علم وظائف الأعضاء مختبر مظاهرة: معدل الترشيح الكبيبي في الجرذ

Summary

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Abstract

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

Introduction

The most important function of the kidney is the homeostatic regulation of extracellular water and electrolyte content. The kidneys closely regulate extracellular water, sodium (Na) and potassium (K) to maintain normal physiological levels. Disturbances in renal function can result in serious metabolic disorders which can be fatal. The basic renal process occurs in the nephron and begins with the filtration of plasma at the glomerulus and ends with the excretion of urine. Other processes that determine the final concentration of water, Na and K in the urine are secretion and reabsorption within the nephron. Measurements of glomerular filtration rate (GFR) and the fractional excretion of Na and K are critical in assessing renal function in health and disease. The reader is referred to previously published review articles and textbooks for a more thorough discussion of kidney function^1-4.

GFR can be measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron⁵. While this technique requires anesthesia, surgical preparation, and a terminal experiment, it is considered the gold standard of GFR measurement. Using inulin that is tagged with fluorescein-isothiocyanate (FITC), plasma and urine concentration of FITC-inulin can be easily measured in small volumes and used to calculate GFR during multiple time points of an experiment. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine.

The conceptual understanding of how to measure renal function can easily be demonstrated in a short lab designed to allow students to actively participate in some aspects of the experiment. This video depicts the pre-lab preparation, the renal function demonstration, and the post-lab evaluation of results. The surgical techniques necessary for making measurements of GFR are demonstrated in an anesthetized rat. In addition, example calculations for GFR, and the fractional excretion of Na and K are shown before and after administration of a diuretic drug.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

قبل الشروع في أي إجراء الحيوان، لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC) يجب الموافقة على البروتوكول. وقد وافق هذا البروتوكول من قبل جامعة IACUC ولاية ميشيغان.

1. إعداد قبل مختبر FITC-حبوب الحل

1. الدافئة 20 مل من المياه المالحة إلى 70 درجة مئوية، وببطء ضجة في 100 ملغ من FITC-حبوب (5 ملغ / مل FITC-حبوب) حتى يذوب كل حبوب.
2. حل بارد لRT وإضافة 800 ملغ من ألبومين المصل البقري (40 ملغ / مل BSA، مسحوق مجفف بالتجميد، الجلوبيولين أساسا الحرة، الذيفان الداخلي منخفضة، ≥98٪ نقاء بواسطة agarose هلام الكهربائي).
3. تصفية الحل حبوب-BSA مع ورق الترشيح (الصف 1). وضع حل تصفيتها في حقنة 20 مل مع فلتر حقنة طرف (0.2 ميكرون)، ويغطى بورق للحماية من الضوء.

2. التخدير وجراحة

1. وضع فأر في غرفة تحريض مليئة 5٪ الأيزوفلورين للحث على التخدير. سجل بودالوزن ص (250-350 ز) ووضع فأر على منصة الجراحية ساخنة تهدف إلى الحفاظ على 37 درجة مئوية درجة حرارة الجسم في كافة مراحل التجربة. تأمين بلطف الفئران على منصة مع الشريط المختبر على الكفوف. الحفاظ على التخدير مع 1-2٪ الأيزوفلورين مع الصف الطبية 100٪ O ₂ في معدل تدفق الهواء من 0،8-1،0 لتر / دقيقة.
2. ادخال قسطرة مدبب (داخل الأوعية OD طرف، 2.7F) في الشريان الفخذي لضغط الدم ورصد معدل ضربات القلب، وأخذ عينات الدم.
3. ادخال قسطرة (PE-50) في الوريد الفخذي للحبوب الحقن في الوريد. تأمين القسطرة إلى الأنسجة المحيطة مع 5-O مضفر الحرير خياطة جراحية ^6.
4. إرفاق القسطرة الشريانية لمحول الضغط قياس الضغط. سجل ضغط الدم ومعدل ضربات القلب باستخدام برنامج الحصول على البيانات وعرضها على شاشة الكمبيوتر في الوقت الحقيقي. ويتجلى هذا الأسلوب في التفاصيل على شريط فيديو ^6.
5. فضح المثانة عن طريق شق فوق العانة. قطع صغيرةثقب في طرف المثانة وإدراج قنية (PE-190) مع حرارة اندلع طرف داخل المثانة لجمع البول. تأمين قنية إلى المثانة مع خياطة محفظة سلسلة.

3. البول وجمع الدم

1. وضع حقنة من FITC-حبوب في ضخ حقنة مع معدل تدفق مجموعة من 1 مل / ساعة لكل 100 غرام من وزن الجسم (3 مل / ساعة لفأر وزنها 300 غرام). نعلق حقنة لقسطرة الوريد الفخذي. بدء ضخ حبوب والسماح لفترة موازنة 2/1 ساعة. الحفاظ على حقنة مغطاة بورق للحماية من الضوء.
2. تحديد ما إذا كان معدل تدفق البول هو ثابت وكاف لتحليل العينة (20 ميكرولتر / دقيقة) عن طريق جمع عينة البول في وزنه قبل القارورة جمع لمدة 10 دقيقة. تحديد حجم البول gravimetrically مع مقياس رقمي. وحدة تخزين البول الكافي لفترة التحصيل 10 دقيقة 0.2 مل. مواصلة جمع عينات البول حتى تشير إلى مجموعتين متتاليتين معدل تدفق البول من 20 ميكرولتر / مأو أكثر.
3. عينات ما قبل الدواء
   1. جمع عينة البول خلال فترة 20 دقيقة. جمع عينة الدم (0.5 مل) من القسطرة الشريانية في منتصف فترة جمع البول. كن حذرا لواضحة تماما القسطرة الشريانية من المياه المالحة قبل جمع عينة الدم في قارورة جمع تحتوي على 1 U الهيبارين. استخدام قارورة جمع مع علامات حجم لتسهيل جمع 0.5 مل من الدم الشرياني.
   2. طرد القسطرة الشريانية مع الهيبارين المالحة (20 U / مل) لمسح القسطرة من الدم (حوالي 0.1 مل). يجب أن يكون طول القسطرة الشريانية قصيرة قدر الإمكان للحد من حجم الهيبارين المالحة المطلوبة للقضاء.
      ملاحظة: عينات الدم المخفض تنتج حسابات غير دقيقة من GFR وإفراز كسور من نا وK.
   3. انتظر 10 دقيقة، وتكرار مجموعة من ثانية البول قبل المخدرات وعينة من الدم.
4. بعد جمع عينتين قبل المخدرات وإدارة ودرو مدر للبول ز، فوروسيميد (10 ملغ / كلغ)، عن طريق القسطرة في الشرايين. طرد القسطرة الشريانية مع المياه المالحة heparinized لمسح القسطرة من المخدرات. الحرص على منع ضخ الهواء عن طريق القسطرة في الشرايين. تسجيل الوقت من حقن فوروسيميد.
5. عينات بعد المخدرات: في كل نقطة من النقاط الزمنية 3 أدناه، وجمع عينة من البول خلال فترة جمع 10 دقيقة، وعينة الدم (0.5 مل) في منتصف فترة جمع البول.
   1. العينة بعد المخدرات 1 - جمع خمسة دقيقة بعد فوروسيميد.
   2. العينة بعد المخدرات 2 - جمع عشرة دقيقة بعد فوروسيميد.
   3. العينة بعد المخدرات 3 - جمع خمسة عشر دقيقة بعد فوروسيميد.
6. بعد الانتهاء من جمع كل العينات، الموت ببطء الفئران وفقا للإجراءات المؤسسية بضع الصدر وإزالة القلب. إزالة كل من الكليتين. Decapsulate (إزالة الغشاء المحيط) وصمة عار الكلى لإزالة الدم الزائد. وزن الكلى.

الحمار = "jove_title"> 4. تحليل عينة

1. قياس كافة وحدات التخزين عينة البول gravimetrically مع مقياس رقمي، وأوزان قياسية.
2. الطرد المركزي عينات الدم الكامل مع جهاز للطرد المركزي فوق المنضدة (1800 x ج) لفصل البلازما. نقل عينات البلازما إلى قارورة صغيرة المسمى.
3. تحليل تركيزات البوتاسيوم والصوديوم في عينات البول والبلازما مع محلل الصوديوم / البوتاسيوم.
4. قياس FITC-حبوب في البلازما والبول
   1. تمييع البول قبل المخدرات (من 1: 200-1: 400)، وبول بعد المخدرات (1:10) مع HEPES العازلة (500 ملي، ودرجة الحموضة 7.4).
   2. إضافة 40 ميكرولتر من ميكرولتر القياسية أو عينة و 60 العازلة HEPES في 96 لوحة جيدا (عينة واحدة لكل بئر) والسماح لخلط لمدة 10 دقيقة في حين مغطاة بورق الألمنيوم.
   3. توليد منحنى القياسية لFITC-حبوب لتركيزات 6.25، 12.5، 25، 50، 100، 200، 400 ميكروغرام / مل (الشكل 1). تحديد مضان FITC-حبوب في العينات والمعايير باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية مع السابقينالاقتباس وانبعاث موجات من 485 و 538 نانومتر، على التوالي.
   4. تناسب القيم الفلورسنت لمعايير ل4-paramter ظيفة اللوجستية تحليل الانحدار. وتستخدم المعلمات وظيفة الانحدار لحساب تركيز FITC-حبوب في البلازما والبول عينات (الجدول 1).

5. تحليل ما بعد المختبر من النتائج: الحسابات

1. حساب معدل تدفق البول (UV، مل / دقيقة): [حجم البول جمع (مل)] ÷ [وقت جمع (دقيقة)]
2. حساب معدل الترشيح الكبيبي (GFR، مل / دقيقة): [البول تركيز حبوب (ميكروغرام / مل) × الأشعة فوق البنفسجية (مل / دقيقة)] ÷ [البلازما حبوب اضرب. (ميكروغرام / مل)]
3. حساب المصفاة تحميل الصوديوم (ميكرومول / دقيقة): البلازما تركيز الصوديوم (ميكرومول / لتر) س GFR (مل / دقيقة)
4. حساب الصوديوم إفراز معدل (U V _نا؛ ميكرومول / دقيقة): البول تركيز الصوديوم (ميكرومول / لتر) × الأشعة فوق البنفسجية (مل / دقيقة)
5. حساب كسور إفراز الصوديوم (FE نا؛٪): [U V _نا (ميكرومول / دقيقة)] ÷ [تصفيتها تحميل الصوديوم (ميكرومول / دقيقة)] × 100
6. حساب تحميل المصفاة البوتاسيوم (ميكرومول / دقيقة): البلازما تركيز البوتاسيوم (ميكرومول / لتر) × GFR (مل / دقيقة)
7. حساب البوتاسيوم إفراز معدل (U _K V؛ ميكرومول / دقيقة): البول تركيز البوتاسيوم (ميكرومول / لتر) × الأشعة فوق البنفسجية (مل / دقيقة)
8. حساب كسور إفراز البوتاسيوم (K FE؛٪): [U _K V (ميكرومول / دقيقة)] ÷ [تصفيتها البوتاسيوم تحميل (ميكرومول / دقيقة)] × 100

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كان مدر للبول يستخدم في المظاهرة مختبر فوروسيميد الذي يثبط بشكل سريع جدا استيعاب من البوتاسيوم والصوديوم تصفيتها عن طريق الكلى مما أدى إلى زيادة الصوديوم، البوتاسيوم، وإفراز المياه في غضون دقائق من الدواء. بواسطة آلية الأساسية، يجب أن يكون فوروسيميد الحد الأدنى من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

علامة المناسبة لقياس GFR يجب أن تفي أربعة معايير هي: أن تتم تصفيته بحرية في الكبيبة، تكون غير منضم إلى بروتينات البلازما، ولا يمكن استيعابها ولا يفرز في كليون. حبوب هو بوليمر الفركتوز الذي يرضي هذه المعايير. ونتيجة لذلك، يعتبر التصفية الكلوية للحبوب المعيار الذهبي لقي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-0 Braided Silk Surgical Suture	Surgical Specialties Corp	SP1033
Assay Plate, 96-Well	Costar	3922
Bovine Serum Albumin	Sigma Chemical Co	A2934-25G
Centrifuge	Beckman Coulter	MicroFuge 18, 357160
Conical Sample Tubes	Dot Scientific Inc.	#711-FTG
Cotton Tipped Applicators	Solon Manufacturing Co	56200
Data Acquisition Software	ADInstruments	LabChart Pro 7.0
Digital Scale	Denver Instrument	APX-4001
FITC-Inulin	Sigma Chemical Co	F3272-1G
Gauze Sponges	Covidien	2146
Heated Surgical Bed	EZ-Anesthesia	EZ-212
Heparin	Sagnet	NDC 25021-402-10
HEPES	Sigma Chemical Co	H3375
Isoflurane	Abbott Animal Health	IsoFlo, 5260-04-05
Isoflurane Vaporizer	EZ-Anesthesia	EZ-190F
Micro Dissecting Forceps	Biomedical Research Instruments Inc.	70-1020
Microplate Reader - Fluoroskan	ThermoScientific	Ascent FL, 5210460
NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer	NOVA BioMedical	14156
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors	Fine Science Tools	12002-12
PE-190 (for bladder catheter)	BD Medical	427435
Pressure Transducer	ADInstruments	MLT1199
Pyrex Culture Tubes	Corning Inc.	99445-12
Rat Femoral Tapered Artery Catheter	Strategic Applications Inc.	RFA-01
Salix Furosemide 5%	Intervet	#34-478
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-11
Student Surgical Scissors	Fine Science Tools	91402-12
Surgical Gloves	Kimberly-Clark	Sterling Nitrile Gloves
Syringe pump	Razel Scientific	R99-E
Tissue Forceps	Fine Science Tools	91121-12
Tissue Scissors	George Tiemann  Co	105-420
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar  3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc.  #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale  Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer  ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann  Co 105-420