JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Abstract

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

Introduction

The mammalian organ of Corti is comprised of a mosaic of specialized cell types, including two types of mechanosensory hair cells as well as at least four types of nonsensory supporting cells making it an ideal model system to study normal cellular processes like proliferation, fate specification, differentiation and patterning. In addition, the normal development of these different cell types is essential for normal hearing function. Hence, it is crucial to understand the factors, both molecular and cellular, that regulate their development. However, the small size of the mouse cochlea as well as its inaccessibility poses a particular challenge for gene expression studies. Moreover, most of the cell fate specification and patterning events occur during embryonic time periods and are mostly completed before birth. Therefore, identification and characterization of signaling events during embryonic time periods is essential to gain insight into the molecular basis of cochlear morphogenesis.

Here, we demonstrate a method to culture intact cochlea in vitro from embryonic mouse inner ears. The rationale behind the use of this technique is that cultured cochleae maintain their molecular and morphological characteristics thereby providing a valuable model for investigating potential candidate genes and exploring the mechanisms involved in cochlear morphogenesis. Although transgenic mice can be used for gene expression studies, an in vitro system is often needed for monitoring specific gene functions. Moreover, cochlear cultures can be established from transgenic mouse embryos so that their in vitro development and response to various soluble factors and antagonists can be studied. Although embryos at day 13 (E13) are used in this protocol, cultures from E12 or E14 to early postnatal inner ears can give similar results.

We also present a gene transfer technique in cultured embryonic cochlear explants using square wave electroporation. Following the isolation of the cochlear explants, electroporation can be used to express DNA plasmids of gene(s) of interest in individual cells within the cochlear duct. This technique serves as a complementary approach to studies utilizing transgenic mice to gain insight into the molecular pathways underlying cellular phenotype. Using this method of gene transfer, a variety of epithelial cell types within the embryonic cochlea are transfected, thereby enabling loss-and gain-of-function analyses at the single-cell level. In addition, electrophysiological studies can also be performed in cochlear explant cultures8. This method of in vitro electroporation is relatively simple and straightforward, combined with minimal damage to the tissue, has resulted in a rapid expansion of this technique.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: جميع البروتوكولات باستخدام الحيوانات الحية ويجب مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC) ويجب أن تتبع وافقت رسميا الطرق لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. يجب أن يتم تنفيذ كافة تشريح باستخدام تقنية معقمة على مقاعد البدلاء نظيفة تدفق الصفحي. قفازات وقناع، إذا رغبت في ذلك، يجب أن ترتديه أثناء هذا الإجراء.

1. تشريح الأذن الداخلية الجنينية الماوس

  1. الإعداد للهيئة في الثقافات يزدرع كورتي:
    1. تعقيم تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة عن طريق تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة وتطهير السطح مع الايثانول 70٪ قبل استخدامها. وبالإضافة إلى ذلك، وتعقيم جميع الأدوات تشريح بما في ذلك أدوات تشريح الجميلة وأطباق Sylgard المغلفة للجنين عن طريق تشريح الأوتوكلاف أو عن طريق نقع في الايثانول 70٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تخلصي الايثانول 70٪ والسماح للأطباق وأدوات في الهواء الجاف في الصفحي نظيفة تدفق جزءا لا يتجزأ منن مقاعد البدلاء قبل استخدامها.
    2. تحضير محلول الملح المتوازن معقم هانك (HBSS) / (4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES) خليط من خلال إضافة 10٪ من 10X HBSS و 0.5٪ HEPES وضبط درجة الحموضة إلى ما يقرب من 7.2 وفلتر تعقيم الحل النهائي وتخزينها في 4 ° C. تنفيذ جميع التشريح في برود حل HBSS / HEPES للحفاظ على أفضل الأنسجة في جميع أنحاء الداخلي.
    3. أطباق أسفل الزجاج معطف مع مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 5 مل من البرد (4 ° C) العقيمة Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) إلى قسامة 300 ميكرولتر من المصفوفة الغشاء القاعدي في العقيمة 15 مل أنبوب البولي بروبلين. خلط قبل vortexing محتويات وإضافة 150 ميكرولتر من الغشاء القاعدي مصفوفة DMEM خليط من وسط كل صحن الثقافة بحيث يغطي ثقافة كاملة الحالية بشكل جيد في وسط الطبق. تغطية الأطباق وتخزينها في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    4. صب 4-5 مل المبردة HBSS إلى عشرري أطباق بتري معقمة البوليسترين وترك مغلقة في غطاء محرك السيارة.
    5. إعداد مستنبت في أنبوب معقم 15 مل البولي بروبلين بإضافة 9 مل من DMEM، و 100 ميكرولتر من المكملات N2، 10 غرام / مل سيبرو و 1 مل من FBS.
  2. عزل الأجنة:
    ملاحظة: في هذا الإجراء لزراعة قوقعة إإكسبلنتس من الفئران الجنينية، الأذن الداخلية الحصاد من يوم الجنينية (E) 13 العظام الزمنية مع اليوم بعد الإخصاب التي تعتبر E1 9. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول مع الماوس الجنينية الأذن الداخلية ابتداء من E12 E18 ل.
    1. الموت ببطء ماوس توقيت الحوامل مع CO 2 والتضحية الحيوانية خلع عنق الرحم أو البروتوكولات المعتمدة المناسبة. تنفيذ euthanization بعيدا عن تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة للحفاظ على عقم في غرفة زراعة الأنسجة.
    2. ضع الماوس الموت الرحيم على منشفة ورقية مع البطن مواجهة وتطهير البطن مع الايثانول 70٪.
    3. فتح تجويف البطن عن طريق الجلد الاستيلاءمع ملقط المنحنية مع يد واحدة وقطع البشرة والعضلات على طول خط الوسط مع مقص باستخدام جهة أخرى. جعل اثنين من التخفيضات عمودي على كلا الجانبين، وسحب الرحم بعناية من قبل رافعين قرون الرحم الثنائية مع ملقط وسلخه من تحت النسيج الضام باستخدام مقص.
    4. وضع سلسلة الجنينية في طبق بتري تحتوي على حل المبردة تشريح (HBSS / HEPES خليط) ونقلها إلى الصفحي تدفق مقاعد البدلاء النظيفة.
    5. إزالة الأجنة بعناية من المشيمة ووضعها في واحدة من أطباق بتري معقمة تحتوي على حل تشريح. إذا كان هذا الحل يتحول الدموي، نقلها إلى طبق بتري جديد.
      ملاحظة: عند هذه النقطة والأجنة يمكن نظموا باستخدام دليل انطلاق تايلر.
    6. قطع رأس الأجنة عن طريق معسر في منطقة الرقبة مع زوج من ملقط نظيفة أو المقص ووضع رؤساء في طبق بيتري الطازجة التي تحتوي على حل تشريح المبردة.
  3. تشريح الأذن الداخلية:
    1. مكان سرئيس الجنين شمال شرق في طبق sylgard العقيمة التي تحتوي على تشريح البارد
    2. الحل. العمل تحت المجهر تشريح في التكبير من ~ 1.6X، لشل حركة رأس الجنين عن طريق وضع دبابيس Minutien حول أو أقرب إلى منطقة العين (الشكل 1A).
    3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط معقم إزالة بعناية الجلد وفتح الجمجمة على الجانب الظهري على طول خط الوسط (الشكل 1B). إزالة الدماغ من يمكن التعرف على تجويف الجمجمة والأذن الداخلية التي تقع داخل العظام الزمنية في هذه المرحلة (الشكل 1C، D). بطانة الأوعية الدموية، التي عادة ما تكون موجودة في جميع أنحاء الأذن الداخلية، ويمكن استخدامها كمعلم لتحديد الأذن الداخلية في هذه المرحلة (الشكل 1D).
    4. تشريح الأذن الداخلية من العظام الزمنية عن طريق وضع ملقط تحت الأنسجة وعزل الأذن الداخلية من قاعدة الجمجمة ونقل إلى طبق جديد يحتوي الحل تشريح الباردة (الشكل 1E، F).

2. جيل من الجهاز الثقافات كورتي يزدرع

ملاحظة: في هذه المرحلة من التنمية، والأنسجة الغضروفية هي ويمكن تشريح بسهولة باستخدام ملقط.

  1. الشرق الأذن الداخلية بحيث الجانب البطني يكون مواجها لها (الشكل 2A) وتحقيق الاستقرار في الأذن الداخلية عن طريق إدراج بلطف على نهاية حادة من الدبابيس Minutien من خلال الجزء الدهليزي في الأذن الداخلية (الشكل 2B).
  2. قطع متناهية الصغر باستخدام ملقط فتح الغضروف المغطي عن طريق شق باستخدام واحدة من نهاية ملقط بالقرب من النافذة البيضاوي وبعناية إزالة الغضروف من القوقعة (الشكل 2C).
    ملاحظة: من المهم للتأكد من أن ملقط لا تدرج كثيرا في الغضروف كما الغضروف المغطي تنصهر في بعض الأحيان مع قناة القوقعية وفي هذه الحالة فإنه من المفيد استخدام ملقط مغلقة لاطلاق سراح الغضروف من قناة القوقعية الأساسي عن طريق كشط تحت الصورةurface من الغضروف. في هذه المرحلة من التنمية، ودوامة القوقعة هي فقط ثلاثة أرباع منعطفا في الطول.
  3. وبعد ذلك، فضح ظهارة الحسية عن طريق وضع ملقط في المنطقة المفضل للقناة القوقعية، إما القاعدة أو في ذروة جدا، وسحب بلطف من سطح القوقعة (الشكل 2D).
    ملاحظة: سقف القوقعة يجب إزالة تماما كما يمكن أن تحجب الظهارة الحسية التي تحول دون تحليل.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإجراء بلطف لأنه من السهل المسيل للدموع الظهارة الحسية.
  4. وكخطوة الماضية، وإزالة بعناية النسيج الضام الكامنة من الظهارة الحسية تتعرض بحيث قاعدة يزدرع قوقعة فارغة بشكل موحد.
  5. عزل القوقعة تشريح من الجزء الدهليزي في الأذن الداخلية باستخدام ملقط. هذا لا يمكن أن يؤديها قبل أو بعد الخطوة 2.4 (الشكل 2E).
  6. نقل الظهارة الحسية قوقعة تشريح في الاغشيه الطابق السفليشمال شرق الثقافة جيدا باستخدام 1.5 ملم بالمغرفة معقمة (الشكل 2F) المغلفة المصفوفة.
  7. الشرق ازدراع القوقعة مع سطح lumenal من ظهارة تواجه صعودا ونضح الغشاء القاعدي مصفوفة DMEM حل لشد بعناية النسيج واستبدالها مع 150 ميكرولتر من مستنبت الطازجة عن طريق إضافة بلطف إلى الطبق. ينبغي توخي الحذر للتأكد من أن كل يزدرع تلتزم بشكل جيد للساترة الزجاج المطلي وليس يعوم في مستنبت. ضمان غيض من ملقط وأشار يصل بينما الالصاق إلى البئر الزجاج لتجنب إتلاف يزدرع القوقعة.
  8. بلطف نقل الطبق الثقافة في العقيمة 150 مم طبق ثقافة ومكان في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ للفترة من الوقت المطلوب، وعادة 3-6 أيام في المختبر (DIV). بعد 1 DIV، ودراسة الثقافات تحت المجهر تشريح للتأكد من أن يزدرع القوقعة التزمت كذلك إلى الطبق الثقافة.
  9. بعد فيcubation في المختبر لفترات من الوقت المطلوب، تتم معالجة الثقافات لالمناعية.
    ملاحظة: الثقافات يزدرع عادة ما يتم تحضين لمدة 6 DIV وهو ما يعادل المرحلة التنموية، P0. بعد مرور فترة الحضانة في المختبر والثقافات يمكن معالجتها لمزيد من التطبيقات المصب مثل المناعية (الشكل 3B)، RT-PCR، التهجين في الموقع، و / أو لطخة غربية في.

3. بوساطة Electroporation للنقل الجينات

  1. إنشاء ل electroporation:
    1. تعقيم واحدة 100 ملم صحن الزجاج Sylgard المغلفة من قبل التعقيم أو تمرغ في الايثانول 70٪ لمدة 20 دقيقة والسماح للهواء الجاف في مقاعد البدلاء النظيفة قبل استخدامها.
    2. إعداد DNA من متجه التعبير عن خيار استخدام maxi- أو ميدي الإعدادية مجموعات المناسبة. ناقلات التعبير المستخدمة في هذا البروتوكول هي pIRES2-Atoh1.EGFP وpCLIG-NeuroD1.EGFP. يجب أن يكون تركيز النهائي من الحمض النووي لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكرولتر في الحمض النووي معقم /خالية من ريبونوكلياز المياه.
  2. Electroporating الحمض النووي في إإكسبلنتس قوقعة الجنينية:
    1. إضافة 10 ميكرولتر من محلول الحمض النووي البلازميد إلى 100 ملم Sylgard المغلفة طبق الطازجة ونقل يزدرع القوقعة تشريح بالكامل (تم الحصول عليها من الخطوة 2.5) في حل DNA.
    2. مع سطح lumenal من ظهارة مواجهة، إمالة القوقعة قليلا بحيث انها عمودي على الطائرة من الطبق.
    3. ضع المجاذيف الكهربائي على جانبي القوقعة مع مجداف سلبي (الكاثود) نحو الظهارة الحسية ومجداف الإيجابي (الأنود) يقع بالقرب من قاعدة القوقعة.
      ملاحظة: بما أن اتهم DNA سلبا، فإنه يهاجر من السلبية إلى القطب الموجب وعن طريق وضع نهاية القطب السالب لجنة التحقيق المتاخمة للظهارة حسية. فإن DNA يذهب معظمها من خلال سطح الظهارة الحسية.
    4. باستخدام electroporator، وتقديم 9-10 نبضات من 24 فولت، 30 ميللي ثانية مدة النبضة مع التبديل دواسة القدم على رانه electroporator، ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​الدافئة الثقافة إلى القوقعة electroporated.
    5. كرر الخطوات من 3.2.1-4 لجميع إإكسبلنتس قوقعة وDNA من جميع الجينات في المصالح ونقل القوقعة electroporated في طبق المغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي للتصفيح (الخطوة 2.7). ثقافة كل القوقعي electroporated في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لفترات من الوقت المطلوب الذي سيتم بعد ذلك المجهزة للمناعية.
      ملاحظة: القوقعة من القمامة كاملة من CD1 الماوس (حوالي 8-12 الجراء) يمكن عزل، microdissected، electroporated ومطلي في <4 ساعة.

4. تحليل الثقافات القوقعة يزدرع

ملاحظة: عادة ما يتم تحضين الثقافات لمدة 6 DIV وهو ما يعادل المرحلة التنموية، P0. بعد مرور فترة الحضانة في المختبر، يتم إصلاح الثقافات ومعالجتها للمناعية.

  1. بعد طول المرجوة من المؤتمر الوطني العراقيubation، وإزالة مستنبت وبسرعة شطف يزدرع القوقعة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، واحتضان في 4٪ بارافورمالدهيد (المعد في PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل مثبت من قبل PBS إضافة وشطف في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة.
  3. Permeabilize باستخدام PBS-T (PBS + 0.5٪ توين) لمدة 30 دقيقة قبل حجب مع تحتوي على 10٪ مصل الماعز PBS-T.
  4. احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني-T مع 1٪ مصل الماعز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. غسل القوقعة ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة باستخدام PBS-T 15 دقيقة لكل منهما قبل أن يضيف الأجسام المضادة الثانوية اليكسا-مترافق المناسبة.
  6. منذ يزدرع القوقعة هو مثقف على الزجاج ساترة يمكن التعامل معها بشكل فردي عن طريق عزل ساترة من الطبق وتصاعد على شريحة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق نقع الطبق الثقافة في OS30 مذيب لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام شفرة حلاقة معقمة، فصل ساترة من دإيش وجبل على شريحة وتصور تحت المجهر الفلورسنت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

We describe a method to isolate cochlea from embryonic inner ears and micro-dissect to expose the sensory epithelium. Once dissected, it may be plated and cultured as an intact cochlear duct (Figure 3) and analyzed by immunohistochemistry. The cultured cochlear explants provide a useful assay to examine the effect of variety of soluble factors and pharmacological drugs on cochlear development. Following dissection of cochlear explants, electroporation technique can be used to misexpress genes of interest...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

كل الخلايا داخل التيه الغشائي في الأذن الداخلية الماوس بما في ذلك الحسية، وnonsensory وتستمد جميع الخلايا العصبية دوامة من العقدة المستمدة placodally-الكيسة السمعية يقع بالقرب من الدماغ المؤخر من الأديم الظاهر، حول E8 10-14. في E11، المنطقة البطنية من الكيسة السمعية تمتد لت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Acknowledgements

We would like to acknowledge Dr. Bradley Schulte for comments on this protocol. This work was supported by National Institutes of Health grant R00 (5R00DC010220). This project was performed in a renovated laboratory space supported by Grant C06RR014516.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HBSSGibco14065-056
HEPESGibco15630-080
Dulbecco’s Modified MediumGibco12430-054
Fetal bovine serumGibco10082
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
Ciprofloxacin hydrochlorideCellgro61-277-RF
Glass Dish 60 mmKimble Chase23062-6015/23064-6015
Glass Dish 100 mmKimble Chase23064-10015/23062-10015
Minutien pinsFine Science Tools26002-15
Dumont #5 forcepsFine Science Tools11251-10
Pulse generatorProtech International IncCUY21Vivo-SQ
Glass bottom culture dishesMatTekP35G-0-10-C
Matrigel matrixBD Biosciences356237
Culture dish, 60 x 15 mmBecton Dickinson353037
Tissue culture dishesGreiner Bio-one639160
Phosphate buffered salineGibco10010-023
OS-30Dow Corning4021768
FluoromountSouthern Biotech0100-01
Conical tubes, 15 mlGreiner Bio-one188261
Myosin 6Proteus Biosciences Inc25-6791
Myosin 7aProteus Biosciences Inc25-6790
TuJ1SigmaT2200

References

  1. Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
  2. Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
  3. Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
  4. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  5. Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
  6. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  7. Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
  8. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
  9. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
  10. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
  11. Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
  12. Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
  13. Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
  14. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  15. Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
  16. Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

95 Electroporation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved