في الوقت الحقيقي الكهربية: استخدام البروتوكولات ذات الحلقات المغلقة للتحقيق العصبية حيوية وما بعدها

Daniele Linaro; João Couto; Michele Giugliano

doi:10.3791/52320

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Abstract

علم الأعصاب التجريبي يشهد اهتماما متزايدا في تطوير وتطبيق الرواية وغالبا ما تكون معقدة والبروتوكولات حلقة مغلقة، حيث تطبق التحفيز يعتمد في الوقت الحقيقي على الاستجابة للنظام. وتتراوح التطبيقات التي صدرت مؤخرا عن تنفيذ نظم الواقع الافتراضي لدراسة الاستجابات الحركية في كل من الفئران ¹ و ² في الزرد، للسيطرة على النوبات التالية السكتة الدماغية القشرية باستخدام optogenetics ^3. والميزة الرئيسية لتقنيات حلقة مغلقة تكمن في القدرة على سبر خصائص أعلى من الأبعاد التي لا يمكن الوصول إليها مباشرة أو التي تعتمد على متغيرات متعددة مثل استثارة الخلايا العصبية ⁴ والموثوقية، وفي الوقت نفسه تحقيق أقصى قدر من الإنتاجية التجريبية. في هذه المساهمة وفي سياق الكهربية الخلوية، ونحن تصف كيفية تطبيق مجموعة متنوعة من البروتوكولات حلقة مغلقة لدراسة خصائص استجابة الخلايا العصبية القشرية هرمي، التوصيةأورديد داخل الخلية مع تقنية المشبك التصحيح في شرائح الدماغ الحادة من القشرة الحسية الجسدية من الفئران الأحداث. كما لا يقدم أي برمجيات المصدر المتاحة تجاريا أو فتح جميع الميزات المطلوبة لأداء بكفاءة التجارب وصفها هنا، تم تطوير برنامج مربع أدوات جديدة تسمى LCG ^5، الذي يعظم إعادة استخدام التعليمات البرمجية للكمبيوتر ويسهل تنفيذ النماذج التجريبية رواية هيكل وحدات. يتم تحديد الطول الموجي التحفيز باستخدام المدمجة الفوقية الوصف ويتم وصف البروتوكولات التجريبية الكاملة في ملفات التكوين يستند إلى نص. بالإضافة إلى ذلك، LCG لديه واجهة سطر الأوامر التي هي مناسبة لتكرار التجارب وأتمتة البروتوكولات التجريبية.

Introduction

في السنوات الأخيرة، تطورت الكهربية الخلوية من التقليدي نموذج حلقة مفتوحة العاملين في التيار الكهربائي والمشبك الحالي تجارب لحديثة بروتوكولات حلقة مغلقة. تقنية حلقة مغلقة أشهرها وربما كان المشبك دينامية ^6،7، الأمر الذي مكن حقن الاصطناعية من القنوات ايون الجهد بوابات الاصطناعية لتحديد غشاء الخلايا العصبية الجهد ^8، ودراسة متعمقة للآثار غير القطعية الخفقان على القنوات الأيونية على ديناميكيات استجابة الخلايا العصبية ^9، فضلا عن الترفيه في المختبر من واقعية في vivo- مثل النشاط خلفية متشابك ^10.

وتشمل غيرها من النماذج حلقة مغلقة التي تم اقتراحها المشبك رد الفعل ^11، للدراسة في المختبر توليد النشاط المستمر مكتفية ذاتيا، والاستجابة المشبك ^4،12، للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة استثارة الخلايا العصبية.

ontent "> هنا نحن تصف الإطار القوي الذي يسمح بتطبيق مجموعة متنوعة من البروتوكولات الكهربية المغلقة حلقة في سياق كامل الخلية التسجيلات المشبك التصحيح التي أجريت في شرائح الدماغ الحادة. نظهر كيفية تسجيل الجسدية غشاء الجهد عن طريق التسجيلات المشبك التصحيح في الخلايا العصبية الهرمية من القشرة الحسية الجسدية من الفئران الأحداث وتطبيق ثلاثة بروتوكولات مختلفة حلقة مغلقة باستخدام LCG، وهو برنامج الأدوات القائمة على سطر الأوامر نموا في مختبر البيولوجيا العصبية النظرية وNeuroengineering.

لفترة وجيزة، والبروتوكولات المذكورة هي، أولا الحقن الآلي من سلسلة من الطول الموجي المشبك التحفيز الحالية، ذات الصلة لتوصيف مجموعة كبيرة من خصائص الغشاء الإيجابي والسلبي. وقد اقترحت هذه للقبض على النمط الظاهري الكهربية من خلية من حيث الخصائص ردها على سلسلة نمطية من الطول الموجي التحفيز. تعرف علي اكواد الإلكتروني للخلية (على سبيل المثال، انظر & #160؛ ^13،14)، يتم استخدام هذه المجموعة من الاستجابات الكهربائية من قبل العديد من المختبرات لتصنيف موضوعي الخلايا العصبية على أساس خصائصها الكهربائية. ويشمل ذلك تحليل للعلاقة ثابتة نقل المدخلات والمخرجات (منحنى فاي)، بواسطة تقنية مبتكرة ينطوي على حلقة مغلقة، ومراقبة الوقت الحقيقي من معدل اطلاق النار عن طريق (PID) وحدة تحكم يتناسب-يتجزأ المشتقة والثانية في الترفيه واقعية في الجسم الحي تشبه خلفية النشاط متشابك في المختبر في الاستعدادات ^10، والثالث على اتصال الاصطناعي في الوقت الحقيقي من اثنين من الخلايا العصبية الهرمية سجلت في وقت واحد عن طريق GABAergic عصبون الظاهري، الذي هو محاكاة بواسطة الكمبيوتر.

بالإضافة إلى ذلك، LCG تطبق تقنية تعرف باسم نشط الكهربائي التعويض (AEC) ^15، والذي يسمح بتنفيذ البروتوكولات المشبك الديناميكية باستخدام قطب واحد. وهذا يسمح تعويض آثار غير مرغوب فيها (أrtifacts) من تسجيل الكهربائي التي تنشأ عندما يتم استخدامها لتقديم المحفزات داخل الخلايا. وتستند هذه الطريقة على تقدير غير حدودي من الخواص الكهربائية ما يعادل الدائرة تسجيل.

التقنيات والبروتوكولات التجريبية وصفها في هذه الورقة يمكن تطبيقها بسهولة في التقليدي المفتوح حلقة الجهد والتجارب المشبك الحالية ويمكن أن تمتد إلى الاستعدادات الأخرى، مثل الخلية ^4،16 أو تسجيلات داخل الخلايا في الجسم الحي ^17،18. الجمعية دقيق لالإعداد لالمشبك التصحيح خلية كاملة الكهربية هو خطوة مهمة للغاية بالنسبة مستقرة، تسجيلات عالية الجودة. في ما يلي افترضنا أن مثل هذا الإعداد التجريبية متاحة بالفعل للاختبارات، ونركز اهتمامنا على وصف استخدام LCG. وأشار القارئ إلى ^19-22 للحصول على نصائح إضافية حول التحسين والتصحيح.

Protocol

بروتوكول الموصوفة هنا يتوافق مع التوصيات والمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في قسم العلوم الطبية الحيوية من جامعة أنتويرب. هذا البروتوكول يتطلب إعداد المواد غير الحية من الدماغ explanted من الفئران ويستار الأحداث التي حصلت عليها تقنيات القتل الرحيم إنسانية المعتمدة.

1. معدات إعداد

تركيب وتكوين الحصول على البيانات ونظام التحفيز.
1. استخدام الكمبيوتر الشخصي (PC) مجهزة (دق) بطاقة الحصول على البيانات التي تدعمها كوميدى لتسجيل الإشارات وإرسالها مراقبة الفولتية التناظرية إلى مكبر للصوت الكهربية.
  ملاحظة: كوميدى هو وحدة لينكس والمكتبة التي تدعم العديد من بطاقات دق من الشركات المصنعة الأكثر شيوعا: زيارة http://www.comedi.org حصول على مزيد من المعلومات.
2. في حالة مكبر للصوت المشبك التصحيح التي تسيطر عليها الكمبيوتر قيد الاستخدام، توظيف PC الثاني إلى جانب واحد مخصص لمكبر للصوتالتحكم.
  ملاحظة: على الرغم من أن هذا الأخير قد يتم تشغيل نظام التشغيل التقليدي، فإن PC إضافي يكون التشغيل في الوقت الحقيقي من خلال نظام تشغيل خاص. في ظل هذه الظروف، وأنها مريحة لاستخدام واحد رصد، والماوس، لوحة المفاتيح وتعلق على PC إضافية، في حين ربط من قبل تطبيق سطح المكتب البعيد إلى كمبيوتر مخصص.
3. تحميل صورة ISO من CD لايف تحتوي في الوقت الحقيقي نظام التشغيل لينكس مع LCG المثبتة مسبقا من http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso وحرقها على قرص مضغوط أو USB العصا على بياض " .
4. ببساطة إدراج القرص المضغوط في محرك الأقراص من جهاز الكمبيوتر الذي يحتوي على بطاقة دق وبدء تشغيله. بدلا من ذلك، قم بتثبيت LCG من مستودع مصدره الانترنت على جهاز كمبيوتر يعمل على نظام التشغيل لينكس (على سبيل المثال، ديبيان أو أوبونتو). راجع دليل على الانترنت لمزيد من التفاصيل بشأن إجراءات التثبيت. والدليل هو متاح على شبكة الإنترنت في http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
5. التمهيد من قرص العيش: ثيالصورة سيتم تحميل نظام تكوين تلقائيا تماما. للقيام بذلك، ضع لايف CD LCG في محرك الأقراص CD-ROM الكمبيوتر وتمهيد الكمبيوتر من القرص المضغوط. حدد النواة في الوقت الحقيقي (الخيار الافتراضي) في أقرب وقت تظهر قائمة التمهيد والانتظار لنظام لتهيئة.
6. معايرة بطاقة دق بكتابة في موجه الأوامر:
  سودو comedi_calibrate
  أو
  سودو comedi_soft_calibrate
  اعتمادا على ما إذا كان متن الحصول على البيانات يدعم الأجهزة أو البرامج المعايرة، على التوالي (استخدام comedi_board_info سودو الأوامر للحصول على معلومات حول المجلس).
7. تعيين التناظرية إلى الرقمية المناسبة والرقمية إلى تناظرية عوامل التحويل: هذا يتطلب وجود الوصول إلى دليل من مكبر للصوت الكهربية الخلوية، وبخاصة مواصفاتها على عوامل تحولها.
8. استخدام محرر نص لتحديد القيم العددية المناسبة في /home/user/.lcg-env الملف، على متغيرات البيئة AI_CONVERSION_FACTOR_CC، AI_CONVERSION_FACTOR_VC، AO_CONVERSION_FACTOR_CC، AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
  ملاحظة: تمثل هذه المدخلات (AI) والإخراج (AO) مكاسب للالمشبك الحالي (CC) والمشبك الجهد (VC) وسائط، وعوامل التحويل بين الأوامر الجهد التي يقدمها الكمبيوتر والتيار أو الفولتية المتولدة عن مكبر للصوت ، على التوالي.
9. بدلا من ذلك، استخدام البرنامج النصي LCG المقدمة (ايجاد تحويل العوامل LCG)، للعثور على معاملات التحويل من له أو لها النظام.
  ملاحظة: القيم المحسوبة LCG-ايجاد-عوامل التحويل هي التخمينات، التي يتعين عليها أن تكون مبتورة عدديا في بعض الحالات أو تقريب لتعكس القيم الحقيقية للعوامل التحويل.
10. لاستخدام LCG-تجد-عوامل التحويل، تبدأ من خلال ربط "خلية نموذجية" التي غالبا ما يتم شراؤها مع مكبر للصوت لheadstage المقابلة. ثم، فتح المعبر على الجهاز لينكس حيث تقوم بتشغيل CD لايف وأدخل الأمر التالي في موجه قذيفة:
  قانون العملالعوامل تحويل ز العثور علي -i $ HOME / .lcg-الحياة الفطرية -o $ HOME / .lcg-الحياة الفطرية
  ملاحظة: في كلتا الحالتين (أي تعديل اليدوي لل/home/user/.lcg-env أو استخدام LCG-عثور على تحويل العوامل)، وثيقة وفتح المعبر لتصبح التغييرات نافذة المفعول.
11. إذا تم استخدام headstages متعددة، تعيين عوامل التحويل إلى نفس القيم في جميع القنوات. إذا لم يكن ذلك ممكنا، راجع دليل على الانترنت LCG لفهم كيفية استخدام عوامل التحويل متعددة في LCG التحفيز أو كيفية إنتاج ملفات التكوين التي تناسب بشكل أفضل احتياجات المستخدم.

2. إعداد الحاد الدماغ شرائح من القشرة الحسية الجسدية

إعداد الحلول لالكهربية.
1. تحضير السائل الاصطناعي الدماغية-الشوكي (ACSF) عن طريق خلط (مم) 125 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 1.25 ناه ₂ PO ₄ و 26 NaHCO _3، 25 الجلوكوز، 2 CaCl _2، و 1 MgCl _2. إعداد 10X حلول المستودعات للتقليل منإعداد الوقت على يوم من التجربة. إعداد 2 لتر، واحدة منها سوف تستخدم لإعداد شرائح والآخر للتسجيل.
2. تشبع ACSF مع 95٪ O ₂ و 5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بداية الإجراء.
3. للحصول على تسجيلات المشبك الحالية، استخدم الحل داخل الخلايا (ICS) التي تحتوي على (مم) 115 K-غلوكونات، 20 بوكل، 10 HEPES، 4 ATP-المغنيسيوم، 0.3 نا ₂ -GTP، 10 نا ₂ -phosphocreatine. إعداد الحل في الجليد وتصفية ذلك قبل بداية التسجيلات للقضاء على خطر انسداد ماصة.
استخراج الدماغ.
1. تخدير الحيوان وضع الحيوان في غرفة الاستقراء مع 4٪ الأيزوفلورين وبسرعة قطع رأس ذلك باستخدام المقصلة أو مقص كبير.
2. قطع الجلد على طول خط الوسط والانزلاق إلى الأذنين.
3. باستخدام زوج من مقص غرامة قطع الجمجمة على طول خط الوسط. الحفاظ على شفرة أقرب وقت ممكن إلى thسطح ه وذلك للحد من الأضرار التي لحقت الدماغ الكامنة. فتح الجمجمة مع زوج من ملاقط، واستخدام ملعقة لقطع العصب البصري والدماغ وبلطف إسقاط الدماغ في ACSF الجليد الباردة.
4. فصل المخيخ ونصفي الكرة الأرضية مع مشرط (شفرة 24).
5. إزالة الماء الزائد من أحد نصفي الكرة الأرضية والغراء على منصة يميل باستخدام قطرة من superglue. بسرعة إضافة بضع قطرات من ACSF على الدماغ وتحويلها إلى غرفة vibratome.
  ملاحظة: عند إعداد شرائح السهمي، وزاوية من منصة مهمة لتجنب إتلاف التشعبات من الخلايا الهرمية خلال إجراء تشريح.
إعداد الشرائح.
1. ضع شفرة على الدماغ والتخلص من أول 2،5-3 ملم. ضبط سرعة وتيرة للحد من الأضرار التي لحقت سطح شريحة في الوقت نفسه التقليل من الوقت اللازم لإجراء تشريح.
2. تعيين سمك إلى 300 μم والبدء في تشريح. مرة واحدة وقد ذهب شفرة الماضي القشرة، استخدام شفرة حلاقة أو إبرة عازمة على خفض فوق الحصين وعلى حواف المنطقة القشرية من الفائدة.
3. وضع شرائح في غرفة الحضانة متعددة جيدا أبقى في 32-34 درجة مئوية.
4. سحب شفرة وتكرار النقاط 2.3.2 و2.3.3 حتى 5 - يتم قطع 8 شرائح. أفضل شرائح وعادة ما تكون تلك حيث الأوعية الدموية هي موازية لسطح الأرض.
5. احتضان شرائح لمدة 30 دقيقة بعد وضع شريحة مشاركة في الغرفة.

3. تسجيلات التصحيح، المشبك من طبقة الخلايا العصبية الهرمية 5

وضع شريحة في غرفة تسجيل والبحث عن الخلايا السليمة. هذه الخلايا عادة ما يكون المقابل أقل، وهو مظهر ناعم وليست منتفخة.
تفقد شريحة تحت المجهر مع عدسة التكبير 40X والبحث عن الخلايا في طبقة 5، تقع على بعد نحو 600 إلى 1000 ميكرون من سطح الدماغ.
مرة واحدة تم العثور على خلية مناسبة، الثالث تحميل واحد من micropipette مع ICS ووضعه في headstage.
على جهاز كمبيوتر شخصي بتشغيل CD الحية أو نظام التشغيل لينكس معرفة مسبقا، وإطلاق قذيفة الأوامر (على سبيل المثال، باش) وعلى نوعه موجه الأمر LCG-صفر. وهذا يضمن أن مجلس دق لا يقود مكبر للصوت.
تطبيق 30-50 مليبار من الضغط الايجابي عن طريق الضغط على المكبس من حقنة المشتركة، متصلة بواسطة أنابيب لصاحب ماصة، وبمساعدة المجهر، ضع ماصة ما يقرب من 100 ميكرون فوق شريحة.
ملاحظة: ضع ماصة في وضع يسمح طريقا مباشرا إلى الخلية المستهدفة، ويفضل استخدام وضع نهج للmicromanipulator.
بناء على الضوابط مكبر للصوت الكهربية، وضبط ماصة تعويض وإخراج نبض الاختبار (10 فولت) في وضع المشبك الجهد.
تخفيف الضغط على 10-30 ملي بار (اعتمادا على حجم ماصة) من خلال سحبمكبس الحقنة. الاقتراب بلطف الخلية وتحقق لتشكيل الدمل من خلال مراقبة الصورة على الشاشة كاميرا فيديو. رصد نبض اختبار للزيادة في المقاومة في جميع الأوقات، من خلال مشاهدة الموجي الحالي المعروض على الذبذبات متصلة مكبر للصوت الكهربية (بدلا من ذلك يمكنك استخدام الأمر LCG ختم اختبار لرصد المقاومة ماصة).
الافراج عن الضغط وإذا لزم الأمر الضغط السلبي لطيف لماصة للمساعدة في تشكيل ختم عندما لاحظت زيادة في المقاومة ماصة وتشكيل "الدمل" في الخلية.
في حين أن الأشكال الختم، وتنخفض تدريجيا إمكانية عقد ل-70 بالسيارات.
وبعد الحصول على ختم gigaohm، تأكد من أن عقد الحالي هو بين 0-30 السلطة الفلسطينية. تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي (شفط) لكسر الغشاء وإنشاء تكوين خلية كاملة. بدلا من ذلك، يمكنك حقن نبضات قوية وجيزة من الجهد ( أي باستخدام الأمر "ZAP" على مكبر للصوت أو عقد الخلية في سلبية للغاية) لتمزق الغشاء، وهذا يتوقف على إعداد والزجاج ماصة المستخدمة.
التبديل إلى وضع المشبك الحالي وتحقق من أن غشاء المحتملة يستريح هي الحال في خلية سليمة. لالخلايا العصبية الهرمية القشرية باستخدام حل يقوم البوتاسيوم غلوكونات، هذه القيمة هي عادة بين -65 و -75 بالسيارات.

4. توصيف شبه التلقائي للخصائص الاستجابة الكهربائية من العصبون

إنشاء دليل لتخزين بيانات المستخدم. من أجل القيام بذلك لتوظيف السيناريو المدرجة في LCG يعيش CD الذي يخلق المجلدات استنادا إلى التاريخ. لاستخدامها، اكتب في موجه الأوامر
مؤتمر نزع السلاح ~ / التجارب
LCG-إنشاء تجربة-المجلد -s شرطة الأمن العام، in_vivo_like
هذا سيخلق المجلد حيث سيتم حفظ البيانات لتلك الخلية (و"PSP" و "in_vivo_like 'المجلدات الفرعية)، وأنه سيتم طباعة اسمها إلى محطةنافذة. ومن الممكن أيضا لتخزين معلومات إضافية مثل مقاومة ماصة ونوع من الخلايا باستخدام هذا البرنامج النصي.
تغيير الدليل إلى المجلد الذي تم إنشاؤه حديثا باستخدام الأمر
مؤتمر نزع السلاح ~ / <اسم المجلد>
اسم المجلد هو واحد المعروضة بواسطة الأمر LCG-إنشاء تجربة-المجلد وسيكون الطابع الزمني لليوم الحالي (أي شهرا يوم السنة)، كما هو الحال في 20140331A01.
تأكد من أن يتم تعيين مكبر للصوت للعمل في وضع المشبك الحالي، أن الكبلات متصلة والأمر الجهد الخارجي من مكبر للصوت، إذا كان موجودا، يتم تمكين.
أدخل الأمر LCG-ecodeat موجه الأوامر. وهذا يستدعي سلسلة من الأوامر (أي LCG-ا ف ب، LCG الى السادس، LCG المنحدر، LCG-تاو وLCG-الخطوات)، وتستخدم لوصف خصائص الاستجابة الأساسية للخلية. يتطلب LCG-ecode أن للمستخدم تحديد معلمتين: سعة النبض 1 مللي طويلة من الحالية المستخدمة للحصول على ارتفاع واحد في الخلية، والسعة القصوى للذاكرة الوصول العشوائي الحاليحقن ص في الخلية للعثور على قرارة التيار لها.
استخدم بناء الجملة الأمر التالي:
LCG-ecode --pulse-السعة X---ramp السعة Y
مع اختيار قيم X و Y (في السلطة الفلسطينية) التي هي كافية لجعل النار خلية في استجابة لنبض 1 مللي طويلة وحقن المستمر للتيار، على التوالي.
ملاحظة: هذه البروتوكولات تتطلب أداء التقدير العددي لل"نواة القطب" من أجل استخدام الكهربائي التعويض النشط (AEC) ^15. ويتم استخدام حقن الحالي صاخبة لتقدير النواة ويتم مطالبة المستخدم بتأكيد عدد العينات التي تشكل النواة. الاطلاع على ¹⁵ للحصول على معلومات مفصلة عن معنى نواة الكهربائي وكيفية اختيار عدد من عينات النواة.

5. حقن من المواصلة من خلال مقلد نقاط الاشتباك العصبي ومحاكاة في فيفو تشبه خلفية آخر

حقن إمكانات بعد متشابك مثير محاكاة
1. تغيير إلى الدليل الذي سيوفر لكم التجربة القادمة، عن طريق كتابة الأمر التالي في موجه الأوامر قذيفة:
  مؤتمر نزع السلاح PSP / 01
2. نسخ ملف تكوين LCG إلى الدليل الحالي وفتحه مع محرر نصوص (نانو في هذا المثال) عن طريق كتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة (يتم تضمين هذا الملف التكوين سبيل المثال في شفرة المصدر ومؤتمر نزع السلاح الحي) :
  حزب المحافظين ~ / المحلية / SRC / LCG / تكوينات / epsp.xml
  نانو epsp.xml
  ملاحظة: هذا هو ببساطة ملف نصي مع كيانات مختلفة متصلة مع بعضها البعض. لمزيد من التفاصيل راجع قسم ممثل النتائج.
3. إذا تحرير ما يلزم من inputChannel، outputChannel، وinputConversionFactor وoutputConversionFactor في هذا الملف لمباراة الإعداد للمستخدم.
4. حساب نواة القطب اللازمة لأداء التعويض القطب النشط "الطريقة التي يستخدمها LCG لأداء القطب واحد المشبك الديناميكي" بإصدار كومماند
  LCG نواة
  وهذه المطالبة عدد من النقاط في النواة. مرة أخرى، حدد عدد بحيث نواة القطب تغطي نهاية الذيل تسوس الأسي.
5. إجراء تجربة المشبك الديناميكية باستخدام الأمر
  LCG-تجربة epsp.xml -c
6. قائمة الملفات وتصور النتائج باستخدام الأمر
  ليرة سورية -l
  LCG مؤامرة ملف -f آخر
حقن إمكانات بعد متشابك المثبطة محاكاة
1. إنشاء مجلد ونسخ الملف epsp.xml إليها عن طريق كتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة:
  MKDIR ../02
  حزب المحافظين epsp.xml ../02/ipsp.xml
  مؤتمر نزع السلاح ../02
2. تحرير ملف التكوين باستخدام محرر نص: تغيير إمكانية انعكاس متشابك والارتفاع والوقت اضمحلال ثوابت Exp2Synapse نموذج المشبك لما يلي:
  المعلمات>
  -80
  0.8e-3
  <رauDecay> 10E-3
  <المعلمات>
  قم بإنهاء محرر النصوص.
3. حساب نواة الكهربائي وإجراء التجربة كما هو الحال في 5.1، وذلك بكتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة:
  LCG نواة
  LCG-تجربة ipsp.xml -c
4. قائمة الملفات وتصور النتائج، وذلك بكتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة:
  ليرة سورية -l
  LCG مؤامرة ملف -f
محاكاة في الجسم الحي تشبه النشاط الخلفية:
1. تغيير إلى الدليل الذي تريد حفظ التجربة التالية، كما هو موضح سابقا، وذلك بكتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة:
  مؤتمر نزع السلاح ../../in_vivo_like/01
2. نسخ ملف التكوين من LCG الدليل المصدر، عن طريق كتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة:
  حزب المحافظين ~ / المحلية / SRC / LCG / تكوينات / in_vivo_like.xml
  نانو in_vivo_like.xml ملاحظة: هذا الملف هو ببساطة سلسلة من سابقاتها. عمليتين بواسون نقطة التي تولد القطارات السنبلة، والتي بدورها تغذي نقاط الاشتباك العصبي نموذج المثبطة ومثير، وتوليد النشاط الخلفية.
3. ضبط معلمات التكوين دق من أجل الإعداد للمستخدم، كما هو موضح في 5.1.3 والخروج من المحرر.
4. حساب نواة الكهربائي وإجراء التجربة كما هو الحال في 5.1، وذلك بكتابة الأوامر التالية في موجه الأوامر قذيفة:
  LCG نواة
  LCG-تجربة in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3
  وتشير مفاتيح "-n 10" و "-i 3 'أن التحفيز ينبغي تكرار 10 مرات على فترات من ثلاثة ثانية.
5. تصور آثار الخام باستخدام الأمر التالي في موجه الأوامر قذيفة:
  LCG مؤامرة ملف -f جميع

النتائج

في الأجزاء السابقة، التي وصفناها كيفية استخدام برنامج LCG الأدوات لتوصيف الخصائص الكهربية للخلايا هرمية L5 وإعادة في الجسم الحي تشبه النشاط متشابك في إعداد شريحة. استخدام واجهة سطر الأوامر وبروتوكول شبه الآلي يفضل استنساخ وكفاءة التجربة، التي يمكن أن يكون لها تأ...

Discussion

في هذا النص بروتوكول الكامل للتنفيذ في الوقت الحقيقي، وصفت حلقة مغلقة خلية واحدة تجارب الكهربية، وذلك باستخدام تقنية المشبك التصحيح ومجموعة أدوات برنامج تم تطويره مؤخرا دعا LCG. لتحسين جودة التسجيلات فمن الأهمية بمكان أن الإعداد تسجيل أن ترتكز بشكل صحيح، محمية والاه...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue slicer	Leica	VT-1000S
Pipette puller	Sutter	P-97
Pipettes	WPI	1B150F-4	1.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation table	TMC	20 Series
Microscope	Leica	DMLFS	40X Immersion Objective
Manipulators	Scientifica	PatchStar
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	Computer controlled
Data acquisition card	National Instruments	PCI-6229	Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computer	Dell	Optiplex 7010 Tower	OS: real-time Linux
Oscilloscopes	Tektronix	TDS-1002
Perfusion Pump	Gibson	MINIPULS3	Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controller	Multichannel Systems	TC02	PH01 Perfusion Cannula
Manometer	Testo	510	Optional
Incubator	Memmert	WB14
NaCl	Sigma	71376	ACSF
KCl	Sigma	P9541	ACSF, ICS
NaH₂PO₄	Sigma	S3139	ACSF
NaHCO₃	Sigma	S6014	ACSF
CaCl₂	Sigma	C1016	ACSF
MgCl₂	Sigma	M8266	ACSF
Glucose	Sigma	G7528	ACSF
K-Gluconate	Sigma	G4500	ICS
HEPES	Sigma	H3375	ICS
Mg-ATP	Sigma	A9187	ICS
Na₂-GTP	Sigma	51120	ICS
Na₂-Phosphocreatine	Sigma	P7936	ICS

References

Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: