نموذج مناسب لمراقبة الهياكل الكلى وتشكيل الكيس أثناء التطور الكلى. الأهم من ذلك، تأثير جهري التنمية الكلى يمكن دراستها باستخدام هذه السلالة في وقت وبكفاءة العمل.

وتصف ورقتنا استخدام تيراغرام (wt1b: GFP) الأسماك كنموذج لتصور تشكيل الكيس الكلى بعد تعديل الجينات. كنا البدء ولصق الموقع مكافحة الشعور المنظمات الأعضاء لاسقاط الجين wnt5a في الزرد. Wnt5a هو بروتين سكري يفرز غير متعارف عليه من عائلة WNT التي تلعب دورا هاما في تطوير مختلف الأجهزة وبعد الولادة الخلويةوظيفة ^11. Wnt5a يعمل من خلال مسارات WNT غير متعارف عليها، بما في ذلك قطبية خلية مستو (PCP) المسار، الذي تم العثور على لعب دور في انقسام الخلايا الموجهة خلال استطالة الأنبوبية الكلوية. Wnt5a ينظم WNT / PCP المسار من خلال تشكيل مجمع مع مستقبلات التيروزين كيناز مثل (ريك)، والتي transduces مزيد Wnt5a الإشارات من خلال تشكيل مجمع مع VANGL البروتين قطبية خلية مستو 2 (Vangl2)، وبالتالي تعزيز الاستقرار Vangl2 ^12. عيوب في مسار PCP يمكن أن يؤدي إلى انقسام الخلايا بشكل عشوائي وتسبب تشكيل الكيس الكلوي. استخدمنا تيراغرام (wt1b: GFP) خط الزرد لمراقبة تشكيل الكيس الكلى التالية wnt5a ضربة قاضية. تيراغرام (wt1b: GFP) نموذج الزرد يسمح التصوير الحي والمراقبة في الوقت المناسب من هيكل الكلى. بعد wnt5a ضربة قاضية، تم العثور على تشكيل الكيس الكلى ابتداء من الساعة 24 HPF. في 72 HPF، الخراجات يمكن العثور عليها في الكبيبات والأنابيب القريبة. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها إلى screen الجينات الأخرى التي قد تتسبب في تشكيل الكيس الكلى.

Protocol

بيان الأخلاق: ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب الزرد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية.

1. إعداد Morpholino

1. تصميم وتركيب الترجمة حجب (AUG-) وتثبيط لصق (Splice-) لمكافحة الشعور morpholino (MO) [أليغنوكليوتيد لهذا الجين من الفائدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1A). يرجى الاطلاع على معلومات الشركة المصنعة في الجدول 1.
   يتم شحن المنظمات الأعضاء كما أسهم مجفف بالتجميد في عبوات زجاجية: ملاحظة.
2. إضافة عالية الجودة الماء المعقم للنفايات وقوارير زجاجية على اعادة تعليق أشهر للتركيز النهائي من 25 ميكروغرام / ميكرولتر. تأكد من أن قليل النوكليوتيد يذوب تماما. وإذا كان بعض بقايا صلبة، تسخين قارورة تحتوي على محلول المخزون قليل النوكليوتيد عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق ودوامة لفترة وجيزة.
3. تخزين محلول المخزون MO في RT. لا تخزينها في 4 درجات مئوية أو -20 °، C بسبب انخفاض درجات الحرارة يمكن أن يسبب قليل النوكليوتيد MO لربط الجدار حاوية. قياس تركيز محلول المخزون باستخدام مقياس الطيف الضوئي (يرجى الرجوع إلى TABLE1) في كل مرة يتم حل الأسهم MO الجديد.
4. إعداد الحل العمل MO في يوم حقن عن طريق تمييع الحل الأسهم مع الدرجة العالية الماء المعقم إلى الجرعة المطلوبة. إضافة 0.5٪ الفينول الأحمر للوصول إلى تركيز 0.05٪. على سبيل المثال، لجعل الحل العمل 5 ميكرولتر مع تركيز 15 نانوغرام / NL، إضافة 3 ميكرولتر MO حل سهم و 0.5 ميكرولتر 0.5٪ الفينول الأحمر إلى 1.5 ميكرولتر من الماء.
   ملاحظة: مع هذا تركيز العمل، كل قطرة (500 رر) الحقن يحتوي على 7.5 نانوغرام من MO واثنين من قطرات تحتوي على 15 نانوغرام من MO.

2. إعداد جهاز حقن

1. الزجاج شراء الإبر وانسحب قبل (انظر الجدول 1 للحصول على معلومات مفصلة). بدلا من ذلك، وسحب الإبرة واي حقن الزجاجث مجتذب الإبرة.
2. بدوره على ضاغط الهواء وضبط ضغط الإعداد ل50 رطل. بدوره على المجهر مصدر الضوء تشريح وبيكو مضخة حقن الصغرى وضبط الإعدادات كما يلي: عقد ضغط 20 رطل، إخراج ضغط 10 رطل، قيمة الفترة من 2.5 و 100 μsec مجموعة من النابضة.
3. تحميل الزجاج إبرة قبل سحبها مع 5 ميكرولتر من محلول الحقن ووضع الإبرة في وضع عمودي مع طرف إلى الانخفاض. الانتظار حتى يصل كل الحل طرف الإبرة مع عدم وجود فقاعات الهواء مرئية. ضع حامل إبرة في الموقف المناسب المقبل لالمجهر وادخال الإبرة الزجاج في حامل. ضبط زاوية الحقن الى 45 درجة.
4. جلب رأس الإبرة في عرض تحت المجهر، وارتفاع قبالة المرحلة، والتركيز على نحافة المنطقة من غيض. قطع رأس إبرة مع ملاقط نقطة غرامة.
5. وضع مسطرة وأنبوب شعري مع القطر الداخلي من 0.15 ملم جنبا إلى جنب تحت المجهر.حقن المحلول في واحدة من نهاية الأنابيب الشعرية لجعل عمود السائل. ضبط الوقت الإخراج لتصل إلى كل 17 قطرات لكل 1 ملم طول عمود السائل، ثم حجم كل قطرة من 1 NL (حجم قطرة = π س دائرة نصف قطرها ^{2 ×} طول (من عمود السائل) / عدد (قطرات).
   ملاحظة: انخفاض يبلغ قطرها 0.1 ملم تعطي حجم الحقن حوالي 500 رر (حجم قطرة = 4/3 س س π دائرة نصف قطرها ^3).

3. إعداد أسمدة اسماك الزرد الأجنة وحقن مع Morpholinos

1. إعداد تيراغرام (wt1b: GFP) المعدلة وراثيا أزواج تربية الزرد وفقا لبروتوكولات تنشر لتربية الزرد القياسية والصيانة. جمع الأجنة بعد تفرخ الطبيعي، والاحتفاظ بها في 10 سم طبق بتري مملوءة بالماء E3 (5MM كلوريد الصوديوم، 0.17mM بوكل، 0.33 ملي CaCl _2، 0.33 ملي MgSO _4). بدء حقن MO على الفور ^13. مراقبة الجنين التشكل تحت المجهر والتأكد من حقن MO هو في واحدة-مرحلة الخليوي، أو في موعد لا يتجاوز المرحلة أربعة خلايا.
   1. نقل الأجنة إلى طبق بتري 10 سم مع إسفين على شكل أحواض أجار. نضح الماء E3 اضافية واضغط بلطف الأجنة في أحواض.
   2. التلاعب في الأجنة مع ممص مكروى لتصور 1 خلية الأجنة مرحلة تحت المجهر تشريح. اختراق المشيمه ثم صفار البيض لحقن واحدة أو قطرتين من MO في صفار البيض (1 قطرة = 500 رر). نقل الأجنة المحقونة إلى 10 سم طبق بتري بالماء E3 واحتضان عند 28.5 درجة مئوية.
2. بعد الحقن، وإزالة الأجنة الميتة وتسجيل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء E3 في طبق كل 24 إلى 48 ساعة.

4. التجارب النمط الظاهري الإنقاذ

1. حدد orthologue من الأنواع آخر لديه مختلف بنية الزوج القاعدة الأساسية (عادة 3-7 عدم التطابق الزوج القاعدة) وذلك، من مقاومة للMO، للانقاذ. على سبيل المثال، في هذه التجربة، اخترناالماوس لأن تسلسل الماوس Wnt5a مرنا يختلف عن تسلسل الزرد.
2. تصميم التمهيدي مع مجموعة من التمهيدي إلى الأمام بدأت في موقع متعدية والتمهيدي العكسي عند مقربة من نهاية المنطقة الترميز مرنا. إضافة تسلسل T7 المروج في 5'- نهاية تسلسل التمهيدي إلى الأمام. في هذه التجربة، وكنا ما يلي تسلسل التمهيدي. إلى الأمام: 5'- TAA تاك GAC TCA CTA العلامة GGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA أ 3 "وعكس: 5'- TCA CTT الائتلاف GAC GTA CTG gtc- 3".
3. إجراء 50 ميكرولتر البلمرة المتسلسل (PCR) مع مجموعة التمهيدي (0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي) مصممة فوق و 0.1 ميكروغرام قالب DNA التي تحتوي على الماوس تسلسل Wnt5a [كدنا مع برنامج PCR التالية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. 35 دورات من 95 درجة مئوية (30 ثانية)، 58.5 ° C (30 ثانية)، 72 ° C (1 دقيقة)؛ وخطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
4. بعد الانتهاء رانه دورة، تشغيل 2 ميكرولتر من المنتج PCR على agarose هلام 1٪ للتأكد من أن الفرقة هو الحجم الصحيح. تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحقق من تركيز الحمض النووي مع معمل. تخزين المنتج PCR المنقى في -20 ° C أو استخدامها مباشرة في توج النسخ RNA في الخطوة التالية.
5. توليف في المختبر توج مرنا مع مجموعة تخليق الحمض النووي الريبي توج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع مرنا في 20 ميكرولتر المياه مجانا ريبونوكلياز وتحديد تركيز. قسامة الحمض النووي الريبي وتخزينها في -80 ° C.
6. في يوم من الحقن، وإعداد محلول العمل في مرنا مع ريبونوكلياز الماء المعقم مجانا. لاحظ أن 40 خريج عموما أعلى جرعة RNA الذي آثار غير محددة أو السامة من الحمض النووي الريبي لا تحدث. حافظ على حل العمل على الجليد. حقن الجنين مع MO ثم مرنا الإنقاذ، أو شارك في حقن كلاهما معا. على سبيل المثال، إذا كان تركيز prepar مرناإد في الخطوة 4.5 هو 0.6 ميكروغرام / ميكرولتر، إضافة 0.67 ميكرولتر من الرنا المرسال (0.4 ميكروغرام) إلى 4.33 ميكرولتر من ريبونوكلياز المياه مجانا لجعل تركيز النهائي من 0.08 ميكروغرام / ميكرولتر، ثم قطرة واحدة (500 رر) من كل حقنة يحتوي على 40 خريج من مرنا. إعداد MO كما هو موضح في الخطوة 3.

5. إعداد الأجنة المحقونة التصوير الفلورسنت

1. بعد مرور فترة الحضانة في 28.5 درجة CO / N، إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى الماء E3 لمنع التصبغ، مما يؤثر مراقبة هيكل سليفة الكلوة باستخدام المجهر مضان. ومع ذلك، لا تضيف PTU قبل تكون المعيدة، لأنه يؤثر على التطور الجنيني المبكر.
2. في 48 HPF، dechorionate الأجنة مع ملاقط غرامة يدويا. التقاط صور ل48 و 72 الأجنة HPF تحت المجهر تشريح الضوء.
   ملاحظة: يمكن أن تؤخذ هذه الصور من دون تخدير.
3. ما يقرب من 10 دقيقة قبل التصوير تحت المجهر مضان، تخدير الأجنة عن طريق وضعها في10 سم طبق بتري تحتوي على 160 ميكروغرام / مل مخزنة تريكين. الانتظار لمدة 5-10 دقائق، ثم مسة خفيفة الزرد للتأكد من أنها لا تتحرك وبالتالي التخدير هو العمل.
4. بعد أن يتم تخدير الأجنة، جبل لهم في 3٪ السليلوز الميثيل وتوجيهها في وضعية الرقود تحت المجهر تشريح (يرجى الرجوع إلى الجدول 1).
5. مراقبة هيكل سليفة الكلوة تحت المجهر مضان (يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1) والتقاط الصور في تكبير مختلفة (10X 20X و).

النتائج

وقد تحقق Wnt5a نهدم عن طريق إدخال الترجمة حجب MO (AUG-MO) أو اكسون / إنترون لصق الحدود MO (لصق-MO) إلى الأجنة الزرد في مرحلة خلية واحدة. وAUG-MO يستهدف كودون بداية، وبالتالي يمنع كلا رسالة wnt5a الأم واقحي. ولصق-MO يستهدف الموقع الثالث المانحة لصق ويمنع فقط نص اقحي من wnt5a (?...

Discussion

مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للنهاية مرحلة المرض الكلوي في البشر ويتميز تشكيل التدريجي الكيس، وتضخم الكلى، والتنمية أنبوب صغير غير طبيعية ^14. راثي PKD السائد (ADPKD) هو مرض وراثي الذي تحور إما PKD1، ترميز polycystin-1 (PC1)، أو PKD2، ترميز polycystin-2 (PC2)...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop