JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويتجلى في عزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية أو المنطقة الجوفية السقيفية مع المناعية مباشرة أو غير مباشرة باستخدام ملقط ليزر. وتناقش المعلمات لعزل الأنسجة من شريحة زجاجية باستخدام الليزر تحت الحمراء والشرائح من الغشاء باستخدام مزيج من ليزر الأشعة تحت الحمراء وفوق البنفسجية.

Abstract

ويستخدم ملقط ليزر (LCM) لعزل السكان مركزة من الخلايا الفردية أو المناطق التشريحية الدقيقة للأنسجة من أقسام الأنسجة على شريحة المجهر. عندما يقترن المناعية، LCM يمكن استخدامها لعزل أنواع الخلايا الفردية على أساس البروتين علامة معينة. هنا، يتم وصف هذه التقنية LCM لجمع مجموعة سكانية محددة من الخلايا العصبية الدوبامين وصفت مباشرة مع التيروزين هيدروكسيلاز المناعية ولعزل الخلايا العصبية الدوبامين التي تحتوي على منطقة للمنطقة الجوفية السقيفية باستخدام غير المباشرة المناعية التيروزين هيدروكسيلاز على القسم المجاور لتلك المستخدمة لLCM. يتم استخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) القبض على الليزر لكلا تشريح الخلايا العصبية الفردية وكذلك منطقة السقيفية البطنية من الشرائح الزجاجية وعلى غطاء LCM للتحليل. الجفاف الكامل للالأنسجة مع 100٪ من الإيثانول والزيلين أمر بالغ الأهمية. مزيج من التقاط الأشعة تحت الحمراء الليزر والأشعة فوق البنفسجية (UV) cuttiيستخدم الليزر نانوغرام لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية أو المنطقة السقيفية البطنية عند استخدام PEN الشرائح الغشاء. شريحة الغشاء PEN ديها مزايا هامة على شريحة زجاجية، حيث أنها توفر أفضل الاتساق في التقاط وجمع الخلايا، وأسرع جمع قطع كبيرة من الأنسجة، هي أقل اعتمادا على الجفاف والنتائج في إزالة كاملة من الأنسجة من الشريحة. وعلى الرغم من إزالة مساحات واسعة من الأنسجة من شريحة زجاجية مجدية، فمن حد كبير أكثر استهلاكا للوقت، وكثيرا ما يترك بعض الأنسجة المتبقية خلف. وتظهر البيانات المعروضة هنا التي RNA من كمية ونوعية كافية يمكن الحصول عليها باستخدام هذه الإجراءات لقياسات PCR الكمي. على الرغم من أن RNA والحمض النووي هي جزيئات معزولة الأكثر شيوعا من الأنسجة والخلايا التي تم جمعها مع LCM والعزلة وقياس الرنا الميكروي، والبروتين والتغيرات جينية في الحمض النووي يمكن أن تستفيد أيضا من تعزيز قرار التشريحية والخلوية التي تم الحصول عليها باستخدام LCM.

Introduction

وتتكون جميع الأنسجة من السكان متخالف من الخلايا. وينطبق ذلك بشكل خاص لأنسجة المخ، ويتألف من مختلف الخلايا العصبية متميزة شكليا و / أو neurochemically تحيط بها أنواع مختلفة من الخلايا الدبقية (قليلة التغصن، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية). بالإضافة إلى ذلك، مناطق مختلفة في الدماغ، مثل المناطق من القشرة أو جذع الدماغ نوى، لها وظائف محددة. ولذلك، فإن القدرة على عزل مجموعات سكانية محددة من الخلايا أو مناطق صغيرة جدا مميزة تشريحيا، وعندما يقترن التقنيات التحليلية (أي Q-PCR، ميكروأرس، RNA-التسلسل، والبروتينات)، يمكن أن تعزز بشكل ملحوظ فهم العمليات البيولوجية المختلفة. LCM هي التكنولوجيا التي توفر القدرة على عزل المناطق التشريحية المنفصلة جدا أو خلايا معينة من الأنسجة على شريحة المجهر توفير مصدر أكثر تجانسا من ذلك بكثير لمزيد من التحليل لمختلف الجزيئات، مثل RNA، الرنا الميكروي، DNA والبروتينات.

ر "> ومنذ إطلاق LCM أولا، وقد استخدمت عدة أساليب مختلفة لmicrodissect الخلايا من الأنسجة 1-3. وتضمنت أقرب النهج مرفق المباشر من الأنسجة على شريحة باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) ليزر وفيلم بالحرارة وعدم طريقة الاتصال باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) قطع الليزر لفصل الخلايا او الانسجة وجمع في أنبوب. وفي وقت لاحق، وقد استخدم LCM بنجاح على مجموعة متنوعة من الأنسجة وأنواع الخلايا، وأظهرت لتكون متوافقة مع العزلة من مختلف الجزيئات لتحليل المصب بما في ذلك RNA، الرنا الميكروي، DNA، والبروتينات، بما في ذلك النشاط الأنزيمي 1،4-7. LCM هنا يتجلى باستخدام نظام LCM الذي يستخدم ليزر قطع الأشعة فوق البنفسجية والأشعة تحت الحمراء ليزر القبض على لقطع حول الخلايا أو الأنسجة وإرفاقها إلى غطاء LCM، على التوالي. ويستخدم هذا النظام LCM كل من التقاط الأشعة تحت الحمراء الليزر لإذابة فيلم من البلاستيك على غطاء فوق الخلية أو الأنسجة من الاهتمام التي يوليها الخلايا إلى فيلم من البلاستيك ويزيل من رانه الأنسجة مع إزالة الغطاء (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، في تركيبة مع ليزر الأشعة تحت الحمراء، ليزر الأشعة فوق البنفسجية متاح للخفض التدريجي الأنسجة أو الخلايا من الاهتمام من الأنسجة التي شنت على الشرائح مع غشاء ثم عزل عن طريق ربط الأنسجة إلى الحد الأقصى LCM باستخدام الليزر IR (الشكل 2). تم العثور على لمحة موجزة عن هذه التقنيات في أرقام 1 و 2.

ووصف العديد من الاختلافات على هذه التقنية إما عزل خلايا محددة باستخدام المناعية الفلورسنت المباشرة وتقنية موجهة المناعية غير المباشرة التي يتم استخدامها لعزل منطقة من الأنسجة على أساس التعبير عن بروتين معين. على وجه التحديد، وتظهر عزل الخلايا العصبية الدوبامين من المادة السوداء وعزل منطقة السقيفية البطنية والعزلة لاحقة من الحمض النووي الريبي من الطازجة والمجمدة أنسجة المخ. كما RNA هو الأكثر عطوب من الجزيئات قياس (بالمقارنة مع الحمض النووي أو البروتين)، الحادي والعشرينوشملت العائد على السهم للمساعدة في الحفاظ على سلامة RNA وبيانات أظهرت على كمية ونوعية RNA التي تم الحصول عليها.

Protocol

ملاحظة: تم استخدام أنسجة المخ من الفئران وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، وتمت الموافقة على بروتوكولات الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ميسيسيبي الدولة.

1. إعداد الشرائح والأنسجة

  1. استخدام أي شرائح سيلاني الإعدادية أو البولي ايثيلين napthalate (PEN) الشرائح الزجاجية الغشاء.
  2. لعزل الحمض النووي الريبي، والشرائح تراجع في ريبونوكلياز الحل إزالة التلوث، ويغسل 3 مرات مع ريبونوكلياز خالية من المياه ثم يذوى مع سلسلة متدرجة من ريبونوكلياز خالية من الإيثانول وفراغ الجافة لمدة 30 دقيقة.
  3. قطع أقسام الأنسجة في 10 ميكرون سمك باستخدام ناظم البرد وجبل على استعداد ريبونوكلياز الشرائح الحرة. الحفاظ على أقسام المجمدة خلال باجتزاء للحفاظ على جودة RNA.
    ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة حوالي 4 مم بعيدا عن حواف الشريحة باسم LCM لا يمكن إزالة الأنسجة التي هي قريبة جدا من حواف الشريحة. في أورديr لإزالة الأنسجة من شريحة الغشاء PEN، تأكد من أن الأنسجة هي 4 ملم من الناحية اليسرى في أعلى وأسفل و7 ملم من الجانب الأيمن من الشريحة التي هي أبعاد الغشاء الذي لا تعلق على الشريحة.
  4. لعزل السكان الخلية الفردية باستخدام المناعية المباشرة، قسم الأنسجة على أي من الشرائح-سيلاني الإعدادية أو PEN الشرائح الغشاء. لعزل مناطق الأنسجة باستخدام تقنيات الموجهة المناعية غير المباشرة، جبل مجموعة واحدة من الفروع على شريحة سيلاني الإعدادية لالمناعية وأقسام بديلة على أي شريحة الغشاء PEN و / أو شريحة سيلاني الإعدادية لاستخدامها في LCM.

2. إعداد الأنسجة لالتقاط بالليزر - السريع هيدروكسيلاز التيروزين المناعية لالتقاط الليزر المباشر للخلايا مناعيا

  1. الخطوط العريضة الأنسجة بالقلم مسعور والسماح ليجف.
  2. إصلاح الأنسجة في الأسيتون-الميثانول (1: 1) حل في -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: أويحييوقد أظهرت التجربة ص أن التثبيت الأسيتون-الميثانول أسفرت المناعية أكثر اتساقا بكثير من الأسيتون أو الميثانول وحدها.
  3. الشريحة شطف في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 1٪ تريتون (ريبونوكلياز مجانا).
  4. أقسام غطاء مع 100-200 ميكرولتر PBS مع 1٪ تريتون مع التيروزين هيدروكسيلاز الأجسام المضادة المخفف 1: 100 مع 400 U / RNasin مل. احتضان لمدة 5-10 دقيقة.
  5. شطف لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني مرتين وPBS-1٪ تريتون.
  6. تغطية الأنسجة مع 100-200 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب مفتش المسمى مع اليكسا فلور 488 المخفف 1: 100 في برنامج تلفزيوني-1٪ تريتون مع 400 U / مل RNasin و 50 نانوغرام / مل دابي. احتضان لمدة 5 دقائق.
  7. شطف 2 مرات في برنامج تلفزيوني ثم يذوى 30 ثانية في سلسلة متدرجة من الإيثانول ريبونوكلياز الحرة (75٪ -75٪ -95٪ -95٪ -100٪ -100٪).
  8. احتضان في اثنين من يغسل من الزيلين لمدة 1 دقيقة ثم 5 دقائق.
  9. إزالة الشرائح من الزيلين مباشرة قبل استخدامها لLCM والسماح للهواء الجاف.

3. إعداد الأنسجة لالتقاط الليزر - التيروسينهيدروكسيلاز المناعية لالتقاط الليزر غير المباشر من المناطق مناعيا

  1. عملية شريحة واحدة مع أقسام المتاخمة للأقسام التي شنت على سيلاني الإعدادية و / أو PEN الشرائح الغشاء لالمناعية.
    ملاحظة: إجراءات المستخدمة هنا هي مماثلة لتلك التي ذكرت سابقا 5. للصور المظاهرة، تم استخدام diaminobenzidine (DAB) رد فعل chromagen لتصور الخلايا العصبية التيروزين هيدروكسيلاز من الفائدة.
  2. لالشرائح المستخدمة للLCM، وتحديد لمدة 5 دقائق في 100٪ الأسيتون في 4 درجات مئوية.
  3. يذوى الأنسجة في سلسلة متدرجة من الإيثانول ريبونوكلياز مجاني (75٪ -75٪ -95٪ -95٪ -100٪ -100٪) لمدة 1 دقيقة لكل منهما.
  4. احتضان في اثنين من يغسل من الزيلين لمدة 1 دقيقة ثم 5 دقائق.
  5. إزالة الشرائح من الزيلين مباشرة قبل استخدامها لLCM والسماح للهواء الجاف.

4. باستخدام نظام ليزر تسليخ مجهري لقطة

ملاحظة: البرنامج تطبيق LCM ديه الحانات أداة 10 و 2 نوافذ للسيطرة علىالإجراء تسليخ مجهري. أشرطة الأدوات: 1. المجهر، 2. الليزر التقاط، 3. الليزر قطع، 4. دراسة، 5. ملاحة، 6. المواد، 7. المجموعات التقاط، 8. تسليخ مجهري، 9. الخط، 10. الشرح. نوافذ: 1. لايف فيديو و2. خارطة الطريق.

  1. فتح الباب عن طريق اختيار "افتح الباب" علامة التبويب في شريط الأدوات المواد في برامج النظام LCM.
  2. الشرائح الحمل على ثلاثة فتحات المتاحة. لهذه التظاهرة، تحميل شريحة واحدة مع التيروزين هيدروكسيلاز المناعية تصور مع DAB، شريحة واحدة-سيلاني الإعدادية واحد PEN غشاء الشريحة كل المسمى لالسريعة التيروزين الفلورسنت المناعية هيدروكسيلاز. في تجربة نموذجية، استخدم إما الأسيتون الخالي من الملصقات الأبواب الثابتة مع شريحة إشارة المسمى لهيدروكسيلاز التيروزين باستخدام DAB أو الشرائح المسمى مباشرة مع الفلورسنت هيدروكسيلاز التيروزين لالتقاط الليزر.
  3. تحميل القبعات LCM في فتحة المتاحة.
    ملاحظة: يتم قبعات ماكرو وHS LCM متاحة للاستخدام. نوع الغطاء LCM لاستخدام ديpends على عدد من الخلايا أو كمية الأنسجة التي يتعين جمعها. وترد الشرائح الكلية لجمع ما يصل إلى عدة آلاف من الخلايا في حين القبعات HS يمكن جمع عدة مئات. الشرائح ماكرو تسمح لمزيد من جمع الأنسجة ولكنها تحتاج إلى 50 ميكرولتر من تحلل العازلة. غطاء HS، عندما تستخدم مع المحولات، يتطلب فقط 10 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تسمح للانتعاش نسبي أكبر من الحمض النووي الريبي.
  4. أغلق الباب.
  5. تحميل الشريحة لتفعيل خارطة الطريق النافذة التي تنص على وجهة نظر العمل من الشريحة بأكملها، وهذا يسمح للاختيار من المنطقة ذات الاهتمام (الشكل 3). عرض خارطة الطريق على نافذة الفيديو لايف للانتقال إلى مجال الاهتمام.
  6. في شريط الأدوات المواد، وتحديد الشرائح غشاء PEN عن طريق التحقق من المربع أعلاه فتحة الشريحة. لتوفير خصائص كأب، وانقر على الحق في مباراة دولية في شريط الأدوات المواد واختر "خصائص العرض كاب". حدد المربعات مما يدل على موقف والقبعات وحدد إما ماCRO أو HS مباراة دولية.
  7. حدد "الإسفار" علامة التبويب في شريط الأدوات المجهر لتشغيل مصباح الفلورسنت والسماح للمصباح الفلورسنت في عملية الاحماء. استخدام الفلاتر الأزرق والأشعة فوق البنفسجية لتصور أليكس فلور 488 و دابي، على التوالي. استخدام "ضبط الكاميرا" علامة التبويب لزيادة حساسية الصورة من أجل أن نرى الخلايا fluorescently المسمى.
  8. في شريط الأدوات المواد، انقر على الحق في قبعة ونقله إلى الشريحة من الفائدة. انقر مرتين على موقع في خارطة الطريق لتحديد المنطقة التي تظهر في إطار لايف فيديو. تحرك الغطاء حول على الشريحة عن طريق تحديد منطقة على خارطة الطريق (فوق اليسار مزدوج) ثم النقر على الحق واختيار "قبعة مكان في منطقة مركزية".
  9. قبل استخدام الأشعة تحت الحمراء القبض على الليزر، والهدف وتعديله للقوة. وضع الغطاء في المنطقة من الشريحة بعيدا عن الأنسجة. على شريط الأدوات القبض على الليزر، حدد "تمكين". ضبط الطاقة (3-100 ميغاواط)، نبض (100-1000000 μ، ثانية) و# الفعالية من الليزر. اطلاق النار ليزر الأشعة تحت الحمراء عند الحد الأقصى هو أكثر جزء من الشريحة دون الأنسجة وتحقق لمعرفة ما إذا كان ليزر يذوب بما فيه الكفاية غشاء سقف LCM.
    ملاحظة: هذا ما يسمى التبول الذي يذوب غشاء البوليمر على الغطاء بحيث إنها تجري اتصالات مع شريحة زجاجية. ترطيب كاف مرئيا باعتباره حلقة مظلمة تنصهر إلى الشريحة مع وسط الحلبة واضحة (انظر الشكل 4 للحصول على أمثلة من ذوبان كافية وغير كاف). إذا ترطيب غير كاف، وضبط السلطة والنبض، واختبار النار مرة أخرى حتى يتم تحقيق ذلك. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تستخدم أيضا حرائق متعددة من الليزر.
  10. عندما يتم ضبط كثافة الليزر تحت الحمراء، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "التقاط الليزر هو هنا" لنهدف ليزر.
    ملاحظة: هذه الخطوة يحكي الكمبيوتر حيث يهدف التقاط الأشعة تحت الحمراء الليزر على الأنسجة. هذه الخطوة تهدف من الليزر أمر بالغ الأهمية وتحتاج إلى أن تتكرر في كل مرة يتم نقل الغطاء أو يتم تغيير الهدف.

    11. 5. الليزر التقاط تسليخ مجهري للفرد الدوبامين العصبية الخروج من الشرائح-سيلاني الإعدادية

    1. الانتقال إلى المنطقة من اهتمام لالتقاط الخلايا.
      ملاحظة: المثال عزل الخلايا العصبية الدوبامين ويرد هنا.
    2. لالتقاط الخلايا الفردية الخروج من الانزلاق سيلاني الإعدادية، حدد "LCM" علامة التبويب ثم رمز "نقطة واحدة" في شريط الأدوات تسليخ مجهري.
    3. في شريط الأدوات المجهر، واستخدام "مصراع" علامة التبويب للتبديل بين مضان والميدان مشرق مع علامات التبويب مرشحات الفلورسنت لاختيار المرشحات المناسبة واستخدام علامات التبويب الأهداف لتغيير التكبير. وبمجرد أن خلايا الفائدة واضحة في نافذة الفيديو لايف، وضبط حجم البقعة الذي يستخدم في تحديد الخلايا التي تهم الحجم التقريبي للخلايا. القيام بذلك عن طريق النقر فوق علامة التبويب بقعة على شريط الأدوات التقاط الليزر ثم النقر على جانب واحد من خلية الملون، تليها النقر على الجانب المقابل.
      ملاحظة: هذا يحسبقطر الفور ويعرض قيمة.
    4. بمناسبة خلايا الفائدة من خلال النقر عليها في حين يتم اختيار رمز "نقطة واحدة". هل هذا لوضع علامة بقعة على كل خلية. هنا، يتم استخدام فلتر الأزرق والهدف 10X لتصور الخلايا العصبية الدوبامين. إعادة اختبار ونهدف ليزر الأشعة تحت الحمراء على الغطاء حيث لا يوجد الأنسجة تحته كما هو موضح في الخطوات 4.9 و 4.10.
    5. مرة واحدة يتم وضع علامة على الخلايا، حدد "الذهاب - قطع والقبض على" علامة على شريط الأدوات تسليخ مجهري والليزر IR سوف النار الخلايا في تميز كل مختارة تلقائيا. بالإضافة إلى ذلك، إذا لزم الأمر، اطلاق النار ليزر الأشعة تحت الحمراء يدويا في أي نقطة من مصلحة (الشكل 5D).
    6. تحرك الغطاء بعيدا عن الباب، وعلى منطقة مفتوحة من الشريحة للتحقق مما إذا تم القبض على الخلايا على الحد الأقصى للLCM. ضمان أن تتم إزالة الخلايا من الاهتمام من الشريحة (الشكل 5B، E) وتعلق على غطاء LCM (الشكل 5C، F). عشر وثيقةهو عملية من خلال النقر على "التقاط صورة" علامة التبويب في المجهر شريط الأدوات.
    7. عند الانتهاء من جمع الأنسجة، وإزالة الغطاء عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الغطاء وحدد "الانتقال إلى" ثم "إلغاء تحميل".

    6. التقاط بالليزر الفردية الدوبامين العصبية الخروج من PEN غشاء الشرائح

    1. لالتقاط الخلايا الفردية الخروج من PEN الشرائح الغشاء باستخدام كل من الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية وأشعة الليزر، حدد "قص والقبض على" علامة التبويب في شريط الأدوات تسليخ مجهري. حدد "نقطة واحدة" علامة التبويب بمناسبة خلايا الفائدة. استخدام "قص خط" علامة تبويب لتحديد كل خلية. يجب التأكد من اختبار ليزر الأشعة تحت الحمراء كما هو موضح في الخطوة 4.9 و 4.10 واختبار ليزر الأشعة فوق البنفسجية لتحديد الحد الأدنى للكثافة اللازمة لخفض يعتقد أن PEN الغشاء والأنسجة (الشكل 4 و 5)
    2. حدد "التقاط وقص" علامة على شريط الأدوات تسليخ مجهري. عند جمع الخلايا الفردية باستخدام هذه التقنية، تكونتأكد لاطلاق النار ليزر الأشعة تحت الحمراء الأولى تليها ليزر الأشعة فوق البنفسجية لأن هذه القطع الصغيرة يمكن أن تضيع إذا ما قطعت من قبل أن يتم اضافته إلى الحد الأقصى LCM.
      ملاحظة: يمكن أيضا أن تتم هذه العملية يدويا عن طريق اطلاق النار ليزر الأشعة تحت الحمراء عند نقطة المصالح والخلايا المحددة بشكل فردي مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية.
    3. بعد جمع الخلايا من الفائدة، وتحريك سقف LCM كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.7 لتحديد ما إذا تم إزالة الخلايا وتعلق على غطاء (الشكل 6).
    4. عند الانتهاء من جمع الأنسجة، وإزالة الغطاء عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الغطاء واختيار "نقل إلى" ثم "إلغاء تحميل".

    7. الاستيلاء على السقيفية منطقة بطني من الشرائح سيلاني الإعدادية

    1. لتحديد المنطقة ذات الاهتمام، استخدم الشريحة معالجتها لالمناعية.
      ملاحظة: لهذه التظاهرة معزول المنطقة الجوفية السقيفية (الشكل 7A).
    2. تحميل قبعة LCM واختبار أجهزة الليزر كما في الخطوةليالي 4.9 و 4.10.
      ملاحظة: عادة، يتم استخدام قبعة LCM ماكرو ولكن يمكن أيضا أن تستخدم غطاء HS (انظر الشكل 8).
    3. لعزل المنطقة من الأنسجة (أي منطقة السقيفية البطنية) من الشريحة-سيلاني الإعدادية، حدد "LCM" علامة التبويب في شريط الأدوات تسليخ مجهري، ثم حدد "مضلع الخارج" علامة التبويب. مخطط المنطقة من الاهتمام في نافذة لايف فيديو. تبعا لحجم المنطقة لجمع، الخطوط العريضة لمنطقة الفائدة عند التكبير المنخفض (2X الهدف). لجمع، ومع ذلك، يستخدم أداة الهدف 10X ذلك ضبط وتهدف ليزر الأشعة تحت الحمراء في إطار الهدف 10X قبل اسر.
    4. حدد "الذهاب - التقاط وقطع" علامة التبويب في شريط الأدوات تسليخ مجهري.
      ملاحظة: سيقوم الكمبيوتر تلقائيا النار ليزر الأشعة تحت الحمراء في جميع أنحاء المنطقة بأكملها المحدد (الشكل 7F، I). إذا لم يتم ذاب غشاء LCM بما فيه الكفاية في جميع أنحاء المنطقة، يمكن أن تطلق الليزر الرجلكررت هو مثير جنسيا أو العملية برمتها.
    5. تحريك سقف LCM الخروج من الأنسجة لتحديد مدى تم جمع الأنسجة.
      ملاحظة: مرور واحد باستخدام هذا الأسلوب يترك عادة بعض الأنسجة وراء على الشريحة (انظر Figure7G). إذا حدث هذا، كرر اختيار والتقاط الخطوة أعلاه. ويمكن تكرار هذه الخطوة زيادة كمية الأنسجة التي تم جمعها (الشكل 7J).
    6. عند الانتهاء من جمع الأنسجة، وتفريغ الغطاء عن طريق النقر على الحق في الغطاء واختيار "نقل إلى" ثم "إلغاء تحميل".

    8. الاستيلاء على السقيفية منطقة بطني من PEN غشاء الشرائح

    1. استخدام الشريحة معالجتها لالمناعية كدليل لتحديد المنطقة ذات الاهتمام من الأنسجة على الشريحة غشاء PEN على النحو الوارد أعلاه.
    2. حدد "قص والقبض على" علامة التبويب في شريط الأدوات تسليخ مجهري. حدد "قص لاين" علامة التبويب وتحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام immunohistocheاللغز المسمى الشريحة كدليل.
      ملاحظة: سيقوم البرنامج إضافة البقع تلقائيا ليزر الأشعة تحت الحمراء إرفاق الأنسجة إلى الحد الأقصى. استخدام "نقطة واحدة" علامة التبويب لإضافة نقاط إضافية لتأمين أفضل الأنسجة إلى الحد الأقصى.
    3. تحت 10X الهدف، النار الاختبار وتهدف الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية الليزر كما هو موضح في 4.9 و 4.10. اختبار أن الليزر فوق البنفسجية يمكن ان تخترق الغشاء على الشريحة وأن هذا الخفض يتوافق مع الموقع على شاشة الكمبيوتر. استخدام القوة ليزر الأشعة فوق البنفسجية التي هي مجرد كافية لقطع الغشاء والأنسجة ولكن لا ضرر في الأنسجة (الشكل 5).
    4. حدد "الذهاب - التقاط وقطع" علامة التبويب في شريط الأدوات تسليخ مجهري.
      ملاحظة: سيقوم الكمبيوتر تلقائيا النار ليزر الأشعة تحت الحمراء في كل البقع وصفت داخل الأنسجة لنعلق عليه إلى الحد الأقصى ثم اطلاق النار ليزر الأشعة فوق البنفسجية لخفض الشريحة PEN الغشاء والأنسجة (الشكل 7C). قد تكون البقع إضافية المذابة الأشعة تحت الحمراء الضروري أن نعلق على نحو كاف تيسمقاضاة إلى الحد الأقصى LCM، والتي يمكن أيضا أن تضاف يدويا.
    5. تحريك سقف LCM الخروج من الأنسجة لتحديد ما إذا تم إزالة الأنسجة من القسم (الشكل 7C) وتعلق على غطاء (الشكل 7C).
    6. عند الانتهاء من جمع الأنسجة، لإزالة الغطاء، انقر بزر الماوس الأيمن على الغطاء وحدد "الانتقال إلى" ثم "إلغاء تحميل".

    9. عزل RNA

    1. لجمع الحمض النووي الريبي من الخلايا أو الأنسجة القبض، واحتضان الغشاء سقف LCM في RNA العازلة تحلل لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
      ملاحظة: للحصول على القبعات HS، محول متاح التي تسمح لاستخدام فقط 10 ميكرولتر من تحلل العازلة على الغطاء ويعلقها على أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج. القبعات ماكرو تتطلب 50 ميكرولتر من العازلة تحلل وتعلق مباشرة إلى أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج.
    2. بعد مرور فترة الحضانة، وتدور في تحلل العازلة إلى أسفل داخل أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج.
    3. لضمان تحلل كامل لجميع الخلايا سص الأنسجة، وتقشر غشاء سقف LCM للغطاء ووضعه في المخزن المؤقت تحلل.
    4. لاختبار سلامة الحمض النووي الريبي، واستخدام RNA عزل من الأنسجة المتبقية على الشريحة بعد LCM لقياس سلامة الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: نظرا لRNA عينة محدود تم الحصول عليها مع LCM، فمن عادة غير عملي لاختبار سلامة الحمض النووي الريبي RNA على LCM معزولة، ومع ذلك، RNA من الأنسجة المتبقية يوفر مؤشرا جيدا من أي تدهور RNA بسبب التثبيت، والمناعية والوقت خلال الإجراء LCM.

النتائج

صورة مجهرية في أرقام 6 و 7 تظهر قدرات لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية. القرار التشريحية الحالي هو حوالي 5-10 ميكرون كما أصغر حجم البقعة التي يمكن أن تنتج باستمرار على LCM قبعات لعزل خلية. والقيد الوحيد لعزل أنواع معينة من الخلايا هو القدرة على تصور الخلايا. على الرغم من أن LCM قادر على عزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية، وعلى الأرجح حدوث تلوث أجزاء من خلايا غير المسماة المجاورة. ولذلك، فإن العينة النهائية هي عبارة عن مجموعة مركزة من الخلايا العصبية الدوبامين، وليس السكان نقية من الخلايا العصبية الدوبامين. هذه التكنولوجيا هي أيضا قادرة على عزل مناطق صغيرة من الأنسجة مثل نواة منفصلة أو المناطق داخل المخ كما هو موضح مع عزل منطقة السقيفية البطنية. وقد أظهرت المنشورات السابقة هذا الاستخدام في أنسجة المخ وكذلك لعزل الأنسجة المرضية من الأنسجة الطبيعية 5،11.

الطبقة = "jove_content"> لأن الاستخدام الأكثر شيوعا من خلايا والأنسجة المعزولة باستخدام LCM هو تحليل RNA، تم تحسين إجراءات تقديمها للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. من أجل تحديد نوعية RNA التي بقيت بعد LCM، كان RNA معزولة، وذلك باستخدام الأعمدة تدور السيليكا القائم، من الأنسجة على الشرائح التالية LCM، إما بعد هيدروكسيلاز الإجراء المناعية فلوري التيروزين السريع أو التثبيت في الأسيتون. تم قياس جودة RNA ومقارنة القيم لRNA من المتاحة تجاريا RNA الدماغ كله (الشكل 9). تم تخفيض نوعية RNA في عينات الحمض النووي الريبي من الأنسجة المستخدمة لLCM بنزاهة أقل بعد المناعية (RIN غير متوفر) تليها الأسيتون تثبيت (RIN 2.6) بالمقارنة مع RNA الدماغ كله (RIN 8.2) كما يمكن أن يرى من خلال انخفاض نسبي في ذروة الذروة الريباسي S28 مقارنة مع ذروة S18. ومع ذلك، حافظ RNA 18S 28S والعصابات ويمكن قياس التعبير الجيني باستخدام Q-PCR.

= "jove_content"> لقياس كمية الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من الخلايا العصبية المكتسبة عبر LCM، الخلايا العصبية الدوبامين (50 و 100 و 200 الخلايا العصبية الدوبامين) تم عزل من منطقة السقيفية البطنية الخروج من الشرائح سيلاني-الإعدادية. تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام الأعمدة تدور السيليكا القائم وتم قياس كمية الحمض النووي الريبي. على أساس منحنى قياسي ولدت، تم عزل ما مجموعه 17.3، 24.8 و 50.9 خريج خريج / ميكرولتر من 50 و 100 و 200 الخلايا العصبية الدوبامين، على التوالي (الشكل 10A). لقياس كمية RNA مع Q-PCR، مجموعة من تركيزات RNA الدماغ كله وRNA من الخلايا العصبية الدوبامين تم نسخها العكس وكان قياسها باستخدام Q-PCR كما هو موضح سابقا 5 الجين-β الأكتين. وبناء على هذه القياسات، تم حساب تركيز 3.55، 6.82 و 20.58 جزء من الغرام / ميكرولتر من 50 و 100 و 200 الخلايا العصبية الدوبامين، على التوالي (الشكل 10B).

لشرح كيفية عزل الخلايا العصبية الدوبامين يقارن إلى العزلة من الخامس كاملتم قياس مساحة entral السقيفية مع LCM، جينات معينة الخلايا العصبية الدوبامين (Nurr1، التيروزين هيدروكسيلاز، ونقل الدوبامين) مع Q-PCR في هذه نوعين مختلفين من العينات ومقارنة التعبير عن β-الأكتين (الشكل 11). منذ يتم إنشاؤها أقل C القيم ر مع تركيز أعلى من هذا الجين من الفائدة، انخفاض في ر ΔC يشير تعبير زيادة من الجينات الدوبامين العصبية النسبية إلى β-الأكتين. هذا يوضح كيفية عزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية تركز التعبير عن جينات محددة الدوبامين العصبية. في عينات منطقة السقيفية البطنية، وتضعف جينات معينة الخلايا العصبية الدوبامين بها باعتبارها خلايا أخرى (الخلايا العصبية غير الدوبامين والخلايا الدبقية) كما سيتم جمعها التي تعبر عن β-الأكتين ولكن لا نبدي الدوبامين جينات الخلايا العصبية.

figure-results-3669
الشكل 1. التقاط الليزر باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) القبض على الليزر، ورسملة صغيرة LCM البلاستيك لديها غشاء على الجزء السفلي التي يتم وضعها على رأس الأنسجة التي شنت على شريحة زجاجية (الخطوة 1). عندما يتم التعرف على الأنسجة أو الخلايا من الفائدة، يتم تشغيل خاصية التقاط ليزر الأشعة تحت الحمراء من خلال الغطاء LCM أن تذوب الدمل صغير في غشاء على الكامنة الأنسجة / خلية (الخطوة 2). عند إزالة الغطاء LCM، تتم إزالة الأنسجة من شريحة المجهر ويبقى تعلق على غطاء LCM.

figure-results-4333
الشكل 2. القبض على الليزر باستخدام الأشعة تحت الحمراء (IR) القبض على الليزر والأشعة فوق البنفسجية (UV) قطع الليزر. من أجل الحصول على مساحات واسعة من الأنسجة أو تسهيل الانتعاش من الخلايا باستخدام الليزر فوق البنفسجية، هي التي شنت الأنسجة على شريحة مع غشاء متصلة الشريحة على طول الزاوية الخارجية (PEN الشرائح الغشاء). يتم وضع سقف LCM على رانه الأنسجة ويتم استخدام الأشعة تحت الحمراء القبض على الليزر لإذابة غشاء سقف وإرفاق الأنسجة إلى الحد الأقصى LCM (الخطوة 1 و 2). ثم يتم استخدام الليزر قطع الأشعة فوق البنفسجية لقطع طريق الغشاء الشرائح والأنسجة (الخطوة 3 و 4) بحيث عند إزالة الغطاء تتم إزالة الأنسجة من الشريحة ويبقى على الغطاء LCM (الخطوة 5).

figure-results-5180
الشكل 3. الليزر التقاط تسليخ مجهري نظام خارطة الطريق، وهذا النظام تسليخ مجهري القبض على الليزر لديه مساحة لمدة 3 الشرائح في وقت واحد. عندما يتم تحميل الشرائح في المجهر، يتم إنشاء تضخم منخفضة خارطة الطريق صور لكل شريحة. اختيار منطقة على صورة خارطة الطريق تتحرك النافذة صورة حية لتلك المنطقة. لأغراض العرض التوضيحي، وكان مقطوع الدماغ المتوسط ​​الماوس إلى 10 ميكرون القسم على 3 شرائح. وصفت الشريحة الأولى لالتيروزين هيدروكسيلاز immunoreactiviتاي باستخدام diaminobenzidine باعتباره chromagen (A). وقد شنت أقسام على أي من الشرائح سيلاني الإعدادية (ب) أو الشرائح غشاء PEN (C). وصفت كل من هذه الشرائح باستخدام السريعة الفلورسنت التيروزين هيدروكسيلاز المناعية. السهام في (C) تشير إلى الحجز على الغشاء PEN إلى شريحة زجاجية. لا الأنسجة خارج هذا الحدود يمكن جمع مع LCM.

figure-results-6211
الرقم 4. باستخدام التقاط الأشعة تحت الحمراء ليزر. ويستخدم الليزر التقاط الأشعة تحت الحمراء لإذابة غشاء سقف LCM إرفاق الأنسجة إلى الحد الأقصى LCM وإزالته من بقية الأنسجة. يجب أن يكون التقاط ليزر الأشعة تحت الحمراء في قوة كافية لإذابة غشاء سقف LCM بما فيه الكفاية في الاتصال النسيج والزجاج الشريحة الأساسية. الصورة أعلاه يظهر عندما كان ليزر غير كافية لإذابة غشاءإلى الشريحة (مقتل اثنين من البقع). عندما يلامس الأغشية ذاب شريحة زجاجية، ويمكن ملاحظة مخطط أسود سميك (المكان الصحيح). كثافة الليزر يمكن تعديلها عن طريق تغيير الطاقة (3-100 ميغاواط)، نبض (100-1،000،000 μsec) و# الفعالية من الليزر. بالإضافة إلى ذلك، كرر اطلاق النار ليزر الأشعة تحت الحمراء في نفس المكان كما يمكن للذوبان الغشاء. الهدف من الليزر IR بحاجة إلى تعديل في أي وقت يتم نقل الغطاء LCM أو عند تغيير الهدف. على نطاق وبار = 100 ميكرون.

figure-results-7214
الرقم 5. باستخدام الأشعة فوق البنفسجية قطع الليزر ويستخدم الليزر قطع الأشعة فوق البنفسجية لقطع طريق الغشاء PEN والأنسجة. قبل استخدام الحد الأدنى من شدة الحاجة لقطع طريق الغشاء ويحتاج الأنسجة ليتم تحديد منذ ليزر الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تتلف الأنسجة. أعلاه، وتظهر البقع الثلاث (السهام) من مختلف شدة الليزر الأشعة فوق البنفسجية مع حجم البقعة اليسرى يكفي لمدة 10 ميكرون أقسام، بقعة المتوسطة للأقسام سمكا والمكان الصحيح يدل على كثافة الليزر الأشعة فوق البنفسجية التي هي مرتفعة جدا. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8073
وتظهر الشكل 6. العزلة المباشرة من التيروزين هيدروكسيلاز الخلايا العصبية مناعيا باستخدام الليزر تحت الحمراء. الخلايا العصبية الدوبامين بعد وضع العلامات الفلورية السريع لهيدروكسيلاز التيروزين (A). عندما يتم تشغيل الليزر IR ذوبان الغشاء سقف LCM على هذه الخلايا العصبية (D)، وإزالة الغطاء يختار هذه الخلايا الخروج من الشريحة (B، E). ومن ثم يمكن تصور هذه الخلايا العصبية كما تعلق على غطاء LCM (C، F). مقياس شريط = 250 ميكرون.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52336/52336fig6large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8899
الرقم 7. العزلة المباشرة من التيروزين هيدروكسيلاز الخلايا العصبية مناعيا من PEN الشرائح الغشاء باستخدام الأشعة تحت الحمراء والأشعة فوق البنفسجية وأشعة الليزر. التيروسين هيدروكسيلاز وتظهر الخلايا العصبية المسماة أعلاه (A). يمكن تركيبها هذه الخلايا العصبية إلى الحد الأقصى LCM باستخدام الليزر تحت الحمراء وقطع من الشريحة غشاء PEN باستخدام الليزر فوق البنفسجية (B). مقياس شريط = 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9664
الشكل 8. غير المباشر عزل منطقة الجوفية السقيفية باستخدام التيروزين مناعية هيدروكسيلاز. وقد تصور موقع الخلايا العصبية الدوبامين في منطقة السقيفية البطنية في القسم باستخدام تقنيات المناعية القياسية (A و E). وقد استخدم هذا القسم المسمى المناعية كقالب لتحديد المنطقة الجوفية السقيفية في الفروع المجاورة غير ملوثين (B و F). باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية، كان يعلق المنطقة الجوفية السقيفية إلى الحد الأقصى LCM مع ليزر الأشعة تحت الحمراء وقطع من الشريحة مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية (C و D) ويظهر تعلق على غطاء HS LCM (D). كما هو موضح المرفقة المنطقة الجوفية السقيفية معزولة عن سيلاني الإعدادية الشرائح فقط باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء لسقف ماكرو (FK). لاحظ أن هناك حاجة محاولة أكثر من واحد لجمع معظم الأنسجة من هذه المنطقة (قارن G وJ). مقياس شريط = 500 ميكرون.pload / 52336 / 52336fig8large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-10841
شخصية جودة 9. RNA. electropherograms الممثل والصور هلام المرتبطة المتاحة تجاريا RNA كله الدماغ (A) وRNA معزولة عن أقسام بعد تثبيت الأسيتون وLCM (B) أو السريعة الفلورسنت المناعية التيروزين هيدروكسيلاز وLCM (C). وعلى الرغم من انخفاض نوعية الحمض النووي الريبي في أقسام معالجتها لالمناعية، مقارنة RNA الدماغ كله، وelectropherograms تثبت RNA معظمها سليمة على أساس وجود الريباسي S18 S28 والقمم. كان كله تركيز الحمض النووي الريبي الدماغ 6.487 جزء من الغرام / ميكرولتر مع RIN 8.2. كان الأسيتون تركيز الحمض النووي الريبي الأنسجة الثابتة 5.036 جزء من الغرام / ميكرولتر مع RIN 2.6. RNA الحصول على بعد المناعية ح الإعلان كان تركيز 4.474 جزء من الغرام / ميكرولتر وRIN غير متوفر.

figure-results-11766
الشكل 10. كمية RNA. لتحديد كمية من الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها مع LCM، تم إنتاج منحنى مستوى تركيزات RNA باستخدام fluorospectrometer وQ-PCR. للقياسات fluorospectrometer (A)، ويظهر الرسم البياني كبير نطاق أعلى من كميات RNA ويظهر الرسم البياني صغير حساسية هذا الاختبار وصولا الى 10 جزء من الغرام / ميكرولتر. وكانت تركيزات RNA تم الحصول عليها من 50 و 100 و 200 الخلايا العصبية الدوبامين 17.3، 24.8 و 50.9 جزء من الغرام / ميكرولتر، على التوالي. باستخدام Q-PCR لقياس كميات RNA (B)، وتركيزات من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من 50 و 100 و 200 الخلايا العصبية الدوبامين كان 3.55، 6.82 و 20.58 جزء من الغرام / ميكرولتر، على التوالي.

وفاق / ftp_upload / 52336 / 52336fig11highres.jpg "/>
الرقم 11. تركيز جينات معينة الخلايا العصبية الدوبامين مع عزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية، والفرق في C ر (ΔC ر) بين الجينات الدوبامين العصبية محددة (Nurr1، التيروزين هيدروكسيلاز، ونقل الدوبامين) وβ-الأكتين في عينات من الخلايا العصبية الدوبامين في المنطقة الجوفية السقيفية معزولة مع LCM بالمقارنة مع التعبير في تشريح كامل المنطقة الجوفية السقيفية ترد. منذ يتم إنشاؤها أقل C القيم ر مع تركيز أعلى من هذا الجين من الفائدة، انخفاض في ر ΔC يشير تعبير زيادة من الجينات الدوبامين العصبية النسبية إلى β-الأكتين كما الخلايا الأخرى (الخلايا العصبية غير الدوبامين والخلايا الدبقية) سوف يتم جمعها في بطني عينات منطقة السقيفية التي تعبر عن β-الأكتين ولكن لا نبدي الدوبامين جينات الخلايا العصبية.

Discussion

LCM هي تقنية قوية لتشريح للسكان منفصلة من الخلايا أو الأنسجة من مناطق أقسام الأنسجة على شريحة المجهر والعزلة لاحقة من الحمض النووي الريبي، الرنا الميكروي، DNA والبروتينات. استخدام LCM في تركيبة مع التحليل باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية مثل ميكروأري، الجيل القادم RNA تسلسل، وتحليل جينية من الحمض النووي والبروتينات أصبحت أكثر وأكثر شيوعا مثل حساسية هذه التقنيات يحسن ويتم خفض كمية المواد بدءا حاجة 8-12. مع LCM، يتم التوصل إلى قرار أفضل التشريحي للعينة، وتعزيز التفاهم من التدابير المصب من هذه العينات إلى حد كبير. التحذير واحدة مع LCM هو أنه يوفر عينة مركزة من الخلايا من الفائدة ولكن ليس بالضرورة أن يكون السكان نقية من الخلايا. حدود الدقة يعني أنه سيكون هناك بعض التلوث من الأنسجة المجاورة. ومع ذلك، هذه التقنية يفعل تركيز خلايا الفائدةلتقليل الآثار المرتبطة الأنسجة المحيطة والخلايا وتعظيم الآثار التجريبية على الخلايا من الفائدة.

مباشرة مقابل غير المباشرة المناعية

منذ يستخدم LCM حاليا في المقام الأول لعزل وقياس RNA، RNA حفظ سليمة هو معيار مهم جدا. الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي هو المبرر الرئيسي وراء استخدام المناعية غير المباشرة لتوجيه تشريح الأنسجة الذي يزيل ضرورة وصمة عار على النسيج مباشرة والتي يمكن أن تتحلل الحمض النووي الريبي (الشكل 10). عند السؤال التجريبي، ومع ذلك، يتطلب عزل مجموعة سكانية محددة من الخلايا، مثل الخلايا العصبية الدوبامين، مطلوب المناعية الفلورية مباشرة. ويمكن استخدام بروتوكول وضع العلامات المناعية السريع لحد من تدهور RNA أثناء العملية. الأوقات حضانة قصيرة هي نتيجة لاستخدام تركيزات عالية من الابتدائية والثانوية المضادةالهيئات، وتركيزات التي هي حوالي 10-20 أضعاف أعلى من ما هو ضروري لالمناعية التقليدية مع 2 ح الحضانة. ولكن إذا، هناك حاجة مرات حضانة أطول، وتستخدم براون وسميث مخازن عالية الملح لمنع تدهور RNA والحصول على جيد RNA الجودة مع أوقات حضانة طويلة (تصل إلى 20 ساعة) 13. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج إذا كان هناك وقت كبير المطلوب بين وضع العلامات من الأنسجة والحصول على إمكانية الوصول إلى نظام LCM.

اختيار الشرائح - غشاء PEN، سيلاني الإعدادية والشرائح الزجاجية غير المصقول

تم الإبلاغ عن استخدام الشرائح الزجاجية غير المصقول لLCM 14. في مختبرنا، تم العثور على الشرائح-سيلاني الإعدادية ليكون الخيار الأمثل، وهذا الطلاء تعلق بما فيه الكفاية الأنسجة إلى الشريحة لالمناعية دون فقدان الأنسجة ولكن لا يزال يسمح لمرفق من الأنسجة إلى القبعات LCM والعزل من الشريحة . الشرائح الزجاجية غير المصقول لهاأظهرت بعض فقدان الأنسجة مع الإجراء المناعية. إذا تم استخدام المناعية غير المباشرة، ومع ذلك، يصبح الاحتفاظ الأنسجة أقل من قضية. مع الجفاف السليم، والخلايا أو الأنسجة التقاط الخروج من الشرائح سيلاني-برب لم يكن قضية. كل واحد من الطرق المختلفة لعزل الخلايا العصبية أو مناطق الدماغ وصفها في هذه الورقة ديه مزايا وعيوب. لعزل الخلايا العصبية الدوبامين الفردية، واستخدام الشرائح-سيلاني الإعدادية لديه ميزة البصريات أفضل وأقل تكلفة من الشرائح غشاء PEN. والعيب هو أن الخلايا التقاط بعض الأحيان يمكن أن يكون من الصعب إذا كان هناك عدم كفاية الجفاف (انظر أدناه)، وبعض الأنسجة قد يكون غادر على الشريحة. ميزة من PEN الأغشية الشرائح هي أن استخدام مزيج من الليزر والأشعة فوق البنفسجية ليزر الأشعة تحت الحمراء يضمن أن الخلايا العصبية الدوبامين سيتم جمعها. الفشل في جمع الخلايا من PEN الشرائح الغشاء أبدا تقريبا يحدث، كما هو الحال أقل اعتمادا على الجفاف من الشرائح الزجاجية. ل ميزة إضافية هي أن ليزر الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تستخدم لتقريب أكثر عن كثب شكل الخلايا العصبية من الفائدة، بالمقارنة إلى دائرة لالتقاط الخلايا العصبية الخروج من الشرائح الزجاجية مع ليزر الأشعة تحت الحمراء. لعزل مناطق من الأنسجة، والشرائح غشاء PEN هي أعلى بكثير وتبرر التكاليف المضافة. هذه النتائج النهج في إزالة كاملة من جميع الأنسجة قطع على الغشاء، هو أسرع بكثير من الاستيلاء على مساحة كبيرة من الأنسجة باستخدام الليزر تحت الحمراء وحدها وأقسام الأنسجة سمكا يمكن جمعها. فقط باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء يتطلب أن غشاء سقف LCM ذاب تماما على المنطقة بأسرها الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، جمع ناقصة من النسيج هو نموذجي، وعادة ما يتطلب عدة محاولات. على الرغم من أن هذا يستغرق وقتا أطول من عزل الأنسجة من الشريحة غشاء PEN، إذا كانت الأنسجة المتاحة بالفعل على شريحة زجاجية أو ليزر الأشعة فوق البنفسجية غير متوفرة، وهذا هو خيارا قابلا للتطبيق لأن معظم الأنسجة يمكن جمعها (الشكل 8J).

"> خطوات حاسمة ove_content

حضانات الإيثانول بنسبة 100٪ هي واحدة من أهم الخطوات. من أجل جمع الخلايا من الشرائح سيلاني الإعدادية مطلوب الجفاف الكامل للأنسجة. ولذلك، فإن أي ماء لا إزالتها، والذي يرتبط في الغالب مع الإيثانول بنسبة 100٪ الحضانة، وتؤثر على القدرة على التقاط الخلايا من الشرائح. من أجل معالجة هذه المسألة، كثيرا ما تتغير 100٪ الحلول الايثانول كما امتصاص الماء من الجو أو نقل من الخطوات السابقة الغسيل يمكن أن يؤثر على الجفاف. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام المناخل الجزيئية لاستيعاب أي تلوث المياه. ينبغي من الناحية المثالية أن يوجد فيه نظام LCM في غرفة صغيرة مع مزيل الرطوبة للحفاظ على ظروف الرطوبة منخفضة.

أقسام ناظم البرد الجيدة هي حاسمة لLCM المناسب. أقسام تحتاج إلى أن تكون شقة مع طيات في نسيج التقليل. يحمل في طيات النسيج سوف تزيد من المسافة بين الغطاء LCM ومنعه من الاتصال رانه الأنسجة. ثم يصبح من الصعب بما فيه الكفاية تذوب الغطاء غشاء على الأنسجة. لالشرائح الزجاجية، وعادة سمك الباب يحتاج إلى ما بين 6 و 12 ميكرومتر. أقسام سمكا يمكن التقاط مع الشرائح غشاء PEN.

تقدم LCM القدرة التقنية لجعل تشريح دقيقة جدا من الأنسجة والخلايا من شرائح المجهر. هذا يزيد بشكل كبير من حل المزيد من التحليل بالمقارنة مع تشريح الإجمالي من قطع الأنسجة. وعلى الرغم من LCM يمكن أن يكون الوقت والعمل المكثف، أنها لا تتطلب تدريبا مكثفا أو الخبرة، وعندما يقترن مع تقنيات عالية الإنتاجية الأخرى، يمكن أن يعزز إلى حد كبير في فهم عملية بيولوجية عندما تستخدم خلايا منفصلة أو المناطق التشريحية.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 - 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Veritas Laser Capture Microdissection SystemLife Technologies, Grand Island, NYNewer model is now sold
CapSure Macro LCM CapsLife Technologies, Grand Island, NYLCM0211
CapSure HS LCM CapsLife Technologies, Grand Island, NYLCM0213
PEN Membrane slidesLife Technologies, Grand Island, NYs4651
Silane prep-slidesSigma-Aldrich, St. Louis, MOS4651
95% Ethanol-RNase FreeSigma-Aldrich, St. Louis, MOE7148
100% Ethanol-RNase FreeSigma-Aldrich, St. Louis, MOE7023
Rnase Free TritonSigma-Aldrich, St. Louis, MOT8787
Molecular SieveEDM Millipore, Billerica, MAMX1583D
Anti-Tyrosine hydroxyase antibodyEDM Millipore, Billerica, MAAb152
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgGLife Technologies, Grand Island, NYA-11008
2100 BioanalyzerAgilent Technologies, Santa Clara, CAG2939AA
Stratagene MX 3005PAgilent Technologies, Santa Clara, CA401513
Nanodrop 3300 fluorospectrometerThermo Scientific
Quant-iT RiboGreenLife Technologies, Grand Island, NYR11490
RNaseZapLife Technologies, Grand Island, NYAM9780

References

  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  2. Schutze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nature biotechnology. 16, 737-742 (1998).
  3. Schutze, K., Posl, H., Lahr, G. Laser micromanipulation systems as universal tools in cellular and molecular biology and in medicine. Cellular and Molecular Biology. 44, 735-746 (1998).
  4. Vandewoestyne, M., Van Nieuwerburgh, F., Van Hoofstat, D., Deforce, D. Evaluation of three DNA extraction protocols for forensic STR typing after laser capture microdissection. Forensic Science International Genetics. 6, 258-262 (2012).
  5. Eells, J. B., Wilcots, J., Sisk, S., Guo-Ross, S. X. NR4A gene expression is dynamically regulated in the ventral tegmental area dopamine neurons and is related to expression of dopamine neurotransmission genes. Journal of Molecular Neuroscience. 46, 545-553 (2012).
  6. Seelan, R. S., et al. Epigenetic analysis of laser capture microdissected fetal epithelia. Analytical Biochemistry. 442, 68-74 (2013).
  7. Kim, W., et al. miR-126 contributes to Parkinson's disease by dysregulating the insulin-like growth factor/phosphoinositide 3-kinase signaling. Neurobiology of Aging. 35, 1712-1721 (2014).
  8. Bohm, C., et al. Effects of antidepressant treatment on gene expression profile in mouse brain: cell type-specific transcription profiling using laser microdissection and microarray analysis. Journal of Neurochemistry. 97, Suppl 1. 44-49 (2006).
  9. Kadkhodaei, B., et al. Transcription factor Nurr1 maintains fiber integrity and nuclear-encoded mitochondrial gene expression in dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2360-2365 (2013).
  10. Miller, R. A., et al. Quantitative Proteomics in Laser Capture Microdissected Sleep Nuclei From Rat Brain. Journal of Neurogenetics. , (2014).
  11. Roberts, E., et al. Application of laser capture microdissection and protein microarray technologies in the molecular analysis of airway injury following pollution particle exposure. Journal of Toxicology and Environmental Health. A. 67, 851-861 (2004).
  12. Yuferov, V., Nielsen, D., Butelman, E., Kreek, M. J. Microarray studies of psychostimulant-induced changes in gene expression. Addiction Biology. 10, 101-118 (2005).
  13. Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15, 2364-2374 (2009).
  14. Curran, S., McKay, J. A., McLeod, H. L., Murray, G. I. Laser capture microscopy. Molecular Pathology. 53, 64-68 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

96 PEN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved