النمذجة 3D من جانبي البطينات ونسيجية توصيف الأنسجة المحيطة بالبطين في البشر والفأر

Summary

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain’s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Abstract

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Introduction

والبطانة العصبية خطوط أحادي الطبقة خلية النظام البطين من الدماغ توفير وظائف الحاجز ونقل ثنائية الاتجاه بين السائل الدماغي الشوكي (CSF) والسائل الخلالي (ISF) ^1-3. هذه الوظائف تساعد على إبقاء المخ والتوازن الفيزيولوجي ^2،3 خالية من السموم. في فقدان البشر أجزاء من هذه البطانة بسبب الاصابة أو المرض لا تظهر أن يؤدي إلى استبدال التجديدي كما وجدت في بطانة الظهارية الأخرى؛ بدلا فقدان التغطية خلية البطانة العصبية تظهر أن يؤدي إلى دباق النجمي البطينات الدماغية مع شبكه من الخلايا النجمية التي تغطي المناطق الجرداء من خلايا البطانة العصبية على سطح البطين. يمكن توقعها انعكاسات خطيرة على آليات CSF / تبادل قوى الأمن الداخلي وإزالة الهامة التي تنجم عن فقدان هذه الطبقة الظهارية ^1،2،4-7.

يتم تكبير وثمة سمة مشتركة للشيخوخة الإنسان البطينات الجانبية (ventriculomegaly) وما يرتبط بها من وذمة محيط بالبطين بصفة مراقبإد طريق التصوير بالرنين المغناطيسي وسائل مخفف انعكاس الانتعاش MRI (MRI / FLAIR) ^14/08. للتحقيق في العلاقة بين ventriculomegaly وتنظيم الخلوية من بطانة البطين، ويقابل بعد الوفاة تسلسل MRI الإنسان مع الاستعدادات النسيجية للبطين الجانبي الأنسجة المحيطة بالبطين. في حالات ventriculomegaly، ومساحات كبيرة من دباق محل تغطية خلية البطانة العصبية على طول الجدار البطين الجانبي. عندما لم يتم الكشف عن توسع البطين عن طريق تحليل حجم استنادا MRI، وكانت بطانة البطانة العصبية خلية سليمة ولم يتم الكشف دباق على طول بطانة البطين ^6. هذا النهج التوافقي يمثل أول التغييرات ثائق تفصل الشاملة في سلامة الخلوية من بطانة البطين الجانبي استخدام مستحضرات wholemount من أجزاء أو كامل جدار البطين الجانبي والنمذجة 3D كميات البطين ^6. العديد من الأمراض (مرض الزهايمر، انفصام الشخصية) والإصابات (إصابات في الدماغ)عرض ventriculomegaly كميزة عصبية مرضية في وقت مبكر. يمكن توقعها تعرية المناطق من بطانة خلايا البطانة العصبية بالتالي تتداخل مع وظيفة عادية الخلية البطانة العصبية وتؤثر سلبا على التوازن استتبابي بين CSF / السائل قوى الأمن الداخلي وتبادل المذاب. وبالتالي، فإن إجراء فحص أكثر دقة من التغييرات على نظام البطين، تكوينها الخلوي، والعاقبة للهياكل الدماغ الكامنة أو المجاورة تبدأ في نهاية المطاف لكشف المزيد عن أمراض الأعصاب المرتبطة البطين التوسيع.

عدم وجود بيانات التصوير المتعدد الوسائط، وعلى وجه الخصوص تسلسل البيانات الطولية، جنبا إلى جنب مع محدودية فرص الحصول على عينات الأنسجة النسيجية المقابلة يجعل تحليل أمراض الدماغ البشري صعوبة. كثيرا ما يمكن تحقيقه نمذجة الظواهر الموجودة في شيخوخة الإنسان أو المرض مع نماذج الماوس والنماذج الحيوانية تصبح واحدة من أفضل الوسائل المتاحة لنا لاستكشاف أسئلة حول بدء المرض البشري والتقدم. العديد من الدراسات فيوقد وصفت الفئران الشابة صحية والتهندس الخلوي للجدران البطين الجانبي والخلايا الجذعية الكامنة المتخصصة ^4،7-15. وقد تم تمديد هذه الدراسات لتشمل 3D النمذجة والتحليل الخلوي للجدران البطين خلال الشيخوخة ^6،15. ولوحظت لا دباق البطينات الدماغية ولا ventriculomegaly في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين، بدلا تعرض الفئران منطقة subventicular قوية نسبيا (SVZ) تنبع مكانة خلية تحتاني إلى خلية البطانة العصبية سليمة بطانة ^6،15. وبالتالي، توجد اختلافات ضرب أنواع محددة في كل من الصيانة العامة وسلامة بطانة البطين الجانبي أثناء عملية الشيخوخة ^6،15. لذلك، لأفضل الفئران استخدام لاستجواب الظروف الموجودة في البشر، تحتاج الاختلافات بين النوعين يتسم ويعتبر مناسب في أي نموذج النمذجة. هنا، نقدم إجراءات لتقييم التغيرات الطولية إلى البطينين الوحشي والأنسجة المرتبطة محيط بالبطين في كل من البشر وم[أوس]. وتشمل إجراءاتنا 3D تقديم وvolumetry كل من الفأر والبطينين البشري، واستخدام التحليل المناعى الاستعدادات جبل كاملة من الأنسجة المحيطة بالبطين لتوصيف كل من منظمة الخلوية وهيكل. معا توفر هذه الإجراءات وسيلة لوصف التغييرات في النظام البطين والأنسجة محيط بالبطين المرتبطة بها.

Protocol

تمت الموافقة على إجراءات الحيوان من جامعة كونيتيكت IACUC وتتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة: ​​ملاحظة. وكانت الأنسجة البشرية وتحليل البيانات والإجراءات في الامتثال لها والموافقة عليها من قبل جامعة كونيتيكت IRB وتتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.

1. الفأر: تحليل حول البطينات الدماغية الخلوية النزاهة و 3D النمذجة للبطين الوحشي

1.1) إعداد ماوس الجانبي البطين جدار الجبال الجامعة

1. إعداد الماوس الجانبية البطين يتصاعد كلها لالمناعية (IHC) كما هو موضح سابقا ^16،17.

1.2) المناعية لتحليل البطين الجانبي

1. إصلاح الأنسجة وقسم مخ الفأر كما هو موضح سابقا ^18،19.
   1. لفترة وجيزة والفئران تدفق transcardially مع وضعها الطبيعي، درجة حرارة الغرفة المالحة، حتى تطهيرها أجهزة (المشار إليها تلوين شاحب)، تليها درجة حرارة الغرفة 4٪ لامتصاص العرق(PFA) في 0.1 M الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حتى الأنسجة وتشديد.
   2. إزالة الدماغ من الجمجمة. استخدام مقص تشريح القزحية لقطع من قاعدة الجمجمة على طول الدرز السهمي.
   3. فضح الجمجمة والدماغ إزالة بالملقط. تزج الدماغ في 4٪ PFA تثبيتي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم يغسل 3 مرات لمدة 20 دقيقة مع برنامج تلفزيوني.
2. يعد مسلسل أقسام لالمناعية وتحليل الصوت.
   1. باستخدام مشرط المجهرية، وجعل شق صغير طولي على طول القشرة من نصف الكرة المخية الأيسر للسماح التعرف على نصف الكرة المخية الأيسر من النصف الأيمن عند immunostained أقسام العائمة.
   2. يغلف العقول في 3٪ الاغاروز للحصول على الدعم الهيكلي وأضاف ثابت خلال vibratome باجتزاء. دافئ 3٪ الاغاروز في الماء المقطر (ث / ت) حتى يذوب تماما سواء باستخدام الميكروويف أو صفيحة ساخنة.
   3. بشفرة حلاقة، إزالة القسم الذيلية من الدماغ في المخيخ معقطع الاكليلية، وترك على سطح مستو، وحتى. تطبيق الغراء سوبر لمرحلة النسيج ووضع الدماغ على سطح قطع حديثا مع بصيلات الشم التي تواجه التصاعدي.
   4. عندما يبرد الحل الاغاروز السائل إلى درجة حرارة دافئة فقط للمس، وتطبيق بالتساوي على الدماغ ليغلف تماما الدماغ بأكمله. السماح للالاغاروز ليصلب.
   5. القسم المغطى الاغاروز العقول coronally على vibratome إلى 50 ميكرون أقسام، مع أقسام وضعت بشكل متسلسل في 24 لوحة جيدا تحتوي على برنامج تلفزيوني من أجل الحفاظ على ترتيب تسلسلي.
      ملاحظة: تستخدم عادة 12 بئرا للدماغ واحد، مع مجموعة من الأنسجة التي تبدأ 5 أقسام قبل رؤية ظهور البطينين الوحشي بدءا جيدا A1، والانتقال عدديا حتى B6 والدراجات العودة إلى A1. وهذا يسمح أقسام مميزة متعددة من نفس الدماغ ليتم معالجتها في غضون نفس البئر. لالجانبي تحليل حجم البطين، توقف جمع الأنسجة عند البطين الجانبيالصورة ودمج البطين الثالث، مما أدى إلى ما يقرب من 3 أقسام لكل بئر أو 36 مجموع الأجزاء.
   6. نضح PBS باستخدام ماصة نقل اضافته مع micropipette غيض 20-200 ميكرولتر لضمان أقسام عائمة لا يستنشق عن طريق الخطأ. كتلة وpermeabilize أقسام عائمة في 10٪ مصل، 0.1٪ تريتون X-100 (TX) في برنامج تلفزيوني (PBS-TX) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدام 300 ميكرولتر من محلول لكل بئر لتغطية أقسام الأنسجة التعويم الحر في لوحة 24-جيدا، وتأدية جميع حضانات للأقسام على طبق من ذهب هزاز.
   7. نضح عرقلة الحل، واحتضان المقاطع مع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني-TX بين عشية وضحاها (لا يقل عن 12 ساعة) في 4 درجات مئوية. لآثار حجم البطين باستخدام أقسام الاكليلية، استخدام الألغام المضادة للS100β الأجسام المضادة لخلايا البطانة العصبية تسمية.
   8. نضح حل الأجسام المضادة الأولية، وغسل المقاطع 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع PBS-TX.
   9. احتضان المقاطع في الظلام لمدة 1 ساعة على درجة حرارة الغرفةتلح مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورية، بتركيزات من 1: 1000 في 10٪ مصل، PBS-TX. الحفاظ المقاطع في الظلام لجميع الخطوات حضانة المتبقية.
   10. نضح حل الضد الثانوية واحتضان المقاطع مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole في برنامج تلفزيوني (دابي، 10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق إلى مباين نواة الخلية. نضح الحل دابي وشطف الأجزاء 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع برنامج تلفزيوني.
   11. جبل أقسام متسلسل على الشرائح باستخدام علامة القشرية للحفاظ على يقم مقابل الصحيح التوجه نصف الكرة الغربي. أقسام الجافة الهواء في ساترة مظلمة ثم من خلال تطبيق طبقة رقيقة من وسائل الاعلام المتزايدة إلى الشريحة بلطف ووضع ساترة الزجاج على القمة. السماح الشرائح coverslipped لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.

1.3) الإنقسام البطين الجانبي لإعادة بناء 3D

ملاحظة: إجراء البحث عن المفقودين في البطينات الجانبية باستخدام برنامج رسم الخرائط على epifluorescence microsco تستقيمالبولي ايثيلين مع مرحلة الآلي وكاميرا CCD الرقمية للكشف عن مضان.

1. بدوره على مضان المجهر المعدات وإطلاق برنامج رسم الخرائط في وضع مضان. فتح 'خيارات العرض' لتحميل أشرطة الأدوات المناسبة والألواح أداة لرسو السفن اللازمة لتتبع. خيارات> خيارات العرض> اكسسوارات، وحدد 'الرئيسة "وأشرطة' علامة '. في نفس القائمة، اختر 'كاميرا الرسم البياني'، 'مراقبة المتعددة'، 'إعدادات الكاميرا "و" الحصول على صورة "تحت عنوان" لوحات أداة لرسو السفن. "
2. نلاحظ بدايات البطينين على أساس قوي مضان S-100β أن تصف خلايا البطانة العصبية التي تبطن البطين الجانبي. تعرف على أول قطعة من الأنسجة التي تحتوي على البطينات الجانبية.
3. إنشاء ملف بيانات جديدة وتعيين نقطة مرجعية للحركة المسرح من خلال النقر في إطار الصورة أعلاه البطين الجانبي الأيسر. ابحث عن الصغيرةشق لتوجيه اليسار من النصف الأيمن. الحفاظ على نقطة مرجعية في مكان قريب متسقة إلى البطينين الوحشي عبر تتبع الملفات للمساعدة عند استيراد ملامح لإعادة الإعمار المسلسل.
4. حدد المناسب مسبقا نوع من كفاف كفاف القائمة المنسدلة، على سبيل المثال، "اليسار الجانبي البطين". استخدام اللون فريدة من نوعها لكل من اقتفاء أثر البطين الجانبي الأيسر والأيمن. إذا كانت مطلوبة تغييرات في اسم كفاف واللون، واذهب إلى خيارات> تفضيلات العرض> ملامح، ثم تعديل أسماء الألوان كفاف أو حدد "إضافة نوع كونتور".
5. مع كفاف من "اليسار الجانبي البطين" المحدد، انقر فوق على طول السطح القمي من بطانة البطانة العصبية لبدء كفاف أثر. تتبع البطين من خلال الاستمرار في النقر على التوالي على طول السطح القمي.
   1. بالنسبة للمناطق غير النظامية التي تتطلب المزيد من الجودة، انقر فوق والاستمرار على زر الماوس الأيسر من أجل تتبع يد. اضغط Ctrl + Z، أو الذهاب رس خيارات> التراجع عن التراجع عن نقطة كفاف السابقة. نقل إطار البحث عن المفقودين باستخدام مفاتيح الأسهم أو عن طريق نقطة كفاف قبالة الشاشة ويسمح الإطار إلى المركز نفسه تلقائيا. لإنهاء البطين تتبع انقر بزر الماوس الأيمن واختر "كونتور انهيار".
6. حدد لون كفاف الجديد (نوع كفاف) للبطين الجانبي الصحيح باستخدام القائمة المنسدلة. تتبع البطين الأيمن كما في الخطوة 1.3.4 لليسار.
7. إذا كانت مطلوبة تغييرات في اسم كفاف واللون، انقر بزر الماوس الأيمن على كفاف واختر تغيير كونتور نوع لاختيار اللون المناسب.
8. إضافة علامات على طول خط الوسط للمساعدة في التوفيق بين ملامح التسلسلية لإعادة الإعمار 3D. لإضافة علامات، حدد علامة المناسبة (استخدام 'X') من شريط الأدوات علامات على اليسار وانقر لإسقاطها على الشاشة البحث عن المفقودين. علامات استيراد جنبا إلى جنب مع ملامح لكل قسم الأنسجة أثر.
9. لإنقاذ آثار الأنسجة، حدد ملف> حفظملف البيانات كما وإنشاء مجلد وملف اسم جديد. عدد اقتفاء أثر [الشريحة #] - [الأنسجة #] لسهولة التعرف على آثار من مسلسل أقسام. على سبيل المثال، قسم الأنسجة الثالث على الشريحة الثانية له اسم الملف '2-3' ضمن الدليل لكل الدماغ.
10. كرر الخطوات من 1.3.4 إلى 1.3.9 لكل قسم التسلسلي للأنسجة المخ لتتبع البطينين من خلال الدماغ كله، باستثناء مناطق جدار البطين التصاق.
11. إذا البطين لديه منطقة الالتصاق، الجزء الفرعي المنطقة الأمامية من تلك ظهري وبطني لموقع التصاق. إنشاء نوعين كفاف جديدة لكل البطين (على سبيل المثال، "ظهري اليسار البطين" و "بطني اليسار البطين '). على شريحة الأنسجة الأولى مع التصاق، وتتبع البطين الجانبي مع كل من الأصلي الجانبي كفاف البطين وظهري الجديد وملامح بطني لضمان يمكن إنشاء التعمير البطين كاملة.
12. في أقسام الخلفية إلى ventriclالبريد الجدار التصاق، وخلق مجموعة من الألوان كفاف جديدة للجزء الخلفي من كل البطين (على سبيل المثال، "الخلفي الأيسر البطين '). انقر نقرا مزدوجا تتبع هذه أول مرة انضم إعادة القسم مع كل من التصاق الحالي وأنواع جديدة الخلفي كفاف.

1.4) إعادة الجانبي البطين 3D

1. محاذاة وتجميع اقتفاء أثر كفاف المسلسل من البطينات الجانبية الماوس لتوليد اعادة البناء 3D والبيانات الحجمية.
2. فتح برنامج إعادة الإعمار 3D. انقر فوق ملف> فتح وحدد الملف محيط القسم المسلسل تتبع أولا. استيراد اقتفاء أثر كفاف من البطين الأيمن والأيسر، فضلا عن أي علامات المضافة.
3. لتحديد الخطوط العريضة، انقر على زر "تحديد كائنات" (رمز المؤشر) واختيار اثنين من البطينين وعلامات من خلال عقد 'السيطرة'. للوقوف على الوضع Z من معالم، انقر بزر الماوس الأيمن ثم اختر "تعديل Z الوظيفة. تعيين شريحة الأنسجة الأولى ل0 ميكرون.
4. لحفظ إعادة الإعمار، حدد ملف> حفظ ملف بيانات باسم. حفظ بعد كل ملف الاستيراد، لذلك الاسترداد إذا ارتكب خطأ سهلا كما هو الملف السابق التحميل إعادة.
5. لإضافة شريحة الأنسجة القادمة لإعادة الإعمار، انقر فوق ملف> إلحاق العرض. حدد الملف. دات المراد إلحاقها، والتحقق من مربع 'دمج'.
6. اتبع الخطوة 1.4.3 لضبط مرة أخرى موقف Z ملف التتبع المستوردة حديثا. حدد فقط ملامح اليسار واليمين المضافة حديثا في الإطار الرئيسي لتجنب تحريك آثار أخرى. تعيين كل ملف التتبع على التوالي إلى 50 ميكرون من موقع Z من كفاف السابق لمدة 50 ميكرون أقسام. (كفاف الأول: Z = 0، كفاف الثاني: Z = 50، الثالث كفاف: ض = 100، الخ)
7. لضبط X، Y الموقف من ملامح وعلامات محددة، انقر فوق "تمكين الترجمة مع ماوس" الزر واسحب ملامح لتتماشى مع الخطوط العريضة الأنسجة السابقة. تبقي على حد سواء ملامح اليسار واليمين من التتبع الحالية المحددةللسماح للحركة متزامن.
8. لتدوير آثار في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة ليصطف علامات خط الوسط، حدد زر "Z-محور الدوران. على الوجه ملامح عبر المحور Y (إذا كان كفاف اليسار على اليمين) تحديد كل ملامح وعلامات المستوردة، انقر بزر الماوس الأيمن، حدد "تعيين زاوية دوران"، وأدخل '180' الى 'دوران Y'.
9. تأكد من أن البطينين وخط الوسط علامات هي أفضل محاذاة قبل حفظ الملف إعادة الإعمار، كما في الخطوة 1.4.4.
10. كرر الخطوات من 1.4.5 إلى 1.4.9 لكل شريحة الأنسجة اللاحقة حتى جميع تم استيرادها والانحياز بشكل صحيح.
11. لعرض بيانات حجم إعادة إعمار المسلسل، انقر فوق تحليل> 'علامات وتحليل منطقة' وحدد "ملخص 3D كونتور". تحديد كافة معالم في لوحة اليد اليسرى ثم انقر فوق الزر "3D التصور" لعرض إعادة الإعمار 3D النهائي.

2. الإنسان: تحليل حول البطينات الدماغية الخلوية النزاهة و 3D النمذجة للبطين الوحشي

2.1) تحليل البيانات MRI الإنسان

يتم سرد بروتوكولات لخلق صورة 3D اعادة البناء النوعي والكمي الحجمي للالبطينات الجانبية وتقييم التغيرات الحجمية على مر الزمن باستخدام تحليل تراكب الطولي: ملاحظة. من المهم أن نلاحظ أن الاتساق في جمع MR البيانات (على سبيل المثال، وآلة وقوة المغناطيس، سمك الباب، والتوجه والقرار) ومعالجة ما بعد الحيازة هي المعايير المهمة للغاية لإدراج مجموعات البيانات ^20.

1. الإنقسام البطين
   ملاحظة: يتم استخدام ITK / انطباق على قطاع البطينين من عالية الدقة المرجحة T1 الصور MR. بدلا من ذلك، برامج أخرى مجانية مثل Freesurfer يمكن استخدامها.
   1. فتح ITK / عض، ملف> فتح ملف الصور الرمادية. حدد الملف المطلوب ومفتوحة كملف .nii (ملف NITFI).
   2. انتقل من خلال كل عناتطائرة omical، مشيرا إلى تشوهات البطين (المناطق stenosed، قرون زمنية كبيرة أو صغيرة، الخ). في مربع الأدوات الرئيسية انقر فوق "الأفعى أداة ROI". انقر فوق "الجزء 3D. حدد الخيار "كثافة المنطقة".
   3. انقر فوق "Preprocess صورة". اختر 'فوق'، لتشمل مناطق دون عتبة كثافة معينة من أجل تسليط الضوء على ROI باللون الأبيض. تسجيل الحد الأقصى لكثافة استخدام شريط الانزلاق. تعيين العتبة إلى 15٪ من الحد الأقصى لكثافة (سجل هذه القيمة). تعيين المعلمة نعومة إلى 10. انقر على "موافق"، ثم "التالي".
   4. إضافة 10-12 صغير (حجم 2) "فقاعات" في كل البطين: اثنين في القرن الأمامي الجبهي، سبعة متباعدة-بالتساوي على طول السطح العلوي من الجسم البطين الجانبي، واحدة في القرن القذالي واحدة في القرن الصدغي لل البطين الجانبي. "اختيار معلمات" وتعيين قوة الانحناء إلى 0.4. انقر فوق تشغيل رمز لبدء تطور كفاف نشط.
   5. انقر فوق "شبكة تحديث 'لتصور السطح؛ تحقق من "التحديث التلقائي". وقف تجزئة عندما يتم تضمين كافة مناطق البطين الجانبي في المنطقة ذات الاهتمام (ROI). تجنب إدراج البطين الثالث. انقر فوق "إنهاء".
   6. يدويا تحرير الصور إذا لزم الأمر لإزالة المناطق غير المرغوب فيها وفقا للأساليب التالية (عادة تحتاج إلى محو تسرب البطين الثالث). استخدام يدويا "3D المبضع" أداة لإزالة المناطق الزائدة أو يدويا استخدام أداة 'الرسام' مع 'حذف تسمية "كتسمية الرسم نشطة لمحو أي إدراج وراء العائد على الاستثمار.
   7. حفظ نتائج تجزئة كصورة .nii (تنسيق الملف 'NIFTI').
   8. للحصول على الحجم الإجمالي البطين، حدد "الإنقسام> وحدة تخزين" والإحصاء؛ الحصول على الحجم الكلي للالبطين استخدام تعيين التسمية اللون.
2. التمثيل الطولي الوحشي البطينات من MRIScans
   ملاحظة: استخدامبرنامج المانجو، ومضافين رويس طولية لنوعيا وكميا إظهار التغيرات في حجم البطين ضمن المواد مع مرور الوقت.
   1. فتح مانجو. انقر فوق ملف> تحميل ROI من نقطة زمنية ROI الأول (خط الأساس)، والأخضر. ملف> تحميل ROI من نقطة زمنية ROI الثانية كما RED. حفظ تراكب الطولية عن طريق اختيار ملف> حفظ باسم. تعيين كل صورة ب "ملف name_ [أول سن نقطة زمنية] - [سن نقطة مرة الثانية] .nii.
   2. فتح ITK-SNAP. إعادة فتح ROI مجتمعة باسم "صورة للون الرمادي"، من خلال تحديد الإنقسام> تحميل من صورة> ملف ROI مجتمعة. للحصول على حجم البيانات الطولية تشغيل ما يلي: الإنقسام> حجم والإحصاء> تسمية 1 (الحمراء) = حجم التوسع. التسمية 2 (الأخضر) = حجم تضيق. تسمية وحدة التخزين 3 (الأزرق) = قاعدة.

2.2) إعداد المحيطة بالبطين الإنسان الأنسجة وتحليل

1. تعليمات السلامة للعمل مع الأنسجة البشرية
   1. الحصول appropالتدريب في مجال السلامة riate (على سبيل المثال، التي تنتقل عن طريق الدم الكائنات المسببة للمرض طبعا).
   2. مراقبة القياسية (عالمية) احتياطات السلامة. ارتداء القفازات. تغيير القفازات قبل لمس أي معدات مشتركة أو الأسطح التي لا يمكن التخلص منها. تسمية أي من البنود التعامل معها بشكل روتيني عند العمل مع الأنسجة البشرية مع "استخدام الأنسجة البشرية" التسميات.
   3. اتباع ممارسات التطهير لجميع البنود الاتصال الأنسجة البشرية. تبييض جميع السوائل الملوثة مدة لا تقل عن 24 ساعة قبل التخلص منها، وعلاج الأسطح الملوثة مع التبييض منشفة مبللة (على سبيل المثال، أعلى مقاعد البدلاء) أو عن طريق وضع الكائن مباشرة في التبييض (على سبيل المثال ملقط).
   4. إعداد خطة طوارئ للاتصال مع الأنسجة البشرية مباشرة على الجلد، والتي قد تشمل نقع منشفة ورقية في التبييض وعقد على المنطقة المصابة (5-10 دقيقة).
   5. استخدام التخلص من النفايات المناسب لجميع البنود القادمة في اتصال مع الأنسجة البشرية.
2. الوحشي البطين الجامع جبل التحضير
   1. Beginning مع أحد نصفي الكرة الأرضية سليمة (ثابت في 10٪ من الفورمالين وتشطف جيدا بنسبة 0.1 M PBS)، شريحة 1.5 سم أقسام الاكليلية سميكة من خلال نصف الكرة الأرضية بأكملها باستخدام سكين كبير.
      ملاحظة: جميع بروتوكولات تثبيت تتطلب التحقق الأجسام المضادة مسبق.
   2. أقسام تسمية الأمام إلى الخلف بدءا من القسم الأول الذي يحتوي على البطين الجانبي. استخدام نظام وضع العلامات الرقمية ألفا، واصفة شرائح مع الحروف (الأمامي إلى الخلفي) والقسم الفرعي مع الأرقام (أعلى إلى أسفل). تجنب تعطيل سطح بطانية عصبية.
   3. باستخدام مشرط المجهرية، تشريح جدار البطين 1 سم العميق، والحفاظ على مقطع واحد المستمر للجدار الجانبي بأكمله. تقسيم الجدار حسب الحاجة لإنشاء أقسام بحجم مناسب لتلطيخ جيدا. القسم درجة على الجانب الآخر من جدار البطين لتحديد المتفوق / التوجيه أدنى.
   4. أداء استرجاع مستضد التي يحتضنها أقسام الأنسجة في 10 ملي سيترات الصوديوم العازلة (درجة الحموضة 6.0) عند 100 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة باستخدام المراجل مزدوجص (يتم تحديد الوقت الأمثل حضانة تجريبيا). شطف 3 مرات في برنامج تلفزيوني / 0.1٪ تريتون X-100 (PBS-TX).
   5. كتلة في 10٪ مصل الحصان باستخدام PBS / PBS-TX لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   6. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 48 ساعة في 4 درجات مئوية. لتصور البطين جدار بطانة، immunostain يتصاعد كاملة مع تركيبات الأجسام المضادة التالية: الماوس المضادة للβ-catenin (1: 250)؛ الماعز مكافحة GFAP (1: 250)؛ أرنب مكافحة AQP4 (1: 400).
   7. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام. شطف الأنسجة 3 مرات في برنامج تلفزيوني، واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (1: 500) لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية أو 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وشطف 3 مرات أخرى في برنامج تلفزيوني. احتضان الأنسجة في دابي لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة يتبع مع 3 يشطف آخر في برنامج تلفزيوني.
   8. إعداد الأنسجة لتشريح النهائي من خلال تغطية صحن القاع الشمع مع parafilm. ملء الطبق مع PBS، ضع الأنسجة في طبق باستخدام ملقط غرامة، وتجنب إجراء اتصالات مع جدار بطانية عصبية.
   9. تحت المجهر تشريح، SECU بحزمإعادة الأنسجة على أحر الجانب التي تستخدم فيها. مع 22.5 ° طعنة سكين المجهرية، إنشاء أقسام رقيقة موحدة (حوالي 300 ميكرون سميكة) من جدار البطين الجانبي. لقطاعات كبيرة أو المقاطع مع انحناء الصعب، مقطعة إلى مكعبات صغيرة قبل تقطيعها الى أقسام النهائية لتركيب ومذكرة الموقع.
   10. وضع بعناية الباب تشريح الجانب ependyma حتى على الشريحة باستخدام ملقط غرامة، مع الأخذ علما الموقع الإقليمي والتوجه على الشريحة. تغطية الأنسجة مع طبقة رقيقة من aquapolymount، مع الحرص على تجنب الفقاعات. وضع ساترة على الأنسجة، إضافة aquapolymount إضافية عند الضرورة لسد أي ثغرات تحت ساترة.
   11. وضع المقاطع التي شنت في الظلام وجاف لمدة 2-3 أيام في درجة حرارة الغرفة. متجر في slidebox في 4 درجات مئوية.
3. المناعية وتحليل النسيجي
   1. باستخدام متحد البؤر المجهري لعرض المناعية الفلورسنت، وضبط البؤري التصوير على سطح البطين، على النحو الذي تحدده استخدام سو β-catenin (علامة للحصول على الملتصقة قمي البروتينات تقاطع خلايا البطانة العصبية). ترسيم مناطق التغطية خلية البطانة العصبية ودباق النجمي السطحية (GFAP تلطيخ على سطح البطين).
   2. لتوثيق والمونتاج سطح البطين كامل، استخدم الصور المتداخلة لتغطية كامل سطح. لخلق المونتاج للصور المسلسل، وفتح أدوبي فوتوشوب. استخدام ملف> آلي> تخطيط الدمج الصوري> تفاعلي لتحديد الصور لتراكب، إجراء تعديلات اليدوية إذا لزم الأمر.
   3. خلق طبقة جديدة لتتبع المونتاج لتوليد كارتون تمثيل تغطية خلية ependyma سليمة أو دباق سطح البطين. كرر لكل شريحة أو العائد على الاستثمار. تجميع كل الأجزاء لإعادة بناء خريطة جدار البطين وتصل إلى المنطقة المقابلة على إعادة الإعمار MRI.

النتائج

تتبع كفاف من البطينات الجانبية الماوس على أساس immunostained 50 ميكرون أقسام الاكليلية واعادة البناء 3D (الشكل 3) يسمح حجم البيانات التي سيتم جمعها في النماذج التجريبية المختلفة باستخدام الماوس كنظام نموذج لمرض أو إصابة. حاسمة لهذا الإجراء هو استبعاد المناطق التي ت?...

Discussion

نقدم الأدوات والبروتوكولات التي يمكن استخدامها لتقييم سلامة النظام البطين من الدماغ لدى الفئران والبشر. هذه الأدوات، ومع ذلك، يمكن أن تطبق أيضا على هياكل أخرى من الدماغ أو أجهزة الجسم التي تخضع لتغيرات بسبب الإصابة، والمرض، أو أثناء عملية الشيخوخة ^14،21،22. قدمت...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	21600-069
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	19210	Use at 4% in PBS, 4 °C
Normal Horse Serum	Life Technologies	16050	10% in PBS-TX (v/v)
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210	10% in PBS-TX (v/v)
Triton X-100 (TX)	Sigma-Aldrich	T8787	0.1% in PBS (v/v)
Vibratome	Leica	VT1000S
Fluorescence Microscope	Zeiss	Imager.M2
Camera	Hamamatsu	ORCA R2
Microscope Stage Controller	Ludl Electronic Products	MAC 6000
Stereology software	MBF Bioscience	Stereo Investigator 11
Stereology software	ImageJ/NIH	NIH freeware
3D Reconstruction software	MBF Bioscience	Neurolucida Explorer
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2
MRI Software
Freesurfer	https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall	Segmentation and Volume
ITK-Snap	http://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php		Segmentation and Volume
Multi-image Analysis GUI (Mango)	http://ric.uthscsa.edu/mango/		Longitudinal overlay
Whole Mount Equipment
22.5° microsurgical straight stab knife	Fisher Scientific	NC9854830
parafilm
wax bottom dissecting dish
pins
fine forceps
aquapolymount
Dissecting Microscope	Leica	MZ95
Whole Mount Antibodies
mouse anti-b-catenin	BD Bioschiences, San Jose, CA, USA		1:250
goat anti-GFAP	Santa Cruz Biotechnology		1:250
rabbit anti-AQP4 (aquaporin-4)	Sigma-Aldrich		1:400
Coronal Antibodies
Anti-S100β antibody	Sigma-Aldrich		1:500
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D-1306	10 µg/ml in PBS