نموذج الفئران من فخذي الشريان إصابة سلك مع غرس المحيطة بالأوعية تسليم المخدرات التصحيح

Summary

We describe a surgical technique that produces wire injury in the femoral artery of mice to induce neointimal hyperplasia to serve as a model testing system for the perivascular delivery of therapeutic compounds for the inhibition of restenosis.

Abstract

Percutaneous interventions including balloon angioplasty and stenting have been used to restore blood flow in vessels with occlusive vascular disease. While these therapies lead to the rapid restoration of blood flow, these technologies remain limited by restenosis in the case of bare metal stents and angioplasty, or reduced healing and possibly enhanced risk of thrombosis in the case of drug eluting stents. A key pathophysiological mechanism in the formation of restenosis is intimal hyperplasia caused by the activation of vascular smooth muscle cells and inflammation due to arterial stretch and injury. Surgeries that induce arterial injury in genetically modified mice are useful for the mechanistic study of the vascular response to injury but are often technically challenging to perform in mouse models due to the their small size and lack of appropriate sized devices. We describe two approaches for a surgical technique that induces endothelial denudation and arterial stretch in the femoral artery of mice to produce robust neointimal hyperplasia. The first approach creates an arteriotomy in the muscular branch of the femoral artery to obtain vascular access. Following wire injury this arterial branch is ligated to close the arteriotomy. A second approach creates an arteriotomy in the main femoral artery that is later closed through localized cautery. This method allows for vascular access through a larger vessel and, consequently, provides a less technically demanding procedure that can be used in smaller mice. Following either method of arterial injury, a degradable drug delivery patch can be placed over or around the injured artery to deliver therapeutic agents.

Introduction

Arterial injury and inflammation caused by angioplasty and stent implantation can induce neointimal hyperplasia that contributes to the thickening of the arterial wall, a process known as restenosis.^1,2 The formation of restenosis is major mode of failure for interventions such as angioplasty and stenting with bare metal stents.³ Due to recent concerns with the inhibition of vascular healing in arteries treated with drug eluting stents, there is also a need to find compounds that can inhibit restenosis while maintaining vascular healing and re-endothelialization.^4-7 In addition, while stents have had success in the coronary vasculature, percutaneous interventions of all types in the peripheral arteries continue to fail at a higher rate due to restenosis.^8-10 Mouse models of surgical interventions allow the use of powerful genetic manipulations that can provide mechanistic insight into the mechanisms underlying the failure of clinical therapies and can provide an initial test bed for compounds to inhibit intimal hyperplasia.

Here, we describe a mouse model of vascular injury that allows the testing of therapeutic compounds to inhibit neointimal hyperplasia and assess whether their effects on re-endothelialization following endothelial denudation. A key challenge in executing vascular injury in mice is the technical skill needed to obtain vascular access and to restore flow to the injured artery following the wire injury. For this reason, simple arterial ligation models have been used to study neointimal hyperplasia in mice that do not require endovascular manipulations but are easier to implement.¹¹ However, this type of surgical model differs substantially from the mechanical and biological aspects of a percutaneous intervention, lacking key aspects including arterial wall stretch, endothelial denudation and luminal blood flow following injury.

We present two methods for obtaining and closing vascular access for wire injury of the femoral artery in mice. The first technique is the conventional method described by several groups previously and uses vascular access through a side branch of the femoral artery.^12-14 This method requires older, larger mice and more surgical skill to implement the endoluminal access through the smaller artery. It also requires the ligation of the muscular branch of the femoral artery following the procedure. The second method we describe uses an arteriotomy in the branch point of the main and side branch and thereby allows for a larger access to the artery for performing wire injury. In this method, the arteriotomy is closed using controlled local cauterization that leaves both branches with blood flow following the procedure. The conventional method is applicable to mice of at least 20 weeks of age while the alternative method can be used in mice of at least 15 weeks of age. In both methods, the wire creates arterial stretch and abrasion leading to injury and endothelial denudation. Following either procedure a perivascular drug delivery patch can be implanted that allows the delivery of compounds to alter the response to injury. The use of the drug delivery patch allows mice to be used as a test bed for new compounds to inhibit restenosis through perivascular therapies.^15,16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع الطرق هو مبين في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. إعداد جدول الجراحي

1. إعداد سادة التدفئة مع إعادة تدوير المياه الدافئة على طاولة الجراحة، تحت المجهر تشريح. وضع غير القابل للصدأ لوحة الصلب قاعدة على لوحة التدفئة. وضع وسادة ماصة معقمة على لوحة قاعدة وسادة التدفئة.
2. ترتيب الأدوات الجراحية المعقمة على وسادة ماصة معقمة المجاورة. جمع اثنين من أزواج من الملقط ذات الرؤوس غرامة الزاوية، واثنين من أزواج من ملقط الزاوية، ثلاثة ملقط مرقئ، وهما الكامشات الأسلاك، مقص جراحي صغير، مقص الدقيقة، والأسلاك الاوعية الدموية واحد (0.15 بوصة القطر) وثلاث شرائح 6 بوصة من خياطة 6.0 الحرير .
3. ثني نهاية إيابا للسلك قسطرة لتتناسب مع انحناء الشريان الفخذي. وهذا سيجعل من الاسهل للمضي قدما في السلك أثناء الجراحة.

2. إعدادالماوس لجراحة

1. تخدير الماوس عن طريق الاستنشاق المستمر من 2.5٪ الأيزوفلورين. تأكد من مراقبة حالة الحيوان في جميع أنحاء الداخلي. إجراء اختبار قرصة القدم الماوس، لتأكيد أن يتم تخدير بشكل كامل. ضمان الحيوان لا يتحرك عندما يخضع للامتحان قرصة.
2. تطبيق مرهم التشحيم لعيون الحيوان لمنع جفاف. تأمين الحيوان في موقف ضعيف للسادة ماصة باستخدام الشريط الجراحية. تواصل إدارة 2.5٪ الأيزوفلورين عبر مخروط الأنف.
3. باستخدام كريم مزيل الشعر، إزالة الفراء من الساق والبطن إلى خط منتصف. شطف الجلد جيدا بالماء. إزالة الشعر لا يمكن أن يؤديها قبل يوم واحد من عملية جراحية. لاحظ أن العلاج المفرطة مع كريم قد يؤدي إلى تهيج الجلد.
4. على الفور قبل الجراحة، وتطبيق بوفيدون اليود إلى منطقة نزعه مع قضيب من القطن ذات الرؤوس لتعقيم الجلد. شطف الجلد نزعه مع 70٪ من الإيثانول والجافةمع القطن ذات الرؤوس المعقم قضيب. كرر 3 مرات.
5. إدارة جرعة ما قبل المنطوق من 5 ملغم / كغم من كاربروفين عن طريق الحقن تحت الجلد.

3. عزل الشريان الفخذي

1. باستخدام مقص جراحي صغيرة، وجعل شق المنحني في الجلد فوق الشريان الفخذي. تشريح بصراحة وتأمين الأنسجة المحيطة باستخدام الكامشات التبعي ضام المغناطيسي لتحديد موقع الشريان الفخذي. ترطيب الأنسجة بشكل دوري باستخدام المياه المالحة للري تطبيق المالحة باستخدام القطن ذات الرؤوس المعقم قضيب.
2. عزل الشريان الفخذي باستخدام ملقط. فصل بلطف العصب من حزمة الأوعية الدموية باستخدام ملقط غرامة ذات الرؤوس. تجنب ثقب الوريد، ولا يتلف الأعصاب. دفع العصبية بعيدا عن حزمة لتجنب تحفيز ذلك.
3. فصل بلطف الوريد الفخذي من الشريان الفخذي، وتحديد مكان والتشعب الفخذ. منطقة التشعب هي صعبة للغاية لتشريح.
4. Posterior إلى التشعب، حلقة خياطة الحرير 6.0 تحت الشريان الفخذي وآمنة مع مرقئ. وسوف تستخدم هذه خياطة الداني لتقييد تدفق الدم في الشريان.
   ملاحظة: هناك اختلاف طفيف في العلاقات عند تنفيذ طريقة ربط مقابل طريقة الكي (انظر الشكل 1 والشكل 2).
5. القاصي إلى التشعب، حلقة 6.0 خياطة الحرير تحت الشريان الفخذي وآمنة مع مرقئ. هذه المساعدات خياطة البعيدة في المواقع من الشريان.
6. حلقة اثنين من الغرز ضمن الفرع العضلي للشريان الفخذ، قبل التعادل لهم وتأمين مع مرقئ. تذكر لترطيب الأنسجة بمحلول ملحي. إذا كان أداء طريقة الكي الإصابة الأسلاك، واحد فقط خياطة يحلق ضرورية على الفرع العضلي.

4. أداء فخذي الشريان إصابة سلك

1. تقييد تدفق الدم في الشريان الفخذي عن طريق سحب خياطة الداني. سحب قليلا من hemost القاصيفي ومرقئ تأمين فرع لفضح الموقع لبضع الشريان. Ligate فرع العضلات عن طريق ربط الخيط حوله.
   ملاحظة: رفع الشريان أعلى تقييد تدفق الدم بشكل أكثر فعالية من سحب أفقيا وحدها.
2. قطع فرع صغير مع الكي بين الغرز اثنين. باستخدام مقص الصغرى، إجراء بضع الشريان في فرع جانب من التشعب. استخدام ملقط متوازنة على لفافة من الشريط الجراحية لتحقيق الاستقرار في المقص الصغير.
3. تأكيد وجود بضع الشريان باستخدام ملقط غرامة ذات الرؤوس. رفع بلطف افتتاح بضع الشريان مع ملقط. إدخال نهاية مدورة من السلك في بضع الشريان باستخدام ملقط. لتخفيف النهوض السلك، إضافة واحد أو اثنين من قطرات من يدوكائين في المنطقة باستخدام حقنة.
4. عندما السلك يصل خياطة الداني، والإفراج عن خياطة وتعديله بحيث لا يمكن أن تحول دون تطور من السلك. أدخل السلك حتى أنه لا يمكن دفع أكثر من ذلك. غيض من عشريجب أن يتوقف الأسلاك الإلكترونية في المنطقة في الرباط الإربي.
5. السماح للسلك بالبقاء في الشريان الفخذي لمدة دقيقة واحدة. بعد دقيقة واحدة، ودفع التراجع السلك في حركة نشر عشر مرات تجرح وتعرية البطانة من الشريان الفخذي. لإصابة من شدة أقل، وانخفاض عدد المرات التي يتم سحبها السلك الدخول والخروج من الشريان أو ترك السلك في الشريان لمدة 1 دقيقة فقط.
6. التراجع السلك ببطء. عندما نهاية الجولة من السلك اجتاز خياطة الداني، وتقييد تدفق في الشريان عن طريق سحب خياطة الداني. التراجع السلك تماما.

5. Ligating فرع العضلات

1. تشديد خياطة المتبقية على فرع العضلي. هذا سوف يمنع نزيف من بضع الشريان. عودة تدفق إلى فرع العضلات، وتؤكد أن الدم لا يتسرب منه. تقليم نهايات من الغرز على الفرع العضلي.

6. الأسلوب البديل: المترجمة كاوterization من بضع الشريان

ملاحظة: يمكن اتخاذ نهج بديل لتجنب ربط فرع العضلات وتسمح الوصول الى الاوعية الدموية من خلال شريان الفخذ الرئيسي أكبر.

1. بدءا من 4.1، وتقييد تدفق إلى الشريان الفخذي من خلال سحب على خياطة الداني. سحب الخيط القاصي وخياطة تأمين فرع العضلات قليلا لفضح الموقع لبضع الشريان (الشكل 1) والشكل (2).
2. باستخدام مقص الصغرى، إجراء بضع الشريان عند نقطة فرع من الشريان الفخذي وفرع العضلي. إذا تم إجراء شق في جانب الشريان، قد يكون من الأسهل ليكوي. استخدام ملقط متوازنة على لفافة من الشريط الجراحية لتحقيق الاستقرار في المقص الصغير.
3. لاختبار نجاح الكي، واستعادة تدفق إلى الشريان الفخذي من خلال تخفيف خياطة القريبة. في حالة حدوث نزيف من بضع الشريان، كرر الكي. إذا كان الكي ناجحا، سيتم إعادة تدفق الدمالمخزنة البعيدة إلى بضع الشريان.
4. إدخال السلك وأداء إصابة الأسلاك كما هو موضح في قسم 4.
5. تواصل تقييد تدفق الدم في الشريان الفخذي. تسخين مكواة ذات الرؤوس غرامة لا تقل عن 6 بوصات بعيدا عن الماوس. كما يبرد طرف الكي، وتطبيق ذلك على محمل الجد جانب بضع الشريان لإغلاق الجرح.
6. لاختبار نجاح الكي، واستعادة تدفق إلى الشريان الفخذي من خلال تخفيف خياطة القريبة. في حالة حدوث نزيف من بضع الشريان، كرر الكي. إذا كان الكي ناجحا، سوف يتم استعادة تدفق الدم البعيدة لبضع الشريان. إزالة القريبة مؤقت والعلاقات البعيدة.

7. زرع المحيطة بالأوعية تسليم المخدرات التصحيح

1. إنشاء التصحيح المخدرات ماحول الأوعية يمكن أن تنشأ كما هو موضح في الدراسات السابقة ¹¹ أو باستخدام أساليب مماثلة. بلانت زوايا المنطقة حاجز التصحيح تسليم المخدرات باستخدام مقص العقيمة
2. وضع بات تسليم المخدراتالفصل على الشريان الفخذي بجروح مع الجانب بين الافراج عن المخدرات التي تواجه الشريان. عند الضرورة، واستخدام ملقط لتحسين وضع التصحيح.

8. الجرح إغلاق والاسترداد

1. إغلاق الجرح مع خياطة انقطاع بسيطة تتكون من عقدة مربع. A خياطة متقطعة يطيل إغلاق الجرح في حالة يحاول الحيوان لإزالة خياطة.
2. إيقاف التخدير وإزالة الحيوان من مجموعة لأعلى. السماح للحيوان لاسترداد على لوحة ظاهرة الاحتباس.
3. تواصل رصد الانتعاش الفأر. التحقق من موقع شق كل يوم لضمان بقائه مغلقا. لعلاج الألم بعد العمليات الجراحية، وإدارة الحقن تحت الجلد من 5 ملغم / كغم من كاربروفين كل 12 ساعة بعد الجراحة وبعد ذلك كل 12 ساعة لمدة 2 أيام. إذا استمر الألم ما بعد الأيام الأولى 2، يجب استشارة طبيب بيطري للاتجاهات على مزيد من الدواء الألم.

9. الشرايين حصاد الفخذ لعلم الأنسجة

1. في 28 يوما بعد الجراحة، نفذ ثاني أكسيد الكربون القتل الرحيم على الماوس.
   ملاحظة: معدل تدفق مناسب من ثاني أكسيد الكربون يجب أن تحل محل 10-30٪ من الغرفة في الدقيقة الواحدة، وسوف تختلف تبعا لحجم الغرفة المستخدمة. يجب أن يتم تنفيذ قطع الحجاب الحاجز وثقب في القلب كوسيلة من وسائل الثانوي القتل الرحيم.
2. تأمين الماوس في موقف ضعيف باستخدام الشريط الجراحية. إجراء شق خلال شريان الفخذ، حيث تم إجراء شق جراحي الأولي.
3. لكل من الشريان المصاب والشريان لم يصب من الساق المقابل، بصراحة تشريح وتأمين الأنسجة باستخدام الكامشات والتبعي ضام المغناطيسي لتحديد موقع الشريان الفخذي المحيطة بها. ترطيب الأنسجة بشكل دوري باستخدام المياه المالحة للري. تطبيق المالحة باستخدام القطن ذات الرؤوس المعقم قضيب. الحرص على عدم تلف الشريان.
4. بعد أن تم عزل الشريان الفخذي من موقع لبضع الشريان الأصلي إلى الشريان الأبهر في البطن، وربط SEGمنة للخياطة الحرير بالقرب من الموقع الأصلي للبضع الشريان. هذا وسوف خياطة تساعد في تحديد نهاية معظم البعيدة للشريان الفخذ وسهولة التعامل مع العينة.
5. باستخدام مقص تشريح الصغيرة لاستئصال الشريان الفخذي. جعل شق واحد القاصي إلى خياطة. جعل شق آخر في الطرف المقابل من الشريان الفخذي، بجانب الشريان الأورطي البطني.
6. نقل الشريان رفعه إلى طبق بتري الزجاج تحتوي على محلول ملحي. تشريح الشريان أيضا على إزالة النسيج الضام الزائدة أو الدهون. بلطف إزالة الدم من تجويف قبل الشطف بمحلول ملحي.
7. نقل الشريان إلى قارورة من 10٪ من الفورمالين مخزنة. تخزين القارورة في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف لمدة 48 ساعة.
8. نقل الشريان الثابتة إلى 70٪ من الإيثانول، لتخزين حتى تتم معالجتها لالأنسجة.
9. تضمين الشريان في كتل البارافين وقسم الكتل لتلطيخ.
10. أداء تلطيخ النسيجية وimmunochemical لتقييم مدى الإصابة وباطنة HYPerplasia.
    ملاحظة: للحصول على نتائج تمثيلية، استخدمنا الهيماتوكسيلين ويوزين لتصور النوى والتشكل العام أو Movat في Pentachrome وصمة عار لتصور صفائح مرنة ومكونات الشرايين الأخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وبعد إصابة الأسلاك، وتضخم neointimal يتطور مع مرور الوقت وعادة ما يتم فحص بعد 14 إلى 28 يوما. التقنيات الموضحة في هذا الاعلان من العمل لجيل قوي من باطنة تضخم في الفئران كما أظهرت نتائج النسيجية في الشكل (3). ومن شأن الشريان الفخذي لم يصب تثبت صفائح مرنة سليمة وسمك طبي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

We have presented a method for performing vascular injury in mice and delivery therapeutic compounds to the injured region through a perivascular cuff. The ligation method for femoral and carotid arteries has been described in conventional methods papers and characterized extensively^11-14,19-23 and we present an alternative method for achieving the same vascular injury that is less technically demanding procedure that can often be used in younger mice. One of the chief advantages of the using a mouse wire inju...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight spring wire, 0.15” diameter	Cook	G02426
High Temperature cautery	Bovie Medical Corp.	HIT1
High-temperature fine tip for cautery	Bovie Medical Corp.	H101
Micro-scissors	Fine Science Tools	15000-13	For performance of arteriotomy
Angled fine-tipped forceps	Fine Science Tools	11251-35	For blunt dissection of vascular bundle
Angled forceps	Roboz	RS-5069	For clearing tissues
Surgical scissors	Roboz	RS-5840	For cutting skin
Retractor	Fine Science Tools	18200-10
Retractor wire	Fine Science Tools	18200-05	Attached to retractor
Base plate	Fine Science Tools	18200-03	For use with retractor
Magnetic retractor fixator	Fine Science Tools	18200-01
Needle Holder	Roboz	RS-7822
Hemostatic forceps	Biomedical Research Instruments, Inc.	34-1000
Dissecting microscope	Meiji Techno	EMZ-5TR
Microscope light source	Meiji Techno	FT191
Warm water recirculator	Gaymar	TP-500	For maintaining mouse body temperature
Reusable heating pad	Gaymar	TP-R 22G	For maintaining mouse body temperature
Lidocaine	Various
4.0 Vicryl suture with half circle needle	Ethicon	J494G	For post-surgical wound closure
Sterile cotton-tipped applicators	Puritan	25-806-2WC	For application of depilatory cream and absorbing fluids
Depilatory cream	Nair
Isoflurane	Various
Betadine	Various
70% ethanol	Various
6.0 braided silk suture	Teleflex Medical	4-S	For isolation of femoral artery during surgery
0.9% sodium chloride	Various		For irrigating tissues
Gel eye lubricant	Various
Glass Petri dish	Pyrex	3160-60	For femoral artery harvest
10% buffered formalin	Various		For fixation of femoral artery
70% ethanol	Various		For fixation of femoral artery
Bouin's fluid	Electron Microscopy Sciences		For Movat's Pentachrome staining
Alcian blue, 1%	Electron Microscopy Sciences	26385-01	For Movat's Pentachrome staining
Alkaline alcohol	Electron Microscopy Sciences	26385-02	For Movat's Pentachrome staining
Orcein, 0.2%	Electron Microscopy Sciences	26385-03	For Movat's Pentachrome staining
Hematoxylin alcoholic, 5%	Electron Microscopy Sciences	26385-04	For Movat's Pentachrome staining
Ferric chloride, 10%	Electron Microscopy Sciences	26385-05	For Movat's Pentachrome staining
Lugol's Iodine	Electron Microscopy Sciences	26385-06	For Movat's Pentachrome staining
Woodstain scarlet-acid fuchsin working solution	Electron Microscopy Sciences	26385-07	For Movat's Pentachrome staining
Acetic acid, 0.5%	Electron Microscopy Sciences	Various	For Movat's Pentachrome staining
Phosphotungstic acid, 5%	Electron Microscopy Sciences	26385-09	For Movat's Pentachrome staining
Alcoholic saffron, 6%	Electron Microscopy Sciences	26385-10	For Movat's Pentachrome staining