في حقن الرحم البينية القلب الطماطم كتين على أجنة الفئران لقياس تدفق الدم الكلوي

Summary

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Abstract

ودراسة سلوكه إلى حد كبير في تشكيل ونضح تطوير الأوعية الدموية الكلوية (بصرف النظر عن الكبيبات). ومع تطور الأوعية الدموية عبر الأوعية الدموية (والذي هو المتفرعة الخروج من السفن الكبرى) وتكون الأوعية (دي نوفو تشكيل السفينة)، تم تقنيات رسم الخرائط نضح مثل يلقي الراتنج، في الجسم الحي التصوير بالموجات فوق الصوتية، والصغرى تشريح محدودة في مما يدل على العلاقات الحميمة بين هاتين العمليتين والهياكل الكلى النامية في الجنين. هنا، نحن تصف إجراءات في الرحم داخل القلب الموجهة بالأمواج فوق الصوتية-FITC المسمى الطماطم إبر دقيقة جدا كتين على أجنة الفئران لقياس مدى تطور الجنين من نضح الكلوي. تم perfused لكتين الطماطم (TL) في جميع أنحاء الجنين والكلى المقطوع. وقد شارك في الأنسجة الملون لمختلف الهياكل الكلى بما في ذلك: الأسلاف نفرون، والهياكل كليون، الحالبي ظهارة، والأوعية الدموية. ابتداء من الساعة E13.5 السفن ذات عيار كبير وperfused ل، ومع ذلك المحيطيوظلت السفن unperfused. قبل E15.5 وE17.5، بدأت السفن المحيطية الصغيرة وكذلك الكبيبات لتصبح perfused ل. هذه التقنية التجريبية أمر بالغ الأهمية لدراسة دور الأوعية الدموية وتدفق الدم أثناء التطور الجنيني.

Introduction

أثناء التطور الجنيني تأخذ اثنين منفصلة، ​​ولكن في وقت واحد، وعمليات الأوعية الدموية المكان: الأوعية الدموية، العملية التي تنمو سفينة من رئيسي موجودة من قبل السفينة، وتكون الأوعية، وهو تشكيل من جديد من السفن من الأسلاف البطانية السكنية ^1،2. على التوالي، والسابق هو مرادف مع تدفق الدم، في حين يعتقد هذا الأخير أن يأخذ مكان إلى حد كبير في غياب ذلك.

في وقت واحد لتشكيل الأوعية الدموية، عملية دورية وديناميكية من التوليف السلف الكلى خلية، والانتشار، والتمايز تبدأ تتكشف في يوم الجنينية 9.5 (E9.5). في هذه المرحلة مهدها الحالبي (UB) يغزو ظهريا إلى المحيطة اللحمة المتوسطة الكلوة التالية (MM)، ويستمر حتى الولادة ^3. كرر المتفرعة من UB إلى التكثيف بسرعة الكلوة التالية سقف اللحمة المتوسطة يبدأ تشكيل وحدات وظيفية في الكلى، وكليون. مع كل جيل جديد من UB وnephرون، وتشرد الأجيال الأكبر سنا في المناطق القشرية والنخاعية الداخلية، حيث ثم الخضوع لمزيد من النضج والتمايز داخل البيئات في المقام الأول الأوعية الدموية-الكثيفة. كما يتضح من دريسلر وآخرون. ^3، وعجلت هذه العملية الجنينية التي كتبها إشارات الاستقرائي، مثل الحديث المتبادل بين UB وMM، وعدد لا يحصى من العوامل خارج الخلية ^3-6. عاملين خارج الخلية التحقيق مؤخرا داخل البنكرياس النامية والكلى وتشمل توتر الأكسجين وتدفق الدم ^7،8. وسيتم مناقشة هذا الأخير في مزيد من التفاصيل أدناه مع يتعلق بالتنمية الكلى.

من أجل فضح دور الاستقرائي أن تدفق الدم يلعب يحتمل أن تكون في كليون السلف تمايز الخلايا، وكذلك في عمليات توالد الأعضاء الأخرى، وأساليب محددة ودقيقة لرسم الخرائط الجنينية تدفق الدم أمر حتمي.

طرق بديلة لقياس تدفق الدم وتشمل وصفة طبية من المجاهدينالتصوير trasound والراتنج يلقي ^9،10. قاطع، وقد ثبت هذه الأوضاع أن هناك نقصا بطبيعتها في قدرتها على كشف بالتزامن تجاورات الزمانية والمكانية بين تدفق الدم وتمايز الخلايا الجذعية. يلقي الراتنج، وعلى سبيل المثال، تقدم نموذجا صالحا من الزخرفة سفينة داخل أنسجة البالغين، ولكن في السفن غير الناضجة، مثل مع النقاط الزمنية الجنينية، والسفن هي تعاني من التخلف الشديد وتتسرب منها المياه. ولذلك، الراتنج يلقي تفشل في عقد داخل الأوعية الصغيرة، التي يسهل اختراقها في كثير من الأحيان.

لهذه العقبات واضحة، من بين أمور أخرى، اخترنا أن تدرج في الجسم الحي داخل القلب الجنينية كتين الطماطم (TL) إبر دقيقة جدا في تحقيقاتنا التنمية الكلى الموجهة بالأمواج فوق الصوتية. في هذا الإجراء نستخدم مسبار الموجات فوق الصوتية لتوجيه متزامن إبرة ممص مكروى شنت مليئة 2.5 ميكرولتر من حل TL إلى البطين الأيسر من أجنة الفئران في نقاط E11.5، E13.5، E15.5، والوقت E17.5. E17.5 هو أحدث سن التنموي مثل الإبر ليست قوية بما فيه الكفاية لاختراق الجنين أكثر تطورا.

مزايا هذه الطريقة حقن مكروي وفيرة. الموجهة بالأمواج فوق الصوتية حقن مكروي يسمح تحديد المواقع بدقة من إبرة الحقن داخل البطين الأيسر الجنينية، طرد السلبي ورقابة من حل في القلب النابض للحيوان، والضرر الحد الأدنى من القلب والأنسجة المحيطة بها، وتجنب الفشل القلبي المفاجئ وفاة الجنين قبل التروية كامل الجسم. مع استخدام TL FITC المسمى، فإن أي الأوعية الدموية perfused لتحافظ على علامة على طول الغشاء القمي البطانية. في تركيبة مع المناعية، وذلك باستخدام PECAM (CD31، صفائح الدم البطانية جزيء التصاق الخلية) ومختلف علامات الأوعية الدموية الأخرى، ونحن قادرون على التمييز بوضوح بين السفن perfused لوالامم المتحدة وperfused ل، فضلا عن تميز أي تلطيخ الشاذة من الأنسجة المحيطة بها.

Protocol

ملاحظة: جامعة بيتسبرغ المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وافقت جميع التجارب.

1. إعداد الأدوات الموجات فوق الصوتية-حقن مكروي والأجنة

1. انشاء المرحلة، جبل، والتحقيق (الشكل 1)، وكذلك الأدوات الجراحية (الشكل 2). مكان الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل (pH7.4) في 37 ° C حمام الاحترار. ملء حقن مكروي إبرة تماما مع الزيوت المعدنية، وذلك باستخدام 1 مل حقنة تعلق على الثانية مرن 25 G إبرة، من خلال قاعدته.
2. إصلاح إبرة على دوران جبل الذراع، وإبرة فارغة من حل الزيوت المعدنية. إعادة ملء مع 2.5 ميكرولتر من حل TL. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء موجودة داخل إبرة الحقن. تدوير الذراع الإبرة نحو الجدار، بعيدا عن خشبة المسرح.
3. تخدير الأم الحامل في غرفة التخدير عن طريق الحقن المستمر للالأيزوفلورين. عندما يتم تقديم الأم فاقد الوعي، ونقل التخدير لأنبوب الأنف المتمركزة على جالجانب audal من المسرح، والأم في مكان موقف ضعيف مع خطم في أنبوب الأنف للسماح استمرار حالة تخدير كامل.
4. أطرافه الشريط في 45 ° الزوايا، أو مع اليدين والقدمين راحة وضعه فاق ECG علامات التبويب / رصد درجة الحرارة. من المهم أن السد حامل يتم رصد مستمر لضمان التخدير غير كافية وأن مرهم في تطبيقها على العيون للحد من التجفيف.
5. تطبيق لإزالة الشعر المنتج في جميع أنحاء البطن السفلي من الأم، ويمسح برفق باتجاه آخر مع قطعة قطن جافة، وبعد ذلك مرة أخرى مع 70٪ مسحات القطن المشبعة الإيثانول لإزالة أي منتج الزائدة والشعر. ضمان لتنظيف الجلد في منطقة البطن الخروج من كل الشعر في موقع شق (الشكل 3).
6. إجراء عملية فتح البطن على الأم الحامل باستخدام ملقط ومقص جراحي غرامة. الحرص على تجنب قطع أي الأوعية الكبرى أو الأعضاء الحشوية. تأكد أولا، شق التوالي من البشرة 1.5-2 سم فوق المهبل وواصل قطع نحو الأضلاع لapproximatاعل 2-3 سم. فضح الغشاء تحت الجلد، حدد موقع ألبا الخط ("الخط الأبيض") (الشكل 3)، وقطع بالتوازي مع شق الأولي، وعلى طول طول نفس، لفضح الداخلية الأجهزة الحشوية والكييسات الرحم.

2. استخراج الأجنة

1. استخدام 6 بوصة تطبيقها القطن ذات الرؤوس للمناورة الأم والأجنة. دفع بلطف (لا قوة) على الجلد مع قضيب للتلاعب الجنين الأول من افتتاح شق. بعد استخراج أول كيس الجنين، برفق وببطء سحب ما تبقى من قرن الرحم من خلال والخارج على الأم. تجنب سحب الأمعاء أو غيرها من الأجهزة من خلال شق في هذه المرحلة.
2. تحديد الأجنة ووضع بلطف غادر قرن الرحم مرة أخرى إلى الأم. ثم يبدأ وضع الحق في الرحم القرن مرة أخرى إلى الأم بدءا من أبعد الجنين كيس من المهبل على قرن والتحرك نحو الانخفاض. يستمر هذا حتى تبقى سوى اثنين من الأجنة تتعرض (فايجوري 4). وأخيرا، الأجنة الموقف في عمود أعلاه وبالتوازي مع شق خط، ويجري تدرك لا لقطع الدورة الدموية في الرحم.
3. وضع كتل من الطين وموقف بين الأسلحة والجسم، وكذلك الساقين والذيل. تأكد من أن الأسطح الطينية هي المستوى تقريبا مع شق البطن. الرطب طبق بيتري منوفذة مع 37 ° C PBS.
4. فهم توسيع ملقط مع اليد اليمنى وطبق بيتري منوفذة مع اليد اليسرى (نوفذة بالتوازي مع الأجنة) وجلب ملقط مغلقة ~ 5 سم، من خلال نوفذة، من أعلى طبق بيتري. ملقط مفتوحة تماما دون تمزق شبكة نوفذة.
5. مناورة أيدي فوق الأجنة وتركز الأنظار على اثنين من الكييسات الجنين. دون (أو خفيفة) لمس الكييسات مع الربط بين نوفذة أو ملقط، مرر لهم من خلال شق ووضع طبق بتري على البطن الأم. مع ملقط لا يزال تمديد، والتلاعب شبكة منوفذة لمقعد على جانبي وعلى قاعدة من كل جنين (الشكل 5 ) وسحب ملقط من افتتاح الشق.
6. وبعد ذلك، وضع المطاط الأزرق تحتوي على الجدار في طبق بتري، من دون معسر أو إصابة الأجنة (الشكل 6). جعل كتل من الطين والتأكد من تحقيق التوازن بحزم طبق بيتري، الجنين، والتي تحتوي على المطاط الجدار. وأخيرا، وملء طبق بيتري مع 37 ° C PBS حتى يتم المغمورة أجنة تماما (الشكل 6)، في حين تسيطر من وجود تسرب في الربط بين منوفذ.

3. إجراء حقن

1. أقل مرحلة الحقن مع الأم والأجنة أسفل باستخدام مقبض تعديل مستوى Z (الشكل 1)، ثم تناوب حقن الإبرة وجبل الذراع ويصطف مباشرة مع مسبار الموجات فوق الصوتية، مع ½ سم الإبرة إلى اليسار وتحت تلميح التحقيق (الشكل 7) . دفع إبرة الذراع (لا إبرة) 45 درجة بعيدا عن التحقيق. يجب الحرص على عدم ضرب رأس الإبرة مع الطبق أو الموجات فوق الصوتية التحقيق.
2. رفع مرحلة الحقن يعود إلى الارتفاع الأصلي، مع الموجات فوق الصوتية صرداء مباشرة فوق الأجنة التحقيق يجب أن غمرت قليلا وضمن 3-4 ملم من الأنسجة الجنينية. استخدام X & Y المقابض التكيف المرحلة (الشكل 8) لتعديل الجنين / الأم / مرحلة يمكنها من تحديد موقع منهجي قلب الجنين الضرب.
3. مباشرة من مركز الشاشة الموجات فوق الصوتية مراقبة سوداء علامة المستهدفة مركز الانتباه (*). تحديد موقع البطين الأيسر (الأفضل) أو الأذين باستخدام المقابض التكيف مرحلة X & Y (الشكل 8)، ثم رفع أو خفض مرحلة باستخدام مقبض دوار على المسرح لوضع هدف حقن بالضبط على مركز علامة سوداء على الشاشة الموجات فوق الصوتية.
4. استخدام X التعديل مرحلة مقبض الباب لتحرك الجنين إلى اليمين، الخروج من الشاشة الموجات فوق الصوتية. إعادة حقن مكروي إبرة وتسليح العودة الى المكان، ½ سم بعيدا عن و90 درجة إلى مسبار الموجات فوق الصوتية (الشكل 7).
5. عن طريق حقن مكروي جبل المقابض التكيف (الشكل 9C-G)، موقف إبرة مع طرف بوضوح آلigned مع علامة المركز. ضبط زاوية حقن (باستخدام المقابض في الشكل 9C وEG)، وX، Y، Z وناقلات الإبرة الدقيقة لضمان ركز طرف الإبرة في الطائرة الصحيحة. التراجع عن حقن مكروي إبرة باستخدام فقط على "حقن" مقبض الباب (الشكل 9F)، الحرص على عدم ضبط أبعاد أخرى.
6. مرة أخرى، وذلك باستخدام فقط على X غرامة التكيف مرحلة مقبض الباب الخطوة الجنين مرة أخرى تحت التحقيق، مع الهدف بالضبط على العلامة مركز على الشاشة الموجات فوق الصوتية. تأكد من أن البطين الأيسر هو الآن بالضبط على نفس X، Y، Z والطائرة.
7. وبعد ذلك، مع مجرد "حقن" مقبض الباب على حقن مكروي جبل، ثقب ببطء الجنين مع إبرة حقن مكروي وتقديم معلومات سرية تدريجيا إلى البطين الأيسر. ضخ 2.5 ميكرولتر كاملة من حل TL إلى البطين الأيسر أو حتى فارغة أصوات تحذير صفير، من خلال عقد "فارغة" والتنصت "ملء" مرة واحدة (أرقام 2A & B). في هذا الوقتالحقن مراقبة الظل المنبثقة من رأس الإبرة وهو TL الدخول في غرفة القلب (الشكل 10). في الاتجاه المعاكس، يتراجع بسرعة حقن مكروي إبرة الدورية لل"حقن" مقبض الباب (الشكل 9F) على حقن مكروي جبل عندما حقن كاملة.
8. تستمر إلى الجنين القادم، وكرر هذا الإجراء الأجنة المتبقية بعد هذه السلسلة من الخطوات ووضع أخيرا الأجنة النهائية مرة أخرى في البطن السد. التبديل التخدير إلى صندوق الغرفة وتحرك بلطف الأم هنا لمدة 15 دقيقة من وقت لآخر حقنة.

4. حصاد الأجنة وتحليل

1. تضحية السد عبر خلع عنق الرحم. توسيع شق البطن لإزالة قرون الرحم بسهولة من الأم. الحفاظ على الأجنة داخل الرحم الكيس. وضع الأجنة في برنامج تلفزيوني مبردة.
2. تشريح الأجنة من الرحم كيس (إذا جمع الأنسجة اللازمة لالتنميط الجيني) ووضع الجنين كله أنان 4٪ لامتصاص العرق (PFA) بين عشية وضحاها، ثم إلى 30٪ سكروز بين عشية وضحاها، وتجميد ناظم البرد في باجتزاء المتوسطة. ثم قطع cryosection ووضعه على الشرائح للتحليل المناعى. اختياريا، واستخدام الأنسجة لكله يشن من قبل التجفيف في الميثانول بنسبة 100٪، بعد التثبيت في 4٪ PFA.
3. لتحليل المناعى وضع cryosections في برنامج تلفزيوني لإزالة أكتوبر ثم منع المقاطع مع 10٪ مصل حمار عادي لمدة 30 دقيقة. ثم إضافة PECAM الأجسام المضادة الأولية في 1: 100 التخفيف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، وغسل الشرائح في PBT 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل وإضافة حمار لمكافحة الجرذان 594 الثانوي واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
   ملاحظة: هذا هو أسلوب تطالب غاية تتطلب التحسين وتنسيق الموجات فوق الصوتية وحقن مكروي. هناك منحنى التعلم حاد جدا تتعلق هذه التقنية ويتطلب أربعة إلى ستة أسابيع من الحقن إرشادهم قبل واحد يصبح بارعا.

النتائج

تشكيل الأوعية الدموية تسبق تدفق في تطوير الكلى

أغلبية من الأنسجة الجنينية (بما في الكلى) تحتوي على الأوعية الدموية الكثيفة (سواء unperfused وperfused ل)، وحتى في وقت مبكر نقطة زمنية الجنينية. لأفضل مقياس وتحليل تدفق الدم داخل الكلى تطوير ع...

Discussion

التخدير حقن مكروي والإطار الزمني

وفيما يتعلق تخدير الأم، فمن الضروري للحفاظ على ثبات تدفق الهواء (2-3 لتر / دقيقة) وعند انخفاض PSI. يجب أن تعقد تدفق مهدئ في حوالي الساعة 1،75 حتي 2 لتر / دقيقة. في وقت واحد والأطر الزمنية التي الحقن تتم يج?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DAPI	Sigma Aldrich	022M4004V	concentration 1:5,000
Pecam	BD Biosciences	553370	concentration 1:100
FITC-Tomato Lectin	Vector Laboratories	FL-1321	concentration 2.5 µl / embryo
Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat)	Jackson Immunoresearch	712-585-150	concentration 1:200
Microinjection Needle	Origio Mid Atlantic Devices	C060609
Mineral Oil	Fisher Scientific	BP26291
1 ml syringe	Fisher Scientific	03-377-20
Clay Blocks	Fisher Scientific	HR4-326
Surgical Tape	Fisher Scientific	18-999-380
PBS	Fisher Scientific	NC9763655
Hair Removal Product	Fisher Scientific	NC0132811
Surgical Scissors	Fine Science tools	14084-08
Fine Forceps	Fine Science tools	11064-07
Surgical Marking Pen	Fine Science tools	18000-30
Right angle forceps (for hysterectomy)	Fine Science tools	11151-10