الكشف عن Exosomal العلامات البيولوجية التي يسببها الميدانية الكهربائية الإصدار والقياس (EFIRM)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Exosomes والهياكل صغير الحويصلات التي تلعب دور الوسيط في الاتصالات بين الخلايا. ومن مصلحة لدراسة البضائع الداخلية للexosomes لتحديد ما إذا كانت تحمل مرض المؤشرات الحيوية التمييزية. لأداء تحليل exosomal، فمن الضروري وضع طريقة لاستخراج وتحليل exosomes من biofluids الهدف دون الإضرار المحتوى الداخلي.

الإفراج الكهربائية الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM) هي طريقة لاستخراج تحديدا exosomes من biofluids، تفريغ حمولتها، واختبار داخلي المحتوى RNA / البروتين. باستخدام CD63 محددة الأجسام المضادة microparticle المغناطيسي مكافحة الإنسان، وعجلت exosomes أول من biofluids. وتطبق التالية الاستخراج، ذات الجهد المنخفض الموجات مربع دوري الكهربائية (CSW) لتعطيل الغشاء الحويصلي وتسبب تفريغ البضائع. والمهجنة محتوى exosome إلى الاشعال DNA أو الأجسام المضادة يجمد على سطح القطب للغنى عنهntification من المحتويات الجزيئي.

طريقة EFIRM هو مفيد لاستخراج exosomes والبضائع تفريغ للتحليل دون تحلل العازلة. هذا الأسلوب هو قادرة على أداء كشف معين من كل من RNA والبروتين العلامات البيولوجية أهداف في exosome. EFIRM مقتطفات exosomes تستند بشكل خاص على علامات سطحها بدلا من التقنيات المعتمدة على الحجم.

المجهر انتقال الإلكترون (TEM) والفحص تبين وظيفة طريقة لالتقاط exosome والتحليل. تم تطبيق طريقة EFIRM إلى exosomal تحليل 9 الفئران المحقونة مع رئة الإنسان خلايا H640 السرطان (خط الخلية transfected للتعبير عن علامة exosome البشري CD63-GFP) من أجل اختبار الشخصية exosome ضد 11 الفئران تلقي الضوابط المالحة. وعثر على مستويات مرتفعة من المؤشرات الحيوية exosomal (المرجع GAPDH الجينات والبروتينات السطحية علامة البشري CD63-GFP) لH640 حقن الفئران في كل من المصل واللعاب العينات. وعلاوة على ذلك، ساليوقد أثبتت فا وعينات المصل لديك الخطي (R = 0.79). هذه النتائج توحي للبقاء المؤشرات الحيوية exosome اللعابية للكشف عن الأمراض البعيدة.

Introduction

البحث Exosome هو المجال الناشئ من التحقيق الذي يدرس microvesicles الدهون التي تحمل RNA ^{1، 2} DNA، والبروتين ³ البضائع. وقد أدت التحقيقات السابقة من exosome الأحياء لتحديد exosomes في biofluids مثل الدم ^{4، 5} البول وحليب الثدي ^6، واللعاب ^7. وقد أثبتت الدراسات أن exosomes تلعب دورا في مسارات الخلوية المختلفة، التأمل التواصل بين أنظمة مختلفة من الجسم ⁸ عن بعد. بسبب الدور الذي تلعبه في التواصل بين الخلايا exosomes، والافتراض أنهم قد حزمة أهداف جزيء حيوي (البروتين، RNA، DNA و) المترابطة مع الحالات المرضية. في المختبر ³ والحيوان نموذج تظهر ⁹ الدراسات لإثبات هذه الفرضية. في التحقيق المحتوى exosomal لاكتشاف العلامات البيولوجية، فمن الضروري وضع منهجية لانتقائية العزلة exosome من biofluids، expulsi يسببهاعلى البضائع من exosomes، وتقدير حجم الجزيئات الحيوية exosome. في نطاق هذا العمل، وسيتم تحديد exosomes كهيكل وجود قطرها حوالي 70-100 نانومتر وتملك سطح علامة CD63.

الباحثون عادة أولا تنقية exosomes بواسطة تنبيذ فائق ¹⁰ ثم معالجة المحتوى exosomal من خلال استخدام مجموعات تحلل العازلة. استخدام أساليب تحلل العازلة يتطلب مرات حضانة تتراوح بين دقائق إلى ساعات. هذه العملية قد يحتمل أن تضر البضائع exosome وتؤدي إلى تدهور عينة. على سبيل المثال، اللعاب RNA exosome صدر عن طريق تحلل العازلة في البيئة المحيطة خارج الخلية يمتلك عمر نصف أقل من 1 دقيقة، مما يجعل قياس exosomal RNA بعد تحلل العازلة مهمة صعبة للغاية بدون إضافة الكواشف لتحقيق الاستقرار ^11. تأثير مركب مضيفا الكواشف المختلفة للتحلل والاستقرار قد يعرض العوامل التي تعقد وتتداخل مع analyجهاز الأمن والمخابرات من المحتويات exosomal. قد يكون نهجا بديلا مفيدة لتفريغ بسرعة المحتوى exosomal والحفاظ بأمان البضائع لتوصيف.

في هذا العمل، نقترح استخدام حقل كهربائي غير موحدة للإفراج عن المحتوى exosomal. من المعروف أن الحقول الكهربائية لنقل القدرة على استقطاب وتعطيل طبقة ثنائية المادة الدهنية التي تشكل أغشية الخلايا. لدينا العمل التجريبي يستكشف استخدام موجات مربع دوري غير موحدة (CSW) لتعطيل البنية microvesicle من exosomes والإفراج عن البضائع المنقولة. وتستخدم هذه الطريقة الفولتية في عدة مئات من مجموعة الميليفولت، وهذا يعني أن معظم الجزيئات الحيوية لن يعرقلها. علينا أن نبرهن على استخدام موجة دوري مربعا قادر على تحفيز إطلاق سراح اللعابية exosome المحتوى مرنا في البيئة المحيطة الموائعية. تم دمج هذا الإصدار من المحتويات exosomal بسلاسة مع نظام الكهربائي التي يمكن استخدامها لقياس مستويات التعبير العلامات البيولوجية ^12،13. وتسمح هذه الطريقة المقترحة لالسريع، حساسة، وتحلل العازلة تحليل خالية من المحتوى exosome.

الشكل 1. نظرة عامة على EFIRM سير ^العمل. وينقسم طريقة EFIRM على نطاق واسع في المراحل الرئيسية الثلاث التي هي ضرورية لتنقية وتحليل exosomes.

ويستخدم هذا استنادا الإفراج المحتوى exosomal وتحليل طريقة لجنة وضع المرأة بالتعاون مع ميكروبيدات CD63 محددة المغناطيسية لexosome العزلة. هذه الخرز CD63 تقارب تسمح لعزل انتقائية من exosomes من عينات اللعابية (وbiofluids أخرى). وبعد حضانة واستخراج exosomes باستخدام الخرز الممغنطة، يتم ترحيل حبات إلى نظام الاستشعار الكهروكيميائية للجنة وضع المرأة استنادا الإفراج المحتوى وتحليل جزء من التجربة. الشكل 1 لمحة عامة عن عملتدفق طريقة EFIRM.

Protocol

1. المغناطيسي Exosome استخراج مقرها الخرزة-

1. ماصة حل تمتزج جيدا من 5 ميكرولتر من المجهرية الدقيقة المغناطيسي Streptavidin المغلفة إلى 495 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عازلة في أنبوب microcentrifuge ل resuspend الخرز. غسل و resuspend حبات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات باستخدام رف المغناطيسي. رف هو مجموعة من مغناطيس على جانب وحدة سكنية التي يمكن أن تعقد الأنابيب عينة ميكروسنتريفوج.
   1. لكل غسل، دعونا أولا الأنابيب الجلوس على الرف لمدة 1 دقيقة، ثم استخدام طرف ماصة لإزالة بعناية المخزن المؤقت طاف دون إزعاج الخرز.
   2. وضع أنابيب على رف منتظم دون المغناطيس في الجانب. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب، واستخدام ماصة لخلط الحل والخرز معا. ثم وضع الأنابيب مرة أخرى على رف المغناطيسي لفصل حبات مرة أخرى من الحل.
   3. تنفيذ هذا إزالة عازلة عن طريق مغنطة وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني لمجموعه ثلاث مرات. هذا ينفذ غسل الأولي من الجسيمات المغناطيسية.
2. resuspend والخرز في 490 ميكرولتر من العازلة PBS، مع أنبوب يوضع على الجزء غير ممغنط من رف المغناطيسي. الماصة 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة الماوس المعقدة البيروكسيديز CD63 مكافحة الإنسان في 1.0 ملغ / مل تركيز الأسهم في خليط من الخرز. استخدام ماصة لخلط حبات والأجسام المضادة في الحل.
3. وضع أنابيب microcentrifuge مع حبة والمعقدة البيروكسيديز مزيج الأجسام المضادة على محور دوار العينة. تعيين المعلمات المدورة لمحور دوار عينة للتناوب المتبادل في 90 درجة إمالة لمدة 5 ثوانى وتهتز في 5 درجة ل1 ثانية. تدوير أنابيب خليط عينة حبة في هذه المعلمات لمدة 30 دقيقة في RT.
4. إزالة الأجسام المضادة غير منضم بعد الاقتران.
   1. وبعد 30 دقيقة من الدوران في RT، ووضع الأنابيب مرة أخرى في رف المغناطيسي لمدة 5 دقائق.
   2. تنفيذ ثلاث يغسل من الخرز عن طريق إزالة الطور السائل باستخدام micropipette ويغسل مع 500 μ؛ ل من برنامج تلفزيوني. بعد غسل الثلاثي، resuspend والخرز في 490 ميكرولتر من الكازين-PBS ومكان على الجزء unmagnetized من الرف.
5. استخراج Exosome باستخدام الخرز المغلفة الأضداد.
   1. تسمية كل أنبوب مع استهدافا ID العينة. ماصة عينة 10 ميكرولتر من المصل أو اللعاب في أنبوب microcentrifuge. استخدام ماصة لخلط العينة وحبات مغناطيسية من قبل pipetting عدة مرات.
   2. وضع أنابيب مع عينة ومكافحة الإنسان الخرز CD63 الأجسام المضادة على محور دوار وتناوب لمدة 2 ساعة على RT. استخدام نفس المعلمات المدورة كما هو موضح في الخطوة 1.2.
   3. بعد 2 ساعة من عينة الدورية، إجراء غسل الثلاثي التي كتبها جذب لحبات منفصلة عن حل، وإزالة الطور السائل مع ممص مكروى، وإعادة التعليق الخرز في 500 ميكرولتر من العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك. حبات الناتجة الآن منضمة إلى exosomes ونحن على استعداد لإطلاق سراح مجال كهربائي والقياس.

صدر 2. الكهربائية المستحثة الميداني لالثانية قياس Exosomal المحتوى

1. Precoating الأولي الكهربائي مع GADPH التمهيدي
   1. تطبيق البلاستيك بشكل جيد لمجموعة القطب لمنع انتقال التلوث من الأقطاب الكهربائية الفردية. لهذه التجربة، واستخدام مجموعة الكهربائي 16 أجهزة الاستشعار مع كل قطب كهربائي وحدة في مجموعة تتألف من العمل، ومكافحة، والقطب إشارة مصنوعة من الذهب العارية.
   2. تحضير خليط الأسهم من 100 نانومتر التحقيق DNA، 0.3 M بوكل، و 10 ملي بيرول من قبل pipetting الكواشف الأسهم في أنبوب مع الماء المقطر عالى النقاء. مزيج دقيق من قبل vortexing.
      ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، التحقيق DNA اختيار يتوافق مع الجين إشارة GAPDH، والذي يعرف في الوجود ضمن exosomes. تسلسل التحقيق المستخدمة هي: 5'-البيوتين-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 ". استخدام هذا الخليط على كل الأقطاب.
   3. الماصة 60 ميكرولتر من الحمض النووي مونومر خليط التحقيق على سطح كل قطب كهربائي الذهب. دراسة الأقطاب لضمان عدم وجود التغطية الكافية للعمل، جounter، وإشارة كهربائية من الخليط السائل.
   4. Electropolymerize خليط مونومر مسبار لخلق طبقة البوليمر إجراء على سطح القطب من خلال تطبيق دوري موجة مربع (CSW) لمحة الحقل الكهربائي إلى سطح القطب. ويتكون هذا الحقل الكهربائي تطبيق +350 بالسيارات لمدة 9 ثانية والتحول فورا إلى +950 بالسيارات ل1 ثانية. تطبيق هذا دوري مربع الملف الشخصي موجة إلى القطب لمدة 10 دورات، أي ما مجموعه 100 ثانية من الحقل الكهربائي تطبيقها.
   5. شطف السطح الاستشعار 3 مرات بالماء المقطر والجافة مع غاز النيتروجين لإزالة السائل من سطح القطب. ضمان أن تتم إزالة السائل بشكل صحيح من القطب.
2. Exosome البضائع التفريغ
   1. تحميل 5 ميكرولتر من 1 ميكرومتر من التحقيق للكشف في 495 ميكرولتر من خليط حبة exosome المعقدة واستخدام ماصة لخلط.
      ملاحظة: لجنة التحقيق كاشف هو تسلسل الحمض النووي التمهيدي مترافق إلى جزيء فلوريسئين في نهاية 3 '. وغالبا كاشفتسلسل الإلكترونية المستخدمة في هذه الدراسة يتوافق مع مرنا GAPDH وجدت داخل exosomes. تسلسل فلوريسئين كاشف مترافق التحقيق هو: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-فلوريسئين-3 ".
   2. ماصة 60 ميكرولتر من التحقيق وحبة exosome خليط معقد على سطح القطب الذهب مع مجموعة المغناطيس تحتها. تتكون هذه المجموعة من ستة عشر المغناطيس 2.54 ملم مغناطيس النيوديميوم قطر الانحياز لتتوافق مع أقطاب العمل من أجهزة الاستشعار. ويوضح الشكل 2A موضع المغناطيس وحل حبة exosome.
   3. مرة واحدة يتم تحميل العينة على سطح القطب، وتطبيق 20 دورات من الحقل الكهربائي جنة وضع المرأة مع 9 ثانية في -300 بالسيارات و1 ثانية على +200 بالسيارات (200 ثانية المجموع). سوف البضائع exosomal التي يتم تحريرها هجن لالاشعال على سطح القطب. إذا علامات سطح exosome هي موضوع التحقيق، وتخطي هذا الجزء من التجربة. الشكل يوضح 2B هذه العملية.
   <لى> غسل قبالة التحاليل غير منضم على سطح القطب من ثلاثة أضعاف الشطف سطح القطب مع الماء المقطر. تجفيف الكهربائي مع غاز النيتروجين.
3. مراسل الأجسام المضادة وقراءات
   1. إضافة 60 ميكرولتر من 150 وحدة / مل الأضداد المضادة للفلوريسئين مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (HRP في 1: 1،000 التخفيف) المخفف في الكازين / برنامج تلفزيوني.
   2. استخدام اقتران مدفوعة الكهربائية ميدانية لمجمع HRP المضادة للفلوريسئين إلى شطيرة التحقيق. تطبيق -200 بالسيارات ل1 ثانية و+500 بالسيارات ل1 ثانية لمدة 5 دورات لسطح القطب. ويبين الشكل 2A القبض والتحقيق للكشف عن المجمعات لكل من بروتين ونظام الحمض النووي.
   3. الثلاثي سطح استشعار غسل استخدام الماء المقطر والجافة مع غاز النيتروجين.
   4. بعد غسل حالا من غير منضم الزائد الأضداد المضادة للفلوريسئين، إضافة 60 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-Tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة. تحميل هذا الركيزة على كل سطح مستشعر باستخدام الماصة الأقنية.
   5. أداء قراءات amperometric للتيار عن طريق قياس التيار الكهربائي في -200 بالسيارات لمدة 60 ثانية باستخدام potentiostat الكهروكيميائية قادرة على قياس وقت واحد من 16 قنوات الشكل 2C مثال على التعريف الحالي خلال قراءات.

الشكل 2. مكونات EFIRM الطريقة. (A) طريقة استخراج exosomes من سائل حيوي باستخدام CD63 مكافحة الإنسان المغلفة المجهرية الدقيقة المغناطيسية ومن ثم تفريغ البضائع exosome باستخدام موجات مربع دوري تطبيقها على مجمع الجسيمات exosome. (ب) مخطط الكهربائي جهاز الاستشعار البيولوجي المستخدمة للكشف عن أهداف RNA / DNA / البروتين من exosome الافراج عنهم. (C) مثال ممثل قراءات amperometric من منهجية EFIRM حيث الحجم الحالي أكبر يتوافق رس مستويات أعلى من جزيء حيوي. هذا الرقم هو من وي وآخرون ¹⁴ الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

التحقق من Exosome القبض على الخرز عن طريق TEM

تم التحقق من صحة عزل exosomes من اللعاب باستخدام CD63 حبات مغناطيسية مكافحة الإنسان التالية بروتوكول استخراج باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) الصور. TEM معارض حبات مغناطيسية مع 70-100 ...

Discussion

كما تشير النتائج، CD63 مكافحة الإنسان المغلفة الجسيمات النانوية المغناطيسية هي قادرة على التقاط تحديدا الجسيمات الصغيرة التي لديها حجم تتراوح 70-100 نانومتر. هذه الجسيمات القبض يتسق مع الملف الشخصى لوحظ سابقا من exosomes. وعلاوة على ذلك، يظهر الاستخدام للجنة وضع المرأة ذات ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532