التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع<em&gt; التوكسوبلازما</em

Summary

باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على الصورة 160 ميكرون أقسام الدماغ سميكة من الفئران المصابة بالطفيلي التوكسوبلازما، والتي تمكن التصور وتحليل العلاقة المكانية بين الطفيلي encysting والخلايا العصبية المصابة.

Abstract

التوكسوبلازما هو إلزام، الطفيليات داخل الخلايا مع مجموعة المضيف واسع، بما في ذلك البشر والقوارض. في كل من البشر والقوارض، التوكسوبلازما يضع العدوى المستمرة مدى الحياة في الدماغ. بينما الإصابة في الدماغ وهذا هو دون أعراض في معظم الناس مناعيا، في وضع الجنين أو الأفراد المناعة مثل متلازمة نقص المناعة (الإيدز) من المرضى، وهذا ميل للوالمثابرة في الدماغ يمكن أن يؤدي إلى مرض عصبي مدمر. وبالتالي، فمن الواضح أن التفاعل التوكسوبلازما brain- أمر حاسم لهذا المرض أعراض التي تنتجها التوكسوبلازما، ولكن لدينا القليل من الفهم والتفاعل الخلوي أو الجزيئية بين خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) والطفيليات. في نموذج الفأر من الجهاز العصبي المركزي داء المقوسات وقد كان من المعروف لأكثر من 30 عاما أن الخلايا العصبية هي الخلايا التي استمرت الطفيلي، ولكن القليل من المعلومات متاح حول أيجزء من الخلايا العصبية مصاب عموما (سوما، التغصنات، محور عصبي)، وإذا هذه العلاقة الخلوية يتغير بين السلالات. في جزء منه، هذا النقص هو الثانوي لصعوبة التصوير وتصور الخلايا العصبية المصابة كلها من حيوان. ان مثل هذه الصور عادة ما تتطلب باجتزاء المسلسل وخياطة من الأنسجة تصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني أو المجهري متحد البؤر بعد المناعية. من خلال الجمع بين عدة تقنيات، الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدام أبواب سميكة (160 ميكرون) لتحديد والصورة كاملة الخلايا التي تحتوي على الخراجات، والسماح التصور والتحليل من الفردية، والخلايا العصبية المصابة بشكل مزمن ثلاثي الأبعاد دون الحاجة لالمناعية، المجهر الإلكتروني ، أو باجتزاء المسلسل وخياطة. باستخدام هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ في فهم العلاقة بين الطفيل الخلوية والخلايا العصبية المصابة.

Introduction

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على ارتفاع القرار، وصور ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الفردية التي تقوم إصابة بطفيل التوكسوبلازما داخل الخلايا إلزام.

غالبا ما تعتبر التوكسوبلازما واحدة من الطفيليات الأكثر نجاحا بسبب مجموعة مضيفه كبير وسيطة، والتي تشمل البشر والقوارض. في كل من البشر والقوارض، بعد العدوى الحادة من خلال تناول طعام أو ماء ملوث، التوكسوبلازما غير قادرة على التسبب في العدوى المستمرة للجهاز العصبي المركزي عن طريق تحويل من شكله تتكاثر بسرعة (على tachyzoite) لالبطيء الطويل تكرار وencysting النموذج (المتباطئة ). في الأفراد مناعيا، ويعتقد أن هذا المرض الجهاز العصبي المركزي الكامنة لتكون أعراض نسبيا، ولكن في الأفراد المناعة مثل مرضى الإيدز أو متلقى، تجدد الطفيلي يمكن أن يؤدي إلى التهاب الدماغ بالمقوسات قاتلة ^1،2. وبالإضافة إلى ذلك، الدراسات الحديثة هكتارلقد أظهرت أن العدوى الكامنة مع التوكسوبلازما يمكن أن يؤدي إلى تغيرات سلوكية في القوارض ^3،4، على الرغم من أن آلية لا تزال مجهولة.

والمثير للدهشة أنه بالرغم من هذه البيانات تسليط الضوء على أهمية التفاعل CNS- التوكسوبلازما، والقليل نسبيا هو معروف عن هذه العلاقة، وخاصة على المستوى الخلوي والجزيئي. وقد أعاق القدرة على دراسة الجوانب حتى بسيطة للتفاعل الدماغ الطفيلي في جزء من القيود التكنولوجي. على سبيل المثال، فإن الغالبية من العمل تبين أن الخلايا العصبية هي الخلايا التي لا تزال قائمة الخراجات تم القيام به مع المجهر الإلكتروني (EM) ^5،6. على الرغم من EM يعطي ارتفاع القرار، وذلك هو مضيعة للوقت، والعمل المكثف، ومكلفة. وقد تم مؤخرا استخدام المناعي (IF) المقايسات بالتزامن مع المجهري متحد البؤر لتأكيد العمل الذي قام به EM ^7. IF المقايسات سهلة من الناحية الفنية لأداء وغير مكلفة نسبيا، ولكن باستخدام هذه التقنيات لالفضوليةTAND العلاقة المكانية بين الكيس والخلايا العصبية المصابة تتطلب إعادة الإعمار المسلسل، والتي تستغرق وقتا طويلا، من الصعب من الناحية الفنية، وربما يؤدي إلى فقدان معلومات قيمة. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة التي يمكن استخدامها مع نموذج الفأر من الجهاز العصبي المركزي داء المقوسات ويسمح لنا الصورة بكاملها من الخلايا العصبية المصابة دون EM أو المناعية (IHC). من خلال تطوير هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ لاستكشاف العلاقة الخلوية بين الخلايا المصابة والكيس بطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا.

طريقة ضعنا يجمع بين التقنيات الحديثة للمقاصة بصريا والتصوير أقسام الدماغ سميكة بواسطة المجهر متحد البؤر ⁸ مع نظام الذي يصادف في خلايا الجسم الحي التي تم حقنها مع البروتينات الطفيلي ^9،10. في هذا النظام، ونحن تصيب الفئران لجنة المساواة العرقية-مراسل التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) إلا بعد لجنة المساواة العرقية بوساطة إعادة التركيب ¹¹ مع التوكسوبلازما السلالات التي تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) وحقن لجنة المساواة العرقية recombinase في الخلايا المضيفة ^9. هذا المزيج يسمح لنا حصاد مخ الفأر المصاب بعد ثبوت العدوى CNS، وقطع أقسام الدماغ سميكة، وبسرعة تحديد المجالات ذات الصلة إلى الصورة من خلال إيجاد RFP ⁺ الخراجات. ومن المهم أن نلاحظ أنه مع التعبير الخلية المضيفة من GFP يعتمد فقط على حقن لجنة المساواة العرقية عن الطفيليات، وليس على العدوى، وعدد من الخلايا GFP ⁺ لا تحتوي على طفيليات ^10. وبما أن الهدف من هذا البروتوكول هو أن تكون قادرة على الصورة كاملة الخلايا العصبية المصابة، ويتم التركيز فقط على GFP ⁺ الخلايا العصبية التي تحتوي أيضا على طلب تقديم العروض ⁺ الكيس، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لصورة GFP ⁺ / RFP ^- الخلايا العصبية.

مرة واحدة يتم حصاد الدماغ المصاب ومقطوع، ويتم تقديم الأقسام شفافة عن طريق مسح الجلسرين. ثم يتم تصويرها المناطق المناسبة من المقاطع مع المجهر متحد البؤر، ALخوار التصور غير مسبوق من الخلايا المضيفة المصابة والطفيليات متكيسة في مجملها. هنا نقدم بروتوكول كامل لتحديد وإزالة بصريا، والتصوير إصابة الخلايا العصبية.

Protocol

كانت ولدت الفئران وحفظه في درجة حرارة الغرفة والرطوبة التي تسيطر عليها مع 12 ساعة عكس الضوء دورات / الداكنة مع الغذاء والمياه المتاحة الإعلانية libitum في جامعة أريزونا: ملاحظة. وأجريت التجارب في إطار المبادئ التوجيهية وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة ولاية اريزونا. تم بذل كافة الجهود للحد من المعاناة. الفئران لجنة المساواة العرقية-مراسل هي على C57BL / 6 الخلفية ¹¹ ومتاحة تجاريا.

1. ماوس العدوى

ملاحظة: طريقة العدوى الفأر مع التوكسوبلازما هو موضح أدناه استخدمت في الدراسات التي نشرت سابقا ^10-12.

1. تنمو سلالات التوكسوبلازما في الإنسان القلفة الخلايا الليفية (HFFs) المثقف في Dulbecco وارتفاع السكر التعديل النسور المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ FBS، و 100 U / البنسلين مل، 100 ملغ / مل streptomycin، و2 مم L-الجلوتامين (cDMEM) في T-25 قارورة داخل 5٪ CO ₂ الحاضنة حتى شكلت الطفيليات فجوات parasitophorous كبيرة.
2. الطفيليات حقنة الإفراج عن طريق كشط الخلايا من الجزء السفلي من القارورة وتمرير الحل الناتج من خلال إبرة قياس 25 متصلة حقنة 3 مل 2 مرات داخل قارورة ثم نقل عن حل لقضية حقنة 5ML متصلة إبرة قياس 27 التي وقد وضعت رأسا على عقب داخل أنبوب مخروطي 15 مل. توصيل المكبس إلى حقنة وتمرير الحل الطفيلي في أنبوب مخروطي الشكل.
3. الطرد المركزي أنبوب لمدة 10 دقيقة في 300 ز س. نضح طاف ثم resuspend الكرية في 4-6 عقيمة مل USP الصف 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 (محلول المخزون).
4. تحميل عدادة الكريات مع 10 ميكرولتر من محلول المخزون، انتظر 5-10 دقيقة للطفيليات ليستقر ثم حساب عدد الطفيليات في أربعة الزاوية ومركز الساحات من ساحة كبيرة الأوسط.
5. تمييع الفقرةمواقع لحجم اللقاح المناسب من 100K / 200 ميكرولتر 1X PBS ثم حقن الفئران داخل الصفاق (IP) بإجمالي 200 ميكرولتر.
   ملاحظة: للحصول على هذا الإجراء، تم تلقيح الفئران مع 100K النوع الثالث (CEP) ¹³ tachyzoites في 200 ميكرولتر 1X PBS. عندما تصيب الفئران مع سلالات أخرى من التوكسوبلازما، قد تحتاج تركيز اللقاح إلى تعديل لحساب مستوى الفوعة.

2. الإرواء وحصاد الدماغ

ملاحظة: تم إجراء هذا البروتوكول في 21 يوما إصابة آخر (نقطة في البوصة)، وهذا يمثل نقطة الوقت الذي تم العثور على أرقام ذروة الخراجات في مخ الفأر، ولكن نقطة زمنية أخرى يمكن استخدامها. حجم، عدد، والموقع، وجود أو عدم وجود الخراجات يعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك سلالة الماوس، الطفيلي نوع السلالة وكذلك حجم اللقاح ^{7،14 - 17.} سوف تحتاج المحققين لتحديد بشكل فردي اللقاح المناسب للماوس وToxoplasسلالة أماه انه / انها تستخدم.

1. إعداد جميع الأدوات الجراحية الحصاد (الشكل 1).
2. لكل الماوس، وإعداد والحفاظ على الجليد: حقنة 20ML مليئة 0.9٪ كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) + 10 U / مل الهيبارين في 1X معقم USP الصف PBS (الهيبارين / المالحة)؛ 20 مل حقنة مليئة 4٪ لامتصاص العرق (PFA)؛ التلألؤ قارورة مع 15 مل 4٪ PFA. بالنسبة للفئران متعددة، وإعداد كوب مملوء كامل المبلغ من كل حل اللازمة لجميع الفئران ثم وضع حقنة جديدة مليئة حل لكل الارواء.
3. تخدير الملكية الفكرية الفأر مع 200 ميكرولتر / 25 غرام من وزن الجسم من الكيتامين / زيلازين الكوكتيل (24 ملغ / مل و 4.8 ملغ / مل على التوالي) في اليوم من الفائدة. مراقبة الماوس لمستوى التخدير عن طريق فحص القدمين قرصة المنعكس. تواصل مع بروتوكول فقط مرة واحدة يظهر الماوس أي رد على قرصة اصبع القدم حازمة.
   ملاحظة: أساليب أخرى من التخدير يمكن استخدام طويلة كما يتم الوصول إلى مستوى مناسب من التخدير قبلالشروع في البروتوكول.
4. ضع الماوس في موقف ضعيف على منصة رغوة مغطاة. يعلقون جميع أطرافه الأربعة من تحت أقدام ثم رش الصدر والبطن مع الايثانول 70٪ (ETOH) (الشكل 2A). إضافة عدة مناشف ورقية معقمة تحت الماوس يمكن أن تستخدم للمساعدة على امتصاص الفائض من السوائل الارواء.
5. الجلد رفع أسفل عظمة القص مع ملقط ثم استخدام المقص لإجراء شق. سحب الجلد إلى الوراء لفضح الصدر (الشكل 2B).
6. رفع الخنجري عملية وإجراء شق في البطن أسفل الحجاب الحاجز، ويعرض الكبد والتي يتم تشريح بصراحة بعيدا عن الحجاب الحاجز. جعل اثنين من الشقوق، واحد على اليسار واحد على اليمين من خلال الحجاب الحاجز والجزء السفلي من الأضلاع. توسيع الشقوق اليسار واليمين ما يقرب من 1 / 2-2 / 3 الطريق حتى القفص الصدري، الذي هو ثم تنعكس مرة أخرى لفتح تجويف الصدر (الشكل 2C).
   ملاحظة: احرص على عدم قطع أي أجهزة أو الأوعية الدموية الرئيسية ودوحلقة هذا الإجراء لأن ذلك سوف تؤثر سلبا على جودة الارواء.
7. يروي transcardially مع 10-20 مل الهيبارين / المالحة تليها 10-20 مل 4٪ PFA.
   ملاحظة: إذا تم نضح بشكل صحيح، فإن الكبد تتحول من اللون الأحمر إلى تان (الشكل 2D). إذا لم تفعل بشكل صحيح، سوف الأوعية الدموية تكون مرئية (الشكل 2E).
8. تحويل الماوس فوق على البطن لها والقدمين إعادة دبوس ثم رش الرأس والرقبة مع 70٪ ETOH. رفع الجلد من قاعدة العنق وإجراء شق. إزالة الجلد لفضح الجمجمة (الشكل 2F). قطع رأس رئيس على مستوى الكتفين. إزالة الجمجمة، وإزالة بلطف الدماغ، ووضعه في قارورة التلألؤ مليئة 4٪ PFA (الشكل 2G-H).
   ملاحظة: إذا perfused لكذلك، فإن الدماغ تظهر بيضاء مع عدم وجود أوعية دموية مرئية (الشكل 2I). إذا لم يتم perfused لالدماغ بشكل جيد، والأوعية الدموية تكون مرئية (الشكل 2J).
9. وضع الشرارةنشوئها قارورة مع الدماغ في 4٪ PFA في 4 درجات مئوية خلال الليل، غطى من الضوء. شطف الدماغ في غير USP الصف برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى قارورة التلألؤ جديدة مليئة المبردة برنامج تلفزيوني 1X. تخزين الدماغ في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات مئوية، وتغطيتها من الضوء.
   ملاحظة: الناجحة المقاصة والتصوير تم إنجازه مع أقسام المخزنة في برنامج تلفزيوني 1X لشهر واحد ولكن من الأفضل إلى قسم الدماغ في غضون بضعة أيام كما التخزين لفترات طويلة في برنامج تلفزيوني سوف عكس تثبيت PFA ويمكن أن يؤدي إلى أقل من الصور المثالية . وقد لاحظت تألق ذاتي وزيادة طمس في بعض المقاطع المصورة بعد التخزين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة شهر أو أكثر.

3. الدماغ باجتزاء

1. إزالة الدماغ من برنامج تلفزيوني 1X ووضعه في مصفوفة الدماغ (الشكل 3A) للسماح لمزيد من الدقة، وحتى يمر في الدماغ. تقليم قبالة المخيخ وحاسة الشم المصابيح، إذا كان موجودا، ومن ثم خفض الدماغ coronally إلى 2 أو 3 أقسام. ملاحظة: التشذيب ويمكن أن يتم قطع من الدماغ بدون مساعدة من مصفوفة الدماغ. عدد الأقسام قطع coronally سوف تعتمد على المسافة قطع من Vibratome المستخدمة. يمكن مقطوع الدماغ في أي اتجاه، على الرغم من أقسام السهمي والاكليلية هي الأكثر شيوعا لتحديد تشريحي عصبي.
2. يضعوا كل قسم المخ على عينة تصاعد كتلة مع cyanoacrylate. يضعوا كتلة صغيرة من 5٪ هلام الاغاروز راء الباب الدماغ لدعم (الشكل 3B).
   ملاحظة: يمكن استخدام آليات الدعم الأخرى، ولكن من دون دعم، قد Vibratome دفع على خلايا المخ مما يؤدي باجتزاء متفاوتة.
3. قطع الأنسجة إلى 160 ميكرون (العمل عن بعد للهدف المستخدمة في التصوير) أبواب سميكة مع Vibratome مجموعة إلى سرعة 4 والسعة من 9.
   ملاحظة: يمكن تعديل إعدادات السرعة والسعة تبعا لآلة معينة تستخدم من أجل الحصول على حتى والأقسام على نحو سلس. إذا كانت الإعداداتغير صحيح، يمكن أن تكون النتيجة أقسام غير المستوية وتمزيق النسيج أو الثرثرة العلامات.
4. جمع أقسام الأنسجة إلى قارورة التلألؤ مليئة طازجة أو مبردة برنامج تلفزيوني 1X إذا أنهم ذاهبون إلى أن يتم مسح خلال أسبوع واحد. إذا أقسام لن يتم مسح خلال أسبوع واحد، أقسام مكان إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge مليئة حل cryopreservative وتخزينها في -20 ° C.

4. المقاصة البصري من الدماغ أقسام الأنسجة

ملاحظة: لقد تم تعديل هذا البروتوكول من أسلوب المنشورة سابقا ^8.

1. إعداد 25٪، 50٪، 75٪ و 90٪ المجلد / المجلد الجلسرين في برنامج تلفزيوني 1X + 2٪ توين-20 (GL / PBST).
2. إزالة أجزاء من برنامج تلفزيوني 1X أو، إذا كان في cryopreservative، وشطف في برنامج تلفزيوني 1X ونقل إلى قارورة التلألؤ تحتوي على 10 مل من 25٪ GL / PBST. مكان قنينة على شاكر في 4 درجات مئوية، وتغطيتها من التعرض للضوء، لمدة 12 ساعة.
3. أؤكد أن جميع أقسام وانخفضت إلى بوttom من القارورة. نضح 25٪ GL / PBST، وترك ما يكفي لتغطية أقسام ثم ملء القارورة مع 10 مل 50٪ GL / PBST ومكان على شاكر في 4 درجات مئوية، وتغطيتها من التعرض للضوء، لمدة 12 ساعة. كرر هذه العملية ل75٪ GL / PBST ثم 90٪ GL / PBST. ترك المقاطع في 90٪ GL / PBST لمدة 24 ساعة للوصول إلى المقاصة القصوى. وعلى مدار عملية المقاصة ومراقبة المقاصة البصرية تدريجية (الشكل 4).
   ملاحظة: قد يكون المعجل هذه العملية إذا تم تغيير الحلول على الفور بعد أن غرقت أقسام إلى أسفل القارورة. في 75٪ و 90٪ الحلول، وأقسام لا تغرق على طول الطريق إلى قاع القارورة ولكن سوف تطفو في الوسط.

5. تركيب أقسام أنسجة المخ

1. قطع رقم 1.5 ساترة إلى 5 قطع لخلق فاصل. استخدام قلم رصاص الحاكم وذات الرؤوس الماس ليسجل وكسر ساترة على طول الخطوط المتقطعة هو مبين في الشكل 5A. تجاهل رانه توسيط قطعة، وترتيب 4 قطع الخارجي على شريحة زجاجية واضحة لخلق النافذة، ثم فرشاة طلاء الأظافر واضحة على طبقات التمسك قطعة من الفاصل إلى الشريحة في التكوين الصحيح (الشكل 5B).
   ملاحظة: سيتم استخدام هل لإنشاء المساحة اللازمة بين الشرائح وساترة لتركيب أقسام مسح. قد يتم اقتطاع ساترة بطرق مختلفة لخلق أي نافذة حجم ضروريا. قبل قطع الفواصل رغوة متاحة تجاريا أيضا. للسماح للطلاء الأظافر لتجف تماما، فمن الأفضل لجعل الشرائح مع الفواصل يوم واحد على الأقل قبل أقسام المتزايدة.
2. قطع أقسام نقل إلى شريحة باستخدام الماصة نقل من البلاستيك مع غيض قبالة. تأكد من ملء المنطقة المحيطة مع 90٪ GL / PBST. خفض بعناية ساترة على أقسام التأكد من عدم إدخال أي فقاعات. فائض GL / PBST يمكن شرير بعيدا مع خالية من الوبر مسح.
3. صورة GFP ⁺ الخلايا العصبية التي تحتوي على RFP ⁺ الخراجات التوكسوبلازما مع المجهر متحد البؤر فورا (الشكل 7A-B) ثم متجر شرائح مسطحة ومغطاة من الضوء في 4 ° C.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، وختم الشرائح تماما حول كافة الحواف لتخزين وتصويرها في وقت لاحق. استخدام طلاء الأظافر واضحة لاغلاق الشريحة هو أمر اختياري ويمكن أن تجعل الأمر أكثر صعوبة لإزالة ساترة إذا كان للمرء أن إزالة أجزاء من الشريحة في وقت لاحق لمزيد من المعالجة.

6. التصوير

ملاحظة: أي المجهر ويمكن استخدام ذلك لديها القدرة على الحصول على دقة عالية-Z-مداخن.

1. بعد العثور في البداية البؤري في 10X، وتغيير لهدف 20X والمسح الضوئي من خلال قسم للتعرف على الكيس الموجود داخل GFP ⁺ خلية. توسيط المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في مجال الرؤية.
2. التغيير إلى الهدف 40X. التركيز صعودا وهبوطا من خلال ROI كامل للتأكد من أن الخلية بأكملها وقبرصيالحادي ومرئية.
   تم الحصول على الصور باستخدام المجهر متحد البؤر مع هدف النفط DIC M27 40X / 1.30: ملاحظة.
3. باستخدام برنامج التصوير المثبتة، الحصول على ض المكدس يتضمن الخلية بأكملها مع الكيس. ويبين متوسط ​​الإعدادات المستخدمة للحصول على صور في الشكل (6).
   قد تحتاج إلى تعديل إعدادات اعتمادا على كل أقسام الأنسجة المحققين وقدرات المجهر: ملاحظة.
4. الحصول على صورة الإسقاط القصوى للض المكدس من خلال تحديد عدد من التوقعات إلى 1. الحصول على رأي التناوب الكامل من خلال تحديد عدد من التوقعات إلى 64.
   ملاحظة: تتوفر حزم البرامج الأخرى، ويمكن استخدامه للحصول على أقصى قدر من الإسقاط، التناوب، وكذلك وجهات النظر الأخرى من الصور ض المكدس.
5. تحليل الصورة مع برامج التحليل التصوير.

النتائج

ويشمل الرقم 7 صور تمثيلية اثنين من GFP ⁺ الخلايا العصبية من اثنين مختلفة 160 ميكرون أبواب سميكة، فضلا عن قياس التمثيل في المسافة من الكيس الى خلية الجسم عن الشكل 7B. أرقام التي تحتوي على كيس 7 A و B توضيح أن هذا جديدة بروتوكول يسمح ل?...

Discussion

وبالنظر إلى أن التغيرات الخلوية في الخلايا المضيفة المصابة وقد تم ربط لنتائج المرض في العدوى مع الكائنات الحية داخل الخلايا الأخرى مثل فيروس نقص المناعة البشرية، وداء الكلب، والكلاميديا ^{​​18،19،} قمنا بتطوير تقنية من شأنها أن تسمح لنا لدراسة التفاعلات الحميمة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible