JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Abstract

لتحسين فعالية العلاجية لزرع الخلايا، وقد تم تطوير نظام زرع المعدلة وراثيا، الكروية عن طريق الحقن. يتم إعداد الكروية خلية في نظام الثقافة على لوحات micropatterned المغلفة مع البوليمر للحرارة. يتم تشكيل عدد من الكروية على لوحات، والمقابلة لمناطق التصاق الخلية من 100 ميكرون قطر التي تصطف بانتظام بطريقة ثنائية الأبعاد التي تحيط بها مناطق غير لاصقة التي المغلفة من قبل غليكول البولي ايثيلين (PEG) المصفوفة. الأجسام الشبه الكروية يمكن استردادها بسهولة كما وقف السائل عن طريق خفض درجة حرارة لوحات، وكذلك صيانة بنيتها عن طريق تمرير من خلال إبر الحقن من عيار كبير بما فيه الكفاية (أكثر من 27 G). ويتحقق التعديل الوراثي قبل ترنسفكأيشن الجينات باستخدام الناقل الأصلي غير الفيروسية الجين، nanomicelle polyplex، وهو قادر على إدخال الجينات إلى الخلايا دون تعطيل هيكل كروي. لمتزمتالكروية الكبدية آرى مع transfected الجين، معربا عن luciferase المراسل، يتم الحصول على luciferase المراسل مستدام في الحيوانات المزروعة، جنبا إلى جنب مع الحفاظ على وظيفة خلايا الكبد، كما يتضح من التعبير الألبومين. هذا النظام يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الجذعية الوسيطة.

Introduction

وقد اجتذب العلاج زرع الخلايا باهتمام واسع لعلاج العديد من الأمراض المستعصية. النشاط ونصف العمر من العوامل الحيوية النشطة التي تفرزها الخلايا المزروعة ضرورية لتحسين الفعالية العلاجية للنظام زرع الخلايا. التعديل الوراثي للخلايا قبل الزرع هو تقنية مفيدة لتنظيم والتلاعب الوظائف الخلوية، بما في ذلك إفراز العوامل النشطة بيولوجيا. ومن المهم أيضا للحفاظ على المكروية مواتية للخلايا لتجنب موت الخلايا أو فقدان نشاط الخلايا. ثلاثي الأبعاد الثقافة (3D) خلية كروي، والتي الخلية الى خلية التفاعلات يتم الحفاظ عليها بشكل جيد، واعد لهذا الغرض، على سبيل المثال، لتحسين إفراز الزلال من خلايا الكبد الأولية وتعزيز متعددة النسب تمايز من الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة ) 1-7.

في هذه الدراسة، وهو نظام تركيبة جديدة من spheroiيستخدم الثقافة د وترنسفكأيشن الجينات لتكون بمثابة منصة لزرع الخلايا المعدلة وراثيا. لخلق خلايا كروي، يتم استخدام نظام الثقافة كروي على لوحات ثقافة micropatterned. في هذه اللوحات، والمحتشدة المناطق التصاق الخلية من 100 ميكرون قطر بانتظام بطريقة ثنائية الأبعاد، وتحيط بها مناطق غير لاصقة المغلفة من قبل مصفوفة PEG 3. قبل البذر وجود عدد كاف من الخلايا، وتشكل صفائف الكروية 3D من 100 ميكرون في القطر المقابلة للسرير الثقافة micropatterned.

واستعاد الكروية دون تعطيل هيكلها 3D باستخدام حساس للحرارة لوحات لزراعة الخلايا، التي تم المغلفة مع البوليمر للحرارة، وبولي (ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) 10/08. هي التي شيدت بنية micropatterned على لوحات للحرارة (مبنية خصيصا). ببساطة عن طريق خفض درجة حرارة لوحات، ويتم فصل الكروية من السرير الثقافة وتفريقد في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). وبالتالي، يمكن الحصول على عدد كبير من الأجسام الشبه الكروية مع حجم موحد من 100 ميكرون في شكل تعليق عن طريق الحقن.

figure-introduction-1949
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للنظام الثقافة كروي على طبق من ذهب micropatterned. ويتحقق التعديل الوراثي قبل ترنسفكأيشن الجينات باستخدام الناقل الجيني غير الفيروسي الأصلي، nanomicelle polyplex. وهو يتألف من البلازميد الحمض النووي (PDNA) والبولي ايثيلين جلايكول (PEG) بوليمرات كتلة -polycation 11. هذه لديها بنية الأساسية قذيفة مميزة تتكون من قذيفة PEG والنواة الداخلية للPDNA المكثف، مما يسمح آمنة وفعالة إدخال الجينات إلى داخل الخلايا لأغراض علاجية (11). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من ثيالصورة الرقم.

figure-introduction-2762
الشكل 2. هيكل nanomicelle polyplex التي شكلتها مجمع الأحماض النووية وبوليمرات كتلة PEG-كتلة polycation. في هذه الدراسة، والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن هيكل كروي لا تتعطل خلال ترنسفكأيشن الجينات التي nanomicelles. بعد transfections بوساطة nanomicelle من الفئران الكروية الكبدية الأولية، ويتم الحصول على فترات طويلة التعبير التحوير لأكثر من شهر مع إفراز الزلال المستمر من خلايا الكبد في مستوى مماثل لتلك التي الكروية untransfected 12. يتم الاحتفاظ أيضا التعبير التحوير وإفراز الزلال من الكروية بعد الشفاء من لوحات للحرارة. ومن الواضح أن nanomicelles يمكن أن تسهل بأمان إدخال الجين دون أن ينال من وظائف الفطرية من التهاب الكبدatocytes. وبالتالي، فإن الجمع بين خلايا كروي مثقف على لوحات micropatterned للحرارة مع إدخال الجينات باستخدام nanomicelles هو منصة واعدة لزرع الخلايا المعدلة وراثيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت جميع الدراسات الحيوانية بموافقة لجنة رعاية الحيوان واستخدام من جامعة طوكيو، طوكيو، اليابان.

1. خلية التحضير

  1. لخلايا الكبد الأولية، واتباع بروتوكول لالكبدية بمعزل عن الفئران عن طريق تعديل خطوتين عملية الهضم كولاجيناز 13،14.
    1. تخدير سبراغ داولي (SD) الفئران (ذكور، 5 أسابيع من العمر) تحت التخدير استنشاق مع isoflurane. وضع فأر في غرفة متصلة آلة التخدير لتوفير الأيزوفلورين للغرفة. إخراج الفئران بعد النوم، ووضعه على طاولة العمليات مع التهوية باستخدام قناع. السيطرة على الأيزوفلورين تدفق ما يقرب من في 0،4-0،7 لتر / دقيقة عن طريق التحقق من شروط الفئران. يروي الكبد من سبراج داولي (SD) الفئران (ذكور، 5 أسابيع من العمر) من الوريد البابي الكبدي بمحلول خاص مكون من 8 جرام / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، و 400 ملغم / لتر كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، 78 ملغ / Lالصوديوم ثنائي الهيدرات فوسفات هيدروجين (ناه 2 PO 4 · 2H 2 O)، و 151 ملغم / لتر ثنائي dodecahydrate فوسفات الهيدروجين (نا 2 هبو 4 · 12H 2 O)، 2.38 غ / L 2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1 -piperazinyl] حامض ethanesulfonic (HEPES)، 190 ملغ / L جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic (EGTA)، و 350 ملغم / لتر كربونات الصوديوم الهيدروجينية (NaHCO 3)، و 900 ملغ / L الجلوكوز.
    2. تعميم حل كولاجيناز عن طريق الكبد.
      ملاحظة: يتكون الحل من 500 ملغ / L كولاجيناز، 9.8 جم / الملح L هانك مخزنة، 2.38 جم / مل HEPES، 556 ملغ / مل كلوريد الكالسيوم هيدرات (CaCl 2 · H 2 O)، و 350 ملغ / L NaHCO 3، و 50 ملغ / L مثبط التربسين، مع درجة الحموضة تعديلها إلى 7.2.
    3. إزالة الكبد بعناية، واللحم المفروم برفق على طبق باستخدام شفرة مشرط، إضافة Dulbecco لتعديل متوسطة النسر (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، وتصفية تعليق الخلية من خلال 100 ميكرونشبكة من النايلون. لإزالة الحطام إضافي، الطرد المركزي تعليق خلية في 20 × ز لمدة 1 دقيقة. في هذه الخطوة، خلايا الكبد هي في طاف.
    4. كرر الخطوة الطرد المركزي مرتين (أي ما مجموعه ثلاثة centrifugations). أخيرا، الطرد المركزي الخلايا الكبدية في 50 × ز لمدة 3 دقائق لاستعادة لهم في شكل بيليه.
    5. اعادة تعليق الخلايا الكبدية إلى تركيز 4 × 10 5 خلية / مل في مستنبت خاص يتألف من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS، 1٪ القلم بكتيريا-تخمة (PSQ)، 1٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 0.1 ميكرومول / L ديكساميثازون، و 0.5 ميكروغرام / مل الأنسولين، 10 مليمول / لتر نيكوتيناميد، 0.2 مليمول / لتر أسكوربات فسفرته (ASC-2P)، و 10 نانوغرام / مل عامل النمو البشري البشرة (hEGF) 15. هذه الوسيلة خاص إلزامي للحفاظ على وظائف الكبد في ظل ظروف في المختبر.
  2. للحصول على اللجان الدائمة الفئران، الموت ببطء سبراغ داولي (SD) الفئران (ذكور، 5 أسابيع من العمر) من قبل إدارة مفرطة من isoflurانو. بتر في عظام الفخذ وtibias، وجمع الكوسا العظام عن طريق إدخال 22 G الإبرة في رمح من العظام لطرد بها مع 10 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS. جمع الخلايا عن طريق الترشيح من خلال 100 ميكرون شبكة من النايلون.
  3. البذور الخلايا على أطباق 10 سم ثقافة استخدام DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. للتجارب كروي، استخدم اللجان الدائمة في 5 مقاطع.

2. إعداد 3D الأجسام الشبه الكروية خلية

  1. تجاريا الحصول على لوحات ثقافة micropatterned، التي تصطف المناطق خلية لاصقة بانتظام في 100 ميكرون قطرها بطريقة ثنائية الأبعاد، وتحيط بها مناطق غير لاصقة المغلفة من قبل مصفوفة PEG.
    ملاحظة: للحصول على زرع الخلايا، طلاء إضافي مع البوليمر PIPAAm للحرارة ضروري للسماح للانفصال الخلايا عن طريق التبريد لوحات (راجع الخطوة 5.1). يمكن أن التقلبات في درجات الحرارة تحدث تغييرات في كيمياء البوليمرات هذا8-10. في 37 ° C، PIPAAm هو مسعور قليلا، مما يسمح للخلايا ليتم تربيتها في ظل ظروف طبيعية. انخفاض في درجة حرارة أقل من 32 ° C النتائج في ترطيب السريع من البوليمر، مما أدى إلى انفصال عفوية من الخلايا.
  2. البذور خلايا الكبد أو اللجان الدائمة على لوحات 12-جيدا micropatterned في كثافة 4 × 10 5 خلايا / جيد andincubate لهم عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2. الخلايا سوف تتراكم في مناطق التصاق micropatterned وتشكل تدريجيا الكروية مستديرة في 2 يوما.
    ملاحظة: لإعداد الخلايا السيطرة في ثقافة أحادي الطبقة، استخدم العادية لوحات 12-جيدا والبذور الخلايا في كثافة مماثلة، وذلك بعد إجراء مماثل كما هو موضح أعلاه.

3. إعداد Polyplex Nanomicelles

  1. توليف كوبوليمر كتلة، PEG-PASP (ديت) (بولي [N '- [N - (2-aminoethyl) -2-aminoethyl] aspartamide]) (PEG ميغاواط = 12،000، درجة البلمرة (DP) من PASP (ديت) الجزء = 59)، والمبلمر المتجانس الذي يتكون من فقط الجزء الموجبة [PASP (ديت)] (DP = 55)، وفقا للإجراءات التي سبق وصفها من قبل المؤلفين 11، 16، 17.
  2. يعد حل المختلط للPEG-PASP (ديت) كتلة من البوليمرات وPASP (ديت) المبلمر المتجانس في نسبة المولي متساوية من المجموعات الأمينية المتبقية في 10 ملي HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.3) عن طريق ضبط تركيز البوليمر إلى 33.3 ميكروغرام / مل و 19.1 ميكروغرام / مل على التوالي.
    ملاحظة: تركيزات البوليمر المذكورة أعلاه هي القيم التمثيلية لإعداد nanomicelles مع نسبة المتبقية المولي من إجمالي المجموعات الأمينية في البوليمرات اثنين إلى مجموعات الفوسفات في PDNA (N / نسبة P) 10. إن نسبة N / P يمكن أن تختلف اعتمادا على نوع من الخلايا والغرض (لمزيد من التفاصيل، انظر مناقشة). الجمع بين استخدام البوليمرات اثنين يمكن أن يحقق كلا فعالية التدريع PEG وعمل PASP (ديت) لتعزيز endosomalالهروب (لمزيد من التفاصيل، انظر مناقشة) 18.
  3. إعداد ترميز PDNA Gaussia luciferase المراسل، GL4 luciferase المراسل، أو الإريثروبويتين عن طريق الاستنساخ قطاع التعبير عن الجينات المعنية في البلازميد pCAG-GS (http://www.cdb.riken.jp/pcs/protocol/vector/map/m36.html ) للحصول على التعبير تحت CAG المروج / محسن باستخدام طقم التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تضخيم PDNA في سلالة القولونية المختصة وتطهيره باستخدام البلازميد نظام تنقية DNA خالية من الذيفان الداخلي. تحديد تركيز PDNA في أحد الامتصاصية من 260 نانومتر للحصول على حل / مل 150 ميكروغرام في 10 ملي HEPES العازلة (درجة الحموضة 7.3).
  4. لإعداد nanomicelles polyplex، مزيج دقيق الحل PDNA (150 ميكروغرام / مل في 10 ملي HEPES عازلة) والحل الممزوجة مسبقا من البوليمرات اثنين على نسبة 2: 1 (من حيث الحجم).

4. الجينات ترنسفكأيشن إلى الأجسام الشبه الكروية

  1. احتضان الخلايا (خلايا الكبدأو اللجان الدائمة) لمدة 72 ساعة بعد البذر على لوحات micropatterned للسماح لتشكيل الأجسام الشبه الكروية الناضجة. لترنسفكأيشن الجينات، إضافة 100 ميكرولتر من محلول polyplex nanomicelle (تحتوي على 10 ميكروغرام من PDNA) إلى كل بئر بعد استبدال مستنبت مع 1 مل من المتوسط ​​الطازجة. الاستمرار في الحضانة مع الحل nanomicelle لمدة 24 ساعة.
  2. لعنصر تحكم باستخدام كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس، وخلط الحلول PDNA مع كاشف على نسبة الوزن كاشف / PDNA 3. ضبط الجرعة النهائية من PDNA لتكون مساوية لكل من كاشف القائم على الدهون وطرق nanomicelle.

5. الإنعاش وزرع خلية الأجسام الشبه الكروية

  1. استبدال مستنبت مع 200 ميكرولتر من PBS المبردة ووضع لوحات على الجليد.
    ملاحظة: عموما، يمكن للالكروية فصل في حوالي 15 دقيقة، ويمكن استردادها في شكل تعليق للزرع.
  2. بلطف نضح الخلايا في ميكرولتر 200تعليق باستخدام حقنة مع 23 G أو 27 G إبرة لحقن في الجسم الحي.

6. تقييم التعبير التحوير

  1. لفي التقييم في المختبر للتعبير عن Gaussia luciferase المراسل يفرز في مستنبت، وجمع 50-100 ميكرولتر من المتوسطة بدقة 24 ساعة بعد استبدال مع المتوسط ​​الطازجة. تقدير التعبير luciferase المراسل باستخدام نظام فحص renilla luciferase المراسل التجاري وluminometer وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لا يزال luciferase المراسل Gaussia مستقر في مستنبت لأكثر من أسبوع. وبالتالي، لتقييم الكفاءة في الوقت الحقيقي من التعبير التحوير، استبدل المتوسطة مع واحدة جديدة قبل جمع العينة المتوسطة. توقيت التغيير المتوسط ​​يمكن أن تكون مرنة.
  2. لتقييم المجراة من التعبير التحوير في الحيوانات المضيفة بعد زرع الخلايا، تخدير BALB / ج الفئران عارية (أنثى؛ 7 أسابيعالعمر) تحت التخدير استنشاق مع isoflurane.
    1. ضع الماوس في غرفة متصلة آلة التخدير لتوفير الأيزوفلورين للغرفة. اخراج الماوس بعد النوم، ووضعه على طاولة العمليات مع التهوية باستخدام قناع. السيطرة على الأيزوفلورين تدفق ما يقرب من في 0،2-0،5 لتر / دقيقة عن طريق التحقق من شروط الماوس.
    2. ضخ 200 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تحتوي الكروية مع transfected في GL4 PDNA، معربا عن luciferase المراسل (كما هو موضح في 4.1) في الأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن.
    3. مباشرة بعد حقن D-وسيفيرين (150 ملغ / كغ، طريق الوريد)، وقياس التعبير luciferase المراسل باستخدام نظام التصوير IVIS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. لتقييم الآثار العلاجية لزرع الخلايا، وضخ 200 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تحتوي الكروية مع transfected في PDNA ترميز الإريثروبويتين فيالأنسجة تحت الجلد في منطقة البطن.
    1. جمع عينات الدم عن طريق النزيف تحت الفك السفلي للحصول على ما يقرب من 200 ميكرولتر من الدم 19. قياس الهيموجلوبين والهيماتوكريت باستخدام محلل عينة الدم.
      ملاحظة: يتم تنظيم عدد الخلايا للزرع من قبل عدد المصنفة على لوحات. لسوء الحظ، فإنه من الصعب تحديد عدد الخلايا المحدد لأن عدد داخل الكروية لا يمكن قياسها.
  4. بعد عدة تجارب، ضع الفئران على وسادة التدفئة على اتصال مع وحدة تحكم في درجة الحرارة حتى الصحوة من التخدير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم إجراء الجينات ترنسفكأيشن من Gaussia، معربا عن luciferase المراسل PDNA في الكروية التي شكلتها خلايا الكبد أو اللجان الدائمة باستخدام nanomicelles polyplex أو كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس السيطرة على 12. وnanomicelles يسببها أي تغيير تقريبا في هيكل كروي مقارنة مع الكروية غير transfected ع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان للحفاظ على هيكل 3D من الكروية خلال خطوات إدخال الجينات والانتعاش كروي. فمن الضروري للحفاظ على microenvironments مواتية للخلايا لتجنب موت الخلايا أو فقدان نشاط الخلايا. على سبيل المثال، إفراز الألبومين، وهي وظيفة الفطرية التمثيلية لخلايا ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

نحن نقدر بعمق الدكتور تاكيشي Ikeya والموظفين التقنيين في شركة تويو جوسي، طوكيو، اليابان لتقديم لوحات ثقافة micropatterned للحرارة فضلا عن تقديم المشورة العلمية. كما نشكر السيدة ساتومي اوغورا، السيدة ساي سوزوكي، السيدة اسوكا ميوشي والسيدة Katsue Morii للمساعدة التقنية مع التجارب على الحيوانات. وأيد هذا العمل ماليا في جزء من JSPS KAKENHI غرانت في والمعونة من أجل البحث العلمي، ومركز الابتكار (هيئة النزاهة) برنامج وبرنامج الابتكار S- من وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابان (JST)، وJSPS الحدقة إلى النواة البرنامج، A. شبكات البحوث المتقدمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Pen-Strep-GlutGIBCO
DexamethasoneWako Pure Chemical Industries041-18861
NicotinamideWako Pure Chemical Industries141-01202
Hank’s buffered salt and L-ascorbic acid 2-phosphate (Asc-2P)Sigma-AldrichA8960
Human epidermal growth factor (hEGF)ToyoboPT10015
Cell-able multi-well platesToyo GoseiPP-12
Thermosensitive cell culture plates (Upcell)CellSeed IncThe micropatterned architecture is constructed on the thermosensitive plates (custom-built by Toyo Gosei)
Lipid-based transfection reagent (FuGENE HD)PromegaE2311
Renilla Luciferase Assay SystemPromegaE2810
pGL4 Luciferase Reporter VectorPromegaE6651
pDNA expressing Gaussia luciferaseNew England BioLabsN8082S
Mouse erhthropoietin-expressing vectorOrigeneMC208445
pCAG-GSKindly provided by Laboratory for Pluripotent Cell Studies, Center for Developmental Biology, RIKEN
Escherichia coli DH5α competent cellsTakara9057
Endotoxin-free plasmid DNA purification systemNippon GeneticsNucleoBond Xtra EF
CollagenaseWako Pure Chemical Industries639-00951
Trypsin inhibitorGIBCOR-007-100
LuminometerPromegaGloMax™ 96 Microplate Luminometer
IVIS Imaging SystemXenogen Corp.Xenogen IVIS Spectrum in vivo imaging system
Blood sample analyzerSysmexpocH-100i Automated Hematology Analyzer

References

  1. Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
  2. Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A. Importance of cell aggregation for expression of liver functions and regeneration demonstrated with primary cultured hepatocytes. J Cell Physiol. 156 (3), 522-530 (1993).
  3. Otsuka, H., et al. Two-dimensional multiarray formation of hepatocyte spheroids on a microfabricated PEG-brush surface. Chembiochem. 5 (6), 850-855 (2004).
  4. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  5. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  6. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  7. Nakasone, Y., Yamamoto, M., Tateishi, T., Otsuka, H. Hepatocyte spheroids underlayered with nonparenchymal cells for biomedical applications. IEICE Transactions on Electronics. E94, 176-180 (2011).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Ohashi, K., et al. Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets. Nat Med. 13 (7), 880-885 (2007).
  10. Sekine, H., et al. Cardiac cell sheet transplantation improves damaged heart function via superior cell survival in comparison with dissociated cell injection. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  11. Itaka, K., Kataoka, K. Progress and prospects of polyplex nanomicelles for plasmid DNA delivery. Curr Gene Ther. 11 (6), 457-465 (2011).
  12. Endo, T., Itaka, K., Shioyama, M., Uchida, S., Kataoka, K. Gene transfection to spheroid culture system on micropatterned culture plate by polyplex nanomicelle: a novel platform of genetically-modified cell transplantation. Drug Deliv and Transl Res. 2 (5), 398-405 (2012).
  13. Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
  14. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).
  15. Tateno, C., Yoshizato, K. Long-term cultivation of adult rat hepatocytes that undergo multiple cell divisions and express normal parenchymal phenotypes. Am J Pathol. 148 (2), 383-392 (1996).
  16. Kanayama, N., et al. A PEG-based biocompatible block catiomer with high buffering capacity for the construction of polyplex micelles showing efficient gene transfer toward primary cells. ChemMedChem. 1 (4), 439-444 (2006).
  17. Itaka, K., Ishii, T., Hasegawa, Y., Kataoka, K. Biodegradable polyamino acid-based polycations as safe and effective gene carrier minimizing cumulative toxicity. Biomaterials. 31 (13), 3707-3714 (2010).
  18. Uchida, S., et al. PEGylated Polyplex With Optimized PEG Shielding Enhances Gene Introduction in Lungs by Minimizing Inflammatory Responses. Mol Ther. 20 (6), 1196-1203 (2012).
  19. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34, 39-43 (2005).
  20. Uchida, S., et al. An injectable spheroid system with genetic modification for cell transplantation therapy. Biomaterials. 35 (8), 2499-2506 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

101 Micropatterned

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved