منظور تقني في الحديث شجرة الدائري البحث - كيفية التغلب على Dendroecological والخشب تشريحية التحديات

Summary

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Abstract

يستخدم البحث Dendroecological المعلومات المخزنة في حلقات الأشجار لفهم كيفية الأشجار واحدة والنظم الإيكولوجية للغابات بأكملها حتى استجابت للتغيرات البيئية وأخيرا لإعادة بناء هذه التغييرات. ويتم ذلك من خلال تحليل الاختلافات نمو العودة في الوقت المناسب وربط مختلف المعايير الخاصة بالمصنع ل(على سبيل المثال) سجلات درجات الحرارة. ان دمج الخشب المعلمات التشريحية في هذه التحليلات تعزيز إعادة البناء، حتى وصولا الى قرار البينية السنوي. لذا نقدم بروتوكول بشأن كيفية أخذ عينات، وإعداد وتحليل عينة خشبية للتحليلات العيانية المشتركة، ولكن أيضا للتحاليل مجهرية لاحقة. وعلاوة على ذلك نحن نقدم حلا ممكنا لتحليل الصور الرقمية ولدت من العينات الصغيرة والكبيرة المشتركة لدعم تحليل السلاسل الزمنية. يقدم البروتوكول الخطوات الأساسية لأنها حاليا يمكن استخدامها. أبعد من ذلك، هناك حاجة مستمرة لتحسين التقنيات القائمة، وتطوير ر جديدechniques، لتسجيل وقياس العمليات البيئية الماضية والجارية. يحتاج الخشب البحوث التشريحية التقليدية ليتم توسيعها لتشمل المعلومات البيئية لهذا المجال من الأبحاث. وهذا من شأنه دعم dendro-العلماء الذين يعتزمون تحليل معايير جديدة وتطوير منهجيات جديدة لفهم الآثار قصيرة وطويلة المدى من عوامل بيئية محددة على تشريح النباتات الخشبية.

Introduction

الأشجار، وكذلك الشجيرات والشجيرات القزمة، وحتى الأعشاب، وتظهر أنماط استجابة متعددة المتصلة بالتغيرات في بيئتها. وكانت هذه الأنماط تخضع لعلم النبات وعلم فسيولوجيا النبات منذ القرن ^التاسع منتصف 19. في ذلك الوقت، ركزت الأبحاث على النباتات الخشبية في الغالب على الأشجار وتحليل وصفي لهيكل وتنوع الحلقات السنوية في سياق البيئي ^1. عندما اخترع اندرو اليكوت دوغلاس تقنية عبر تاريخها للبحوث شجرة الدائري ^2، وكان أكثر أو أقل قمع هذا السياق للبيئة من القدرة الجديدة حتى الآن بدقة النتائج خشبية في علم الآثار. عبر تاريخها للمرة الأولى تمكين يرجع تاريخها دقيقة من حلقات شجرة مع السنة التقويمية وحتى الآن تعتبر بمثابة العمود الفقري للبحوث شجرة الدائري في جميع مجالات تطبيقها ^1.

في موازاة ذلك، منذ نهاية القرن ال19، وعلم التشريح الخشب تطورت الى الانضباط البحوث الهامة تتعلقد إلى العديد من المجالات الأخرى من العلوم الطبيعية والتطبيقية ^3. يتم وضع اثنين من المجالات الرئيسية: تشريح منهجي الخشب، والتي هي أساسا لتحديد الخشب في علم الآثار ^4، وتشريح الخشب التطبيقية، المتعلقة بالتكنولوجيا الخشب، علم وظائف الأعضاء، علم الأمراض، وعلم البيئة ^3،5.

في مجال البحوث شجرة الدائري، dendroecology في الوقت الحاضر هو الذي يعرف بأنه موضوع يشمل الدراسات شجرة الدائري ذات الصلة مع التركيز على الدراسات البيئية مثل العمليات الجيومورفولوجية (dendrogeomorphology) ودرجة الحرارة وهطول الأمطار اعادة البناء (dendroclimatology)، والتغيرات منسوب المياه (dendrohydrology) أو حتى تقلبات الجليدية ( dendroglaciology) ^6. كما يشير هذا التعريف، أصبحت التحليلات شجرة الدائري متزايد الأهمية في مجال التعارف وإعادة بناء العمليات البيئية مثل (ط) الظروف المناخية الماضية من خلال تحليل التغيرات السنوية في الدائري العرض ^7،8، كثافة الخشب ⁹ أو نظائر ^10، أو (ب) رانه نكس فترات من العمليات الجيومورفولوجية ^11. هذه الدراسات مفصلة جدا حول الاختلافات الدائري العرض ومحتواها النظائر تظهر الحاجة لتحليل حلقات بمزيد من التفصيل، أي لدراسة بنية التشريحية للحلقات. ومع ذلك، دراسات تفصيلية من الميزات الخشب التشريحية داخل الحلقات السنوية المتعلقة بالتغيرات البيئية نادرة ^12،13. وعلى الرغم من هذه الميزات المجهرية المعروفة ^14، فإنها نادرا ما تم تطبيقه على المستوى المجهري لبحث dendroecological. وعلاوة على ذلك، فإن توقيت دقيق لهذه التفاعلات النمو في الأشجار ينمو بصورة طبيعية، ضرورية لأغراض يرجع تاريخها بالضبط، ونادرا ما تم توثيق مؤخرا ^15.

وفيما يتعلق آثار الاحترار العالمي ^16، وتحسين تطوير تقنيات الحاليين والجدد لتسجيل وكميا العمليات البيئية السابقة والحالية هو مطلوب، وخاصة من حيث البحوث تأثير المناخ ^11.من خلال توسيع الخشب البحوث التشريحية التقليدي إلى الخشب التشريح أساس بيئيا ^17، يمكن dendro-العلماء تحليل معايير جديدة وتطوير منهجيات جديدة لفهم المدى القصير والمدى الطويل آثار عوامل بيئية محددة على تشريح النباتات الخشبية ^(18). معرفة تفصيلية عن الاختلافات في معايير مختلفة من الخلايا ضمن حلقات الفردية المتصلة السائقين محددة (على سبيل المثال، القوات الميكانيكية والتقلبات المناخية) هو شرط أساسي لفهم التباين في تشكيل عصابة شجرة. مقارنة لقياسات الدائري العرض المشتركة، وتحديد الاختلافات التشريحية الخشب يتطلب تقنيات إعداد أكثر تعقيدا وتوسعية التي تتطلب الكثير من العمل والوقت. إجراءات تفصيلية من القطع عينة، وتلطيخ، والتضمين هي متعددة ودائما تعتمد على الهدف من هذه الدراسة ^19.

لتحليل العيانية من عرض حلقة في الصنوبريات أو الهياكل حتى بالنسبة لعدد وحجم أو تنقيبibution السفن في الصلب، ومصقول سطح عينة عادة باستخدام غرامة رقة جلخ أو آلات طحن الخاصة ^20. عيوب هذا الإجراء هو ملء الخلايا الفردية مع الغبار الذي يمنع المزيد من شبه التحليل المجهري ^21. وتتحقق أفضل النتائج لإعداد العينات العيانية عندما يتم قطع سطح العينة باستخدام شفرة حلاقة أو سكين حاد آخر.

أما بالنسبة للعينات الصغيرة، وشفرات الحلاقة هي أداة مثالية. عينات أكبر كما النوى تتطلب قطع الأسطح طائرة على مدى كاملة من النوى. وعلى النقيض من الرملي، لا يتم ملء الخلايا مع الغبار، والتي تمكن مزيد من التحضير لتحليل الصور التوالي. وعلاوة على ذلك، فإن التجويف مفتوحة الخلية، وجدران الخلايا خفض بشكل صحيح، وسطح الطائرة من العينة كلها تتيح تطبيق عالية التردد كثافة ²² إلى مدى كامل من جوهر. لصورة تحلل، والسطح العينات (خليةالجدران) يمكن أن تكون ملطخة باستخدام الحبر الأسود، ويمكن بعد ذلك أن يملأ التجويف خلية مفتوحة مع الطباشير الأبيض لتعزيز التباين بين جدار الخلية ومنطقة التجويف ^19،23. هذه التقنية بسيطة إلى حد ما تمكن تقييم العيانية الأساسي للهياكل الخلية أكبر لقياسات حجم السفينة.

هذه التقنيات لقطع الأسطح طائرة كافية لتحليل العيانية. لتشريحية مفصلة الخشب (أي المجهري) التحليل، والتي تنتقل عن طريق المجهر الضوئي هو الأسلوب الأكثر شيوعا تطبيقها في العلوم dendro. خلايا الخشب تفرق من خلال عمليات معقدة تشمل تحديد الخلية من نوع، انقسام الخلايا، وتمايز الخلايا، وموت الخلايا المبرمج ^24. منذ توقيت والمعدل الذي تحدث هذه العمليات تحديد الخصائص التشريحية خلية، يمكن أن الظروف البيئية التي تؤثر على هذه العمليات توليد الانحرافات التشريحية في بنية الحلبة. كما شرط مسبق هام لهذه تحليلالصورة، تحتاج أقسام متناهية الصغر لتكون على استعداد مع مشراح ^19. عند إعداد عينات لباجتزاء، وتسليط الضوء على قصيبة أو الألياف الاتجاه أمر بالغ الأهمية. ينصح استخدام اليد مدفوعة انزلاق مبضع للفحص المجهري لخفض أقسام الدقيقة لهذه التقنية تسهل أقسام عالية الجودة حسب الحاجة لصورة يحلل ^19. اعتمادا على الهدف المحدد للدراسة معينة، يتم قطع الفروع الصغيرة عمودي أو موازية لمدى الطولي للخلايا. ثم يتم تصويرها هذه الأقسام أدناه المجهر وأبعاد الخلية قياسها باستخدام صورة المتخصصة يحلل البرمجيات.

حتى وقت قريب، كان مقتصرا على القدرة على إعداد أقسام صغيرة لعينة أحجام صغيرة فقط (حوالي 1 سم × 1 سم). هذا هو مقبول لتحليل الأحداث واحدة كما اضطرابات في السنوات محددة، ولكن هذه التقنية لا تسمح الموسعة تحليل السلاسل الزمنية اللازمة لإعادة البناء البيئية. هذا الجهد لا يمكن إلا أن يدركد من خلال تطوير إجراءات إعداد جديدة وفعالة واقتصادية والتقنيات التحليلية. في السنوات الأخيرة، بدأ أعضاء المختبر شجرة الدائري في معهد البحوث السويسري الاتحادي وسل في سويسرا العمل المكثف حول هذا الموضوع. ونتيجة لذلك، تم تطوير أجهزة جديدة وتقنيات تحليل لدعم فكرة دمج الخشب الخصائص التشريحية لمجموعة واسعة من الموضوعات البحثية البيئية.

Protocol

1. تقنيات أخذ العينات

1. أخذ العينات الأساسية
   1. لشجرة أخذ العينات ينبع، واستخراج اثنين على الأقل من النوى باستخدام أخذ العينات الجوفية الزيادة من كل وقف لتحليل تطور نموها. تختلف موقف أخذ العينات على المهمة البحثية، على سبيل المثال، لإعادة بناء المناخ مشتركة تأخذ بالتوازي النوى إلى المنحدر. عند العمل مع الأنواع الاستوائية، وتأخذ على الأقل ثلاثة أو أكثر من النوى.
   2. استخدام أخذ العينات الجوفية زيادة شحذ (5، 10 أو 12 ملم في القطر) ووضع أخذ العينات الجوفية عمودي على محور متزايد من الجذع.
      ملاحظة: ليكون لها موقف رقابة والمستقر للأخذ العينات الجوفية، واستخدام انتهازي لتجنب تحركات أخذ العينات الجوفية غير دورانه عند الحفر عليه في شجرة. حملت في الجذعية على طول الطريق إلى ومن خلال لباب. لالأساسية الخشب كثيفة جدا (أي الأنواع الاستوائية)، استخدم الهيئات بالمنشار أعيد تشكيل هيكلها خاصة مع محول من النوى الزيادة التي تسمح لالأساسية حتى الغابة الكثيفة كما Diospyrus ebenum (الأبنوس).
   3. استخدام مستخرج وإزالة النواة الناتجة عن شجرة. تتحول أخذ العينات الجوفية وإزالته من الجذع.
   4. إضافة ID معين حتى النخاع المستخرج باستخدام قلم رصاص لينة عن طريق الكتابة على الشريط، والتي يتم بعد ذلك وضعها مباشرة على جوهر. كرر الإجراء على الجانب الآخر من الجذع.
   5. تخزين اثنين من عينات من شجرة في أنابيب بلاستيكية أو ورقية أو صناديق خاصة لمنع أي ضرر.
      ملاحظة: القش ورقة هي مفيدة ولا سيما في البيئات الاستوائية لأنها تمنع النوى من صب.
   6. وأخيرا، جبل النوى (الاتجاه الألياف تستقيم) على الحزم دعم خشبية. استخدام الماء البارد الغراء الخشب المقاوم والسماح لهم الجافة.
      ملاحظة: لا يوجد جبل النوى على دعامات خشبية إذا كان الهدف من هذه الدراسة تشمل المزيد من المواد الكيميائية والنظائر أو تحليل الكثافة. لهذه الأغراض، وتحديد النوى في قنوات كابل مفتوحة أو الكرتون المموج واجهت واحد.
2. أخذ العينات الصغيرة الأساسية
   1. استخدام جهاز خاص اللكمأو إبرة مع افتتاح 2 مم. حسب سمك النباح استخدام إزميل لإزالة جزء ضروري من لحاء.
   2. وضع الجهاز عمودي على محور المتزايد على الساق كما هو موضح أعلاه، واستخدام مطرقة لاختراق الخشب من جذع إلى حوالي 2 سم في العمق.
   3. تحويل إبرة لكسر الناتجة جوهر الصغير داخل الأداة وإزالتها من الجذع. تخزين النوى الصغيرة في قارورة ميكروسنتريفوج وتسمية لهم.
3. أخذ العينات القرص
   1. في حالات خاصة (وخصوصا في المناطق المدارية)، على سبيل المثال، عندما أخذ العينات جذوعها والأشجار الساقطة أو كلما أمكن ذلك، واتخاذ أقراص (المقاطع العرضية عمودي على محور متزايد) مع منشار السلسلة. ببساطة تسمية أقراص وتخزينها حتى مزيد من التحليل.
      ملاحظة: يتم تطبيق هذا الإجراء أخذ العينات الأكثر شيوعا لجميع المواد الجافة القتلى والتاريخية والأثرية وشبه الأحفوري وكذلك الأخشاب الصلبة الكثيفة جدا التي لا تسمح باستخدام معدات استخراج عينات جوفية الزيادة.

إعداد 2. عينة

1. الرملي الأقراص
   1. وضع الأقراص على جهاز الرملي وطحن السطح باستخدام سلسلة من المواد الكاشطة على نحو متزايد غرامة، بدءا من الصنفرة من 80 حصى، تليها 120، 220، 300 الحصباء. وتلميع النهائي مع 400 حصى كافية بالنسبة لمعظم الصنوبريات. على الأخشاب الصلبة والأنواع الاستوائية خاصة، واستخدام الرملي فريك تصل إلى 1،200 لتمييز حدود النمو الدائري.
2. قطع الأسطح طائرة على النوى
   1. إصلاح النوى الزيادة في حامل جوهر مشراح الأساسية المطورة حديثا تمكن من قطع الأسطح طائرة على النوى على مداها بأكمله.
      ملاحظة: تصحيح اتجاه الأساسية داخل حامل أن يكون الاتجاه الألياف من العينة تستقيم، والتي هي في الزاوية اليمنى للسكين من مشراح.
   2. رفع الأساسية حتى يلمس قليلا النصل. سحب شفرة، الذي هو ثابت على الكرة التوجيه تحمل على مدى الأساسية لCUر قبالة الجزء الأول من القمة.
   3. ابعاد السكين وراء الأساسية، ورفع صاحب العينة مع جوهر حوالي 10 ميكرون وكرر الإجراء القطع. القيام بذلك حتى يتم قطع ما يقرب من ثلث قطرها جوهر إلى أسفل مما أدى إلى سطح الطائرة المستمر.
3. إعداد أقسام متناهية الصغر من خلال إضافة محلول نشا الذرة.
   1. لتحليل صورة مفصلة للهيكل التشريحية، وتحديد تقسيم النوى أو عينات أخرى من من أقراص في حامل من مشراح. ضع شفرة مبضع للفحص المجهري، مسترشدة اضعا الكرة على توجيهات مشراح زلاجة وضعت حديثا على الحافة العلوية من العينة وسحب أكثر من ذلك.
   2. ابعاد شفرة لرفع عينة من حوالي 20 إلى 30 ميكرون وسحب شفرة على عينة مرة أخرى. كرر هذا الإجراء حتى يتم إنشاء سطح المستمر على أعلى من العينة.
   3. تغطية الناتجة السطح مع حل نشا الذرة (10 غرام من نشا الذرة، 8 مل من الماء، و 7 غرام من 100٪ glyceroل) مع فرشاة المشتركة.
      ملاحظة: الحبوب النشا تملأ الخلايا مفتوحة من العينة لتحقيق الاستقرار في الهيكل لقطع لاحق من الشرائح الرقيقة.
   4. رفع العينة بنسبة 15 ميكرون، ضع الفرشاة على سطح العينة وسحب شفرة ببطء نحو العينة بدءا بقطع قسم رقيقة (أقل من الفرشاة). في حين خفض، والشرائح قسم الناتجة على شفرة تسترشد الفرشاة.
   5. عندما يتم قطع الجزء كامل، وإزالة القسم الصغير من شفرة مع فرشاة والماء (لتقليل الاحتكاك) ووضع القسم على شريحة زجاجية لمزيد من التحضير. لمنعهم من التجفيف، وتغطي عليها باستخدام كمية صغيرة من الجلسرين (33٪ = جزء واحد من 100٪ الجلسرين وجزأين من الماء).

3. شريحة مجهرية إعداد

1. لإعداد التالية من الشرائح دائمة، وغسل أول الجلسرين بعيدا عن الباب الصغير مع ماصة والماء.
2. تغطية الرطب حد ذاتهاction مع بضع قطرات من Safranin (1 غرام من مسحوق Safranin + 100 مل من الماء) وAstrablue (0.5 غرام من مسحوق سياراتهم استرا والأزرق + 2 مل من حمض الخليك 100٪ + 100 مل من الماء) للتمييز بين lignified وغير lignified الهياكل، ولكن أيضا لتعزيز النقيض لتحليل الصور لاحق.
3. دع القسم الباقي لمدة 5 دقائق قبل صبغ مغطاة ثم غسله مع ماصة والمياه مرة أخرى.
4. حالما تتم إزالة الصبغة المفرط، ويذوى القسم مع ماصات من قبل غسلها مع سلسلة من 75٪ المخفف، 96٪، وأخيرا الإيثانول بنسبة 100٪.
5. استخدام الماصات لشطف العينات على شريحة زجاجية بدلا من وضع العينات في الحمام لتقليل وقت المعالجة إلى حوالي أسبوعين إلى 3 دقائق لعملية الجفاف بأكملها.
   ملاحظة: الجفاف مع الإيثانول يمنع عينات الهشة من الانهيار.
6. شطف بعد ذلك القسم مع 100٪ زايلول.
   ملاحظة: الزيلين غير مسرطنة والتهوية واجبة في المختبر عند استخدامه. آخرمنتجات موجودة استبدال زايلول، ولكن إذا كان هناك نية لتخزين عينات على مدى فترات أطول الزمن (سنوات، العقود) لإعادة تحليل المحتملين، كندا بلسم (الخطوة 3.5.2) هو متوسط ​​تضمين فقط أن يبقى واضحة من دون تغيير اللون مع مرور الوقت. للأسف يحتاج كندا بلسم لاستخدامها في تركيبة مع زايلول.
7. طالما يتحول زايلول حليبي (بيضاء)، كرر عملية الجفاف كما أنها ليست المجففة بما فيه الكفاية.
8. حالما زايلول يبقى واضحا، وتغطي القسم مع قطرة من 100٪ بلسم كندا وتغطية ذلك مع غطاء زجاجي على الأقل من حجم القسم.
   ملاحظة: يجب أن تدرك إزالة فقاعات الهواء عن طريق الضغط بلطف على الزجاج غطاء لأسفل.
9. ضع الشريحة الصغيرة الناتجة بين قطعتين من البلاستيك مقاومة للحرارة ووضعه على لوحة معدنية. وضع الوزن (على سبيل المثال، مغناطيس) على رأس الشريحة للضغط عليه للحفاظ على القسم شقة أثناء عملية التجفيف التالية.
10. ضع الشرائح في الفرن على60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. بعد 12 ساعة، واتخاذ الشرائح من الفرن ووضعها على رف السماح لهم يبرد إلى RT (حوالي 20 درجة مئوية). عندما تبرد، وإزالة الوزن وقطاع البلاستيك وتنظيف الشريحة باستخدام شفرات الحلاقة لإزالة الفائض كندا البلسم.

4. تصور محتويات الخلية

1. إعداد Nawashin حل ^25.
   1. يعد حل (A) مع 5 غرام من حامض الكروم، 50 مل من حمض الخليك 96٪، و 320 مل من الماء منزوع الأيونات. إعداد حل آخر (B) مع 200 مل من الفورمالين مع 175 مل من الماء منزوع الأيونات.
   2. مزيج حل A و B حل في نسبة 1: 1 لإنشاء حل Nawashin.
2. لتصور محتويات الخلية، وتحديد العينة مع حل Nawashin لمدة 10 دقيقة لوقف جميع عمليات التدهور داخل الخلية.
   ملاحظة: تثبيت يحفظ نوى الخلايا مما يسمح لتقدير طول العمر الخلية (خلية طول العمر = نوى الحالية / نوى غائبة، وس جودص غياب النواة يشير إلى ما إذا الخلية يعيش أو ميتا).
3. بعد التثبيت، وغسل أقسام بالماء لإزالة بالكامل الحل Nawashin قبل تلطيخ لهم Safranin-أسترا الأزرق وقبل بالإضافة إلى تلطيخ لهم البكريك-الأنيلين الأزرق (1 جزء المشبعة انيلين للذوبان في الماء الزرقاء + 4 أجزاء من حامض البكريك 10٪) .
4. تسخين بعناية العينة إلى حوالي 80 درجة مئوية (في أي حال أقل من نقطة الغليان) لتسريع عملية تلطيخ. لالجفاف والتضمين من العينات اتباع بروتوكول الخطوات 3،4-3،8.

5. إعداد الصور الرقمية من الميزات التشريحية

1. إنشاء صور رقمية من السطوح الأساسية للتحليل السفينة.
   1. قطع الطائرة السطح الأساسية باستخدام مشراح الأساسية وصمة عار الناتجة الأسود سطح ببساطة عن طريق استخدام علامة شعر.
   2. بمجرد المجففة الصبغة، وفرك سطح الأساسية مع الطباشير الأبيض. اضغط على الطباشير في الخلايا ببساطة عن طريق فرك الطباشير علىالسطح باستخدام الإصبع. أيضا إزالة فائض الطباشير من قبل هذا الإجراء.
      ملاحظة: ونتيجة لجدران الخلايا هي الأسود وأجزاء تجويف الأوعية هم من البيض. هذا التناقض هو شرط مسبق لتحليل الصور الآلي.
   3. ضع أعدت تحت المجهر مجهر مجهزة الكاميرا الرقمية الأساسية. اتخاذ سلسلة من تداخل قليلا (حوالي 10٪) وصور تبدأ على جانب واحد من جوهر حتى يتم القبض على كامل السطح. غرزة الصور واحدة لخلق صورة كاملة لسطح الأساسية.
2. إنشاء الصور الرقمية من الشرائح الصغيرة
   1. ضع الشرائح الصغيرة تنظيفها تحت المجهر واتخاذ تداخل الصور من الجزء كامل.
   2. تحديد التكبير محدد اعتمادا على هياكل ليتم تحليلها، تتراوح ما بين 40X و1،000X التكبير.
   3. غرزة الصور واحدة لخلق صورة واحدة كاملة من هذا الباب. لتجنب التشوهات المحتملة أثناء عملية خياطة، استخدم "؛ خطة "من نوع العدسات موضوعية مع المجهر.

6. تحديد مقدار تشريحية الميزات

1. للكشف عن خلايا والحدود حلقة باستخدام ROXAS18 صورة أداة تحليل أو برامج مماثلة، تحميل صورة كاملة من قسم الصغيرة ومعايرة المكانية المرتبطة الحصول على النتائج الكمية في وحدات متري. حساب المعايرة المكانية عن طريق قياس عدد البكسل بين جداول ميكرومتر الصور المرحلة التي اتخذت في نفس التكبير وتقسيم القيمة التي حصلت عليها على نطاق وتباعد في وحدات متري (على سبيل المثال 1،000 ميكرون).
2. اختر من القائمة المقدمة (المقدمة في البرنامج) تكوين مناسب قبل البدء في الجزء التلقائي للتحليل.
   ملاحظة: التكوين عبارة عن مجموعة الأمثل سابقا من إعدادات البرنامج، على سبيل المثال، يأخذ بعين الاعتبار لون تلطيخ من العينة وحجم وشكل مجموعة من الخلايا ليتم الكشف. تكوينات مصممة بالتاليالسماح لتحقيق نتائج الاعتراف الأمثل لمختلف الأنواع والصفات الصورة.
   1. حدد خيارات أخرى مثل استخدام مناطق في الصورة التي سيتم تضمينها أو استبعادها لتجنب، على سبيل المثال، وهوامش صورة فارغة أو الشقوق في العينة، إذا لزم الأمر.
3. بدء تحليل بواسطة الضغط على زر تحليل. إذا اختار، وتحديد المناطق في الصورة التي سيتم تضمينها أو استبعادها باستخدام مضلع، مستطيل أو دائرة الأداة. يستخدم التحليل الآلي التالية خوارزميات مرنة لتصحيح بعض أوجه القصور صورة (على سبيل المثال، وعلى النقيض الفقراء) وتحسين النقيض من ذلك بناء على جودة الصورة.

النتائج

جميع التحليلات dendroecological تعتمد على عينات دقيقة، بغض النظر إذا اتخذت أقراص، النوى، أو النوى الصغيرة. لهذا، تحتاج الأجهزة لتكون في شكل مثالي (شحذ بدقة) لتجنب الشقوق الصغيرة داخل العينة خشبية. عند إعداد الأسطح على النوى الزيادة، واستخدام مشراح الأساسية أمر ضروري. القدرة على الحصول على خلايا المفتوحة، والتي يمكن أن تعالج أيضا على تعزيز التباين لتحليل الصورة وقياسات حجم السفينة (الشكل 1)، هو خطوة أولى مهمة نحو التكيف الهياكل التشريحية في الوقت تحلل السلسلة. أحيانا كثافة عينة الصلبة يمنع استخدام مشراح. في هذه الحالة تلميع السليم وإزالة لاحقة من نشارة الخشب المفرطة من السفن مع ضاغط أو الفراغ هو الخيار الأفضل.

لتحليل أكثر تفصيلا للهياكل الخلية الصغيرة كما earlywood وtracheids latewood في الصنوبريات، وهناك حاجة إلى أقسام صغيرة جودة عالية. هنا، potentiالتحف آل مثل جدران الخلايا الثانوية يجري تجريد قبالة جدار الحاجة الأساسية التي ينبغي تجنبها (الشكل 2). في حالة حدوث هذه القطع الأثرية في الصور الرقمية، وتحليل الآلي للأبعاد الخلية لم يعد ممكنا. ثم تحتاج القطع الأثرية إلى تصحيح يدويا، والتي تستغرق وقتا طويلا، وفي معظم الحالات النتائج في القياسات غير صحيح من أبعاد الخلية. تطبيق بسيط من السوائل غير النيوتونية، أي حل نشا الذرة، إلى الأعلى من العينة يدعم استقرار الهيكل في حين خفض وقوع القطع الأثرية إلى أدنى حد ممكن (الشكل 2) ^26. هذا التطبيق من نشاء الذرة، ومناسبة لجميع العينات الخشبية بما في ذلك الأنواع الاستوائية، ويجعل تطبيق إجراء التضمين للعينات قبل قطع زائدة عن الحاجة.

تمكن أقسام الدقيقة تصميما أكثر أمنا من الحلقات السنوية. هذا هو الحال بالنسبة لالصنوبريات تنمو على حدودها الطبيعية، أي خاصة </ م>، في خط الأشجار في المناطق الجبلية العالية. حلقات ضيقة للغاية متكررة ويصعب كشف ظاهريا (الشكل 3). في الحالات القصوى، وحلقات تتكون من واحد أو صفين من الخلايا earlywood وصف واحد من خلايا latewood بالارض، والتي تفتقر (على النقيض من الخلايا latewood المشتركة) جدران الخلايا سميكة. لهذا هم أفضل أو حتى مرئية فقط عند استخدام المقاطع الصغيرة. وعلاوة على ذلك، وتقلبات الكثافة يمكن أن تكون متباينة من الحدود حلقة أكثر وضوحا، الذي يبسط الكشف عن حلقات سنوية خاصة في منطقة البحر الأبيض المتوسط ​​والمناطق المدارية (الشكل 3).

عند تحليل الصور في التكبير من 40X أو أعلى، خلايا مفردة مرئية وسمك جدران الخلايا الخاصة هو أيضا قابل للكشف. برامج التحليل شبه التلقائي يمكن قياس معايير محددة على طول مسارات محددة بعد اتجاه التنمية الزمانية والمكانية الخاصة بهم (الشكل 4). مع هذا، تشانيمكن تحديد غيس من المعلمات واحدة مثل التجويف الخلية أو سمك جدار الخلية على مدى كامل من حلقة السنوية (الشكل 4). ويمكن القيام بذلك لجميع حلقات مرئية داخل الصورة وهذا يؤيد تماما الحاجة إلى تحليل السلاسل الزمنية الممتدة.

ويمكن أيضا أن تستخدم التحليلات الصورة لتحديد المراحل التنموية من الحلقات السنوية خلال الفترة الغطاء النباتي (الشكل 5). عند تحليل صورة لمقطع ملطخة Safranin وأسترا الأزرق باستخدام الضوء المستقطب، وحتى مراحل مختلفة من lignification، بدءا من الزوايا الخارجية من جدران الخلايا حتى lignification الكامل للجدار الخلية الثانوي، تصبح مرئية. وذلك لأن الجدران lignified (الناضجة) خلية تألق حتى في الضوء المستقطب (الشكل 5). يمكن أن تكون ذات صلة معلومات مفصلة إلى البيانات البيئية الموثقة للفترة الغطاء النباتي المعنية لتحديد على سبيل المثال relati أكثر تفصيلا النمو المناخ onship.

الشكل 1. أمثلة من قسم الصغيرة وسطح الطائرة استعداد بلوط بما في ذلك حلقة العرض وقياسات حجم السفينة اليسار:. الأبعد جزءا من جوهر البلوط الزيادة. تم قطع 5 مم الأساسية باستخدام مشراح الأساسية. كانت ملطخة السطح ثم الأسود باستخدام علامة شعر وامتلأت الخلايا مع الطباشير الأبيض بعد كانت وصمة عار الجافة. اليمين: في الرسم البياني يتم تشير حلقة العرض وحجم السفينة القياسات القيام به على سطح الأساسية التي تظهر على اليسار. وهناك حاجة إلى أقسام صغيرة للقيام بهذه القياسات يرجع ذلك إلى السطح واضحا التي أنشأتها مشراح الأساسية (المعدلة بعد ^21). أسفل: قسم مايكرو قطع نواة الزيادة، ملون، المجففة والثابتة في كندا البلسم. سمك: 20 ميكرون، الطول: 25 سم. ز "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. صور من أقسام الصغرى قطع دون الاستقرار مقابل خفض القسم باستخدام محلول نشا الذرة اليسار: قسم مايكرو تظهر قطع التحف في tracheids earlywood من الصنوبرية. تم قطع عينة من دون تضمين ونتيجة لذلك تم تقسيم الجدران الثانوية رقيقة بدلا من الخلايا earlywood قبالة الجدار الرئيسي (الأسهم الزرقاء). اليمين: مايكرو القسم دون أي القطع الأثرية في tracheids earlywood من الصنوبرية. تم قطع هذا القسم (نفس العينة كما هو موضح على اليسار) بعد تطبيق الحل نشا الذرة مع فرشاة على أعلى من سطح العينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
. الشكل 3. أمثلة على الحدود حلقة السنوية بالكاد يمكن اكتشافها اليسار: قسم مايكرو لالأساسية زيادة (هنا: أرزية أوروبية) تبين حدود عصابة (السهم الأسود) يدل على صف واحد من خلايا latewood بالارض دون أي سماكة في جدران الخلايا. وهذا من شأنه حلقة لا تكون مرئية ظاهريا. اليمين: تقلبات الكثافة البينية السنوية (السهم الأبيض) شائعة في الأنواع البحر الأبيض المتوسط ​​(القسم الصغير: سنديان أخضر). التغيير التدريجي لهيكل الخلية نحو latewood والعودة إلى هيكل earlywood (السهم الأبيض) يسمح للتمييز تقلبات الكثافة من الحدود عصابة حقيقية (السهم الأسود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

هين صفحة = "دائما">
الشكل 4. رسم توضيحي لمنطقة التجويف وقياسات سمك الجدار داخل حلقة السنوية لالصنوبرية الأعلى: خفض التدريجي صورة تظهر على النتائج المثالية للتحليل ROXAS في الدائري شجرة sylvestris صنوبر (صنوبر بري). وتظهر الحدود حلقة باللون الأصفر والخطوط العريضة للقصيبة لومينا في السماوي. لملف شعاعي واحد (الأزرق قصيبة لومينا) ويمثل قياس سمك جدار الخلية من قبل الدوائر الحمراء. شريط نطاق وأسود = 100 ميكرون. أسفل: التغييرات داخل السنوية في قصيبة منطقة التجويف وسمك قصيبة الجدار الخلوي للحلقة السنوية بالكامل يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. الامثله(ه) من حلقة السنوية تشكيل. وقد تم التقاط الصورة تحت المجهر الضوئي مع الضوء المستقطب من الملون المقطع الصغير Safranin وأسترا الأزرق تم الحصول عليها من نواة الصغيرة عينات في 7 يوليو ^{الجاري،} 2007 من الساقط الأرزن نموا في Lötschental في 1،300 متر فوق مستوى سطح البحر. في هذا القسم الصغير الخلايا متعلق بالصرف المالي، والخلايا في مرحلة التوسع، والخلايا في مرحلة سماكة الجدار والخلايا الناضجة هي معترف بها. عرض عرضية من صورة يغطي ~ 1 ملم من الخشب المقطع العرضي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تحديات الاندماج الناجح والمستدام للتشريح الخشب إلى البحث dendroecological هي، بصرف النظر عن المشاكل تحليلية متعددة، ويرجع في معظمه إلى الجوانب التقنية. هذه التحديات تتراوح من نهج أخذ العينات من حيث المبدأ على إنشاء أقسام صغيرة عالية الجودة والتحليل في وقت لاحق ^(19).

للوهلة الأولى، وأخذ عينات من النوى أو حتى أقراص هو إجراء بسيط هو أن كان معروفا لسنوات عديدة الآن. هناك العديد من الأشياء التي يمكن القيام به خطأ وخطأ صغير في أخذ العينات يمكن أن يؤدي إلى مشاكل حادة خلال مراحل إعداد وتحليل لاحقة. أخطاء صغيرة مثل الحفارات التي ليست بالضبط عمودي على محور الجذعية أو باستخدام أخذ العينات الجوفية شحذ ناقص ليست قضية إذا كان الهدف من هذه الدراسة تقتصر على عصابة ذات العرض القياسات. ومع ذلك، عندما تهدف لتحليل مجهري من العينات، قد يؤدي اتجاه أخذ العينات غير صحيحة في التشوهات البصرية للجدران الخلايا، في حين أن استخدام نتائج المثاقيب حادة في الشقوق الصغيرة داخل نواة. ونتيجة لذلك، عند محاولة قطع الأجزاء الصغيرة من هذه النوى، والشرائح الرقيقة فقط ينهار ولم تعد مضمونة لإعداد كفاءة. وينطبق الشيء نفسه لأخذ العينات الصغيرة الأساسية. وهناك معلومات غير حادة يؤدي إلى ارتفاع ضغط عندما يتم التوصل إلى الناخس في الخشب الجذعية. وبناء على ذلك سيتم ضغط طبقة متعلق بالصرف المالي. الخلايا متعلق بالصرف المالي (الشكل 5) وبالتالي تقلص والتي لا يمكن تحليلها.

أخذ العينات القرص هو في الواقع أفضل استراتيجية عند تحليل الاختلافات النمو لربطها مع التغيرات البيئية. للأسف يستحيل أن تأخذ أقراص من جميع الأشجار تهدف إلى أخذ عينات لإجراء المزيد من التحليلات. ومع ذلك، وخاصة في حالة علم تحديد عمر الأشجار الاستوائية، وهناك حاجة إلى كمية معينة من الأقراص الجذعية في تركيبة مع النوى الزيادة. وتستخدم الأقراص كقاعدة لتحديد الحدود حلقة ولهذا لدعم boundarالمنشأ، تحدد على أساس تحليل النوى زيادة ^12،27،28.

وكثيرا ما تناقش إيجابيات وسلبيات الرملي مقابل قطع ^1،11،21. كما هو مذكور أعلاه، فإن أفضل إجراء يعتمد دائما على مسألة البحث والمعلمات ليتم تحليلها (العيانية أو المجهري). إذا من المتوقع تحليلات النظائر أو الكيميائية في خطوة عمل أخرى، فإنه من الأهمية بمكان أن الغبار جلخ التي أنشأتها الرملي التي قد شغل في ومينا الخليوي أكثر من العينة بأكملها، تتم إزالة بعناية من قبل كنس أو ضغط الهواء.

قطع الفروع الصغيرة هو لجميع المجهرية يحلل أنسب طريقة لتحضير العينات لإجراء المزيد من التحليلات. أولا وقبل كل شيء، هو قطع قسم من العينة، التي ثم يمكن أن تبقى دون أي تلوث لإجراء المزيد من التحليلات المحتملة. ثاني هذه الأقسام تسمح لقياسات عالية الدقة من المعلمات خلية واحدة. وعلاوة على ذلك، وتجنب تضمين مضيعة للوقتتقنية باستخدام محلول نشا الذرة ²⁶ لتحقيق الاستقرار في الخلايا هي ميزة كبيرة في باجتزاء الجزئي.

عيوب باجتزاء الصغير لا يزال حجم العينة محدود الناتجة في أوقات إعداد طويلة. لسلسلة في الوقت الحقيقي تحليلات يعود في الوقت المناسب على مدى قرون أو حتى آلاف السنين، هناك حاجة لمواصلة تطوير الأجهزة الموجودة قطع ^17،19، ولكن أيضا لمعالجة الصور وتحليل ^18. والخطوة الأولى في هذا الاتجاه هو تطوير مشراح الأساسية ^21، صنعت في البداية لقطع الأسطح طائرة على النوى (الشكل 1). وكشفت التجارب الأخيرة القدرة على خفض أقسام صغيرة من النوى بأكملها باستخدام هذا الجهاز (الشكل 1).

توفر أقسام صغيرة جودة عالية المبدأ الأساسي لتحليل الصور الفعال. أخذ الصور تحت المجهر هو إجراء شائع ^19، ولكن التحليل على نحو فعال لا يزال مهمة التي تحتاجإلى مزيد من التطوير ^17. جميع أنظمة تحليل الصور الموجودة هي شبه التلقائي، أي أنها تحتاج إلى أن تكون أكثر أو أقل تسيطر بشكل مكثف من قبل فني. في كثير من الحالات، تحتاج إلى تصحيح الصور او حتى صور جديدة يتعين القيام به لتعزيز النقيض لتسجيل أفضل للهياكل من قبل البرنامج دون تغيير سماكة جدار الخلية داخل الصورة.

المتخصصة أدوات تحليل الصور مثل ROXAS ^18، WinCell أو البرامج النصية محددة ليماغيج ²⁹ قادرة على توفير البيانات التشريحية الأساسية مثل عدد الخلايا، والبعد الخلية، وسمك جدار الخلية وموقف خلية داخل الحلبة السنوية. ويمكن حساب العديد من المقاييس التشريحية إضافية ذات الصلة في سياق dendroecological من هذه القياسات الأساسية مثل حجم من أكبر قنوات، حجم التوزيع من خطوط الأنابيب، وحجم earlywood أو الصف الأول من خطوط الأنابيب، (البصرية) كثافة الخشب، داخل السنوية لمحات من حجم القناة وجدار الخليةسمك، وأنماط التجمع من خطوط الأنابيب (الانفرادي، مضاعفات، وما إلى ذلك).

باستخدام برنامج ROXAS ^18، يتم التعرف تلقائيا على الخطوط العريضة لومينا قناة (أي خلية إجراء الماء) والحدود حلقة السنوية ويمثل بصريا كما تراكب فوق الصورة الأصلية. تستند خوارزميات الكشف عن قنوات على لون وحجم وشكل المعلومات، خوارزميات الكشف عن حدود الطوق على السياق المحلي لكل قناة. مجموعة أدوات تسمح لنا لتحسين هذه النتائج يدويا عن طريق تحرير مباشرة الميزات تراكب، أي حذف، إضافة وتعديل الحدود حلقة ويحدد القناة. بعد التحرير، وإخراج البيانات النهائية، بما في ذلك سمك جدار الخلية (الصنوبريات)، يتم إنشاؤها تلقائيا وحفظها في جدول بيانات. أنظمة مؤتمتة بالكامل هي حاليا غير متوفرة، ولا حتى لالصنوبريات تظهر بنية بسيطة نسبيا، ولكن هذا هو هدف للتطورات المستقبلية. وهذا من شأنه أن تدعم بقوة فوالتكامل ليرة لبنانية من الخشب المعلمات التشريحية في السلاسل الزمنية ويحلل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Increment corer			http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en
Core-Microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Laboratory microtome			http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN
Trephor micro corer			http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp
Nawashin solution			Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid
Picric-Anilin blue			One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol
Safranin			Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4
Astra-blue			Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3
Ethanol			Linear Formula CH3CH2OH
Xylol (Xylene)			Linear Formula C6H4(CH3)2
Canada Balsam			Embedding solution for microscopy
Roxas Software			http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN
ImageJ Software			http://imagej.nih.gov/ij/
WinCell			http://imagej.nih.gov/ij/