بروتوكول لLentiviral تنبيغ وتحليل المصب من المعوية Organoids

Summary

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Abstract

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introduction

الظهارة المعوية هي واحدة من أنسجة الجسم المتكاثرة بسرعة أكبر، الأمر الذي تسبب بها لجذب اهتمام واسع من البحوث على الخلايا السرطانية والجذعية. في عام 2009 تم نشر تقنية لتوليد الثقافات طويلة الأمد من الخبايا المعوية صغيرة في matrigel، والحفاظ على الأبعاد هيكل ¹ 3. هذه الهياكل، وصف organoids الأمعاء، يمكن تربيتها باستخدام تقنيات القياسية، مع توضيح تستكمل المتوسطة مع عدد من عوامل النمو محددة، بما في ذلك BMP-يشير مسار المانع رأس (نوج)، وWNT-يشير محسن مسار rspondin 1 (Rspo1) و عامل نمو البشرة (EGF) وجد كل لتعزيز انتشار الأمعاء ^2-4.

Organoids تجاوز خطوط الخلايا السرطانية التقليدية في الجوانب التي هم غير المتحول، حافظوا على التسلسل الهرمي الخلايا الجذعية، وعرض الاستقطاب الخلوي سليمة ومعرض التمايز في جميع الأنساب الخلية وجدت في كثافة العمليات الصغيرة الوليدةظهارة estinal. لأنها يمكن transduced للقيام الجينات المحورة أو تدخل RNA يبني ^5، وأنها تستخدم لدراسة عناصر وراثية محددة، تفوق التجارب باستخدام الفئران المعدلة وراثيا في جوانب التكلفة والسرعة. التعبير المعدلة وراثيا في organoids يمكن القيام بها باستخدام إما فيروسات أو الفئران ناقلات lentiviral ^6،7. بسبب القيود المفروضة على الفيروسات القهقرية الفئران، قادرة على transducing الخلايا الإنقسامية حصرا ^8، هو أكثر كثيرا ما تستخدم تنبيغ lentiviral للخلايا التي يصعب أن تصيب، مثل organoids.

transduced فيروسي والتعبير عن ثابت organoids المعدلة وراثيا يمكن أن تستخدم للعديد من التحليلات المصب، بما في ذلك RNA الكمي التحليلات والمناعية. أخذت معا، وتطورت ثقافة organoids من الخلايا الظهارية في الأمعاء الأولية في تقنية الروتينية التي هي سهلة لتنفيذ دون متطلبات مختبر معينة، وأصبحت المعيار رواية في مالثقافة ليرة لبنانية في البحث على ظهارة الأمعاء.

تقنيات تنبيغ الفيروسية وتحليل المصب لاحق في organoids هي شاقة لأداء وللمساعدة تجارب عضي ولدت لنا هذا البروتوكول الفيديو، والتي تبين طرق lentiviral تنبيغ organoids مثقف. وتبين لنا بالإضافة إلى ذلك كيف يصح تجهيز organoids يمكن زيادة الغلة، وبالتالي تعزيز أداء تحليل المصب باستخدام تقنيات RNA أو المناعية. في البروتوكول، واستخدمت organoids التي هي مستمدة من الخبايا المعوية الصغيرة حصرا، على الرغم من أن التقنيات الموضحة يمكن تطبيقها على organoids القولون أيضا.

Protocol

1. إعداد Polyethylenimine (PEI) كما ترنسفكأيشن الكاشف

1. حل حوالي 150 ملغ من PEI إلى 100 ​​مل من H ₂ O.
2. ضبط حل لدرجة الحموضة 7.4 بإضافة حمض الهيدروكلوريك حتى يصبح حل واضح ويقلب حتى يذوب تماما. وهذا قد يستغرق ما بين 10 و 60 دقيقة والمياه إضافة إلى تركيز نهاية 1 ملغ / مل.
3. عندما اضح، تصفية حل PEI من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الفريزر -80 درجة مئوية في aliquots من 5 مل.

2. إنتاج Lentiviral الجسيمات

اليوم 1:

1. خلايا HEK293T انقسم الى 60٪ -80٪ confluency في 162 سم ² قارورة أو طبق بتري كبير في خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين و 2 ملي الجلوتامين الملحق).

يوم 2:

2. إعداد DNA الحل ترنسفكأيشن التي تحتوي على 45 ميكروغرام من إجمالي DNA البلازميد بإضافة معاناقلات lentiviral التعبئة والتغليف (7 ميكروغرام من pVSVg، 5 ميكروغرام من pRSV مراجعة (13)؛ ميكروغرام من pMDL) و 20 ميكروغرام من البلازميد lentiviral ترميز الجينات في المصالح أو shRNA من الاهتمام. التكيف مع حجم 1 مل باستخدام DMEM.
3. إعداد PEI الحل ترنسفكأيشن من خلال إضافة 90 ميكرولتر من 1 ملغ / مل PEI إلى 930 ميكرولتر من DMEM واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. إضافة DNA الحل ترنسفكأيشن إلى حل PEI. دوامة أو عكس عدة مرات واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حل ترنسفكأيشن الحمض النووي.
5. بالتنقيط 2 مل من محلول ترنسفكأيشن الحمض النووي على الخلايا HEK293T واحتضان لمدة 4 ساعات في ترطيب حاضنة الثقافة خلية على 37 ° C.
6. بعد 4 ساعات، وتحديث مستنبت لإزالة PEI. وليس من الضروري أن يغسل خلايا قبل أن يضيف الوسيلة الجديدة.
   ملاحظة: PEI غير السامة للخلايا وحضانة مرات أطول من 4 ساعات قد يسبب ضررا للخلايا HEK293T.

اليوم 4:

7. استبدال سوبrnatant مع الجديد مستنبت. الحفاظ طاف (التي تحتوي على فيروس)؛ هذا وسوف تستخدم في الخطوة 2.10.
8. وضع طاف في 15 مل قارورة. لإزالة الخلايا الميتة، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
9. دفع طاف من خلال 0.45 ميكرون فلتر باستخدام حقنة كبيرة 60 مل. تخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.

يوم 5:

10. جمع الدفعة الثانية من طاف. الطرد المركزي ومرشح كما هو الحال في الخطوات 2،8-2،9.
11. تجميع supernatants من الخطوات 2.9 و 2.10 في أنابيب نابذة فائقة السرعة وأجهزة الطرد المركزي في 50،000 x ج في نابذة فائقة السرعة لمدة 90 دقيقة.
12. تأخذ بها كبسولات تحتوي على أنابيب نابذة فائقة السرعة بعناية فائقة ووضعها في غطاء تدفق الصفحي، وتذكر التوجه من الأنبوب داخل أجهزة الطرد المركزي.
13. كبسولة مفتوحة عقد أنبوب نابذة فائقة السرعة والمتوسطة صب بعناية في مثل هذه الأزياء التي بيليه على الجانب العلوي من الأنبوب. منذ الكريات الفيروسية قد يكون من الصعب تصور، تذكر على ماجانب من أنبوب بيليه سيكون قد تشكلت. اتخاذ ممص مكروى وإزالة الجزء الأخير من المتوسط ​​مع الحرص على عدم تستنهض الهمم بيليه البني مبهمة التي مرئيا على جانب من الجزء السفلي من أنبوب نابذة فائقة السرعة.
14. و resuspend هذا بيليه في 500 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع 10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021، 10 ميكرومتر Y27632 و 8 ميكروغرام / مل polybrene. إعادة تعليق في هذه الوسيلة هي مهمة منذ يستخدم الفيروس عيار عالية لtransduct organoids مباشرة.
15. اختياريا: تجميد الفيروس في هذه الوسيلة aliquoted على دفعتين من 250 ميكرولتر في -80 ° C.

3. Lentiviral تنبيغ من Organoids

اليوم 0:

1. تقسيم كامل 0.95 سم ² جيدا organoids يومين قبل تنبيغ في بئر جديد، وتهدف إلى الحصول على ما يقرب من 50 organoids صغير. تقسيم organoids وفقا لبروتوكول نشرت سابقا ¹ (الشكل 3A، B).
2. تكملة عضي مستنبت مع 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ملي نيكوتيناميد للحصول فرط الكيسي أقبية التكاثري (الشكل 3C).
   ملاحظة: سوف أقبية الكيسي تطوير أفضل عندما تزرع organoids تقسيم حديثا في وجود Chir99021.

يوم 2:

3. organoids الحصاد قبل pipetting صعودا ونزولا على matrigel والمتوسطة، وبالتالي تعطيل الخليط مع ممص مكروى P1000. ضع الخليط في أنبوب 15 مل.
4. تعطيل باستخدام مزيد من باستور الماصة التي قد انخفضت افتتاح البعيدة عن ذوبان. organoids أجهزة الطرد المركزي لتكوير لمدة 5 دقائق في 100 × ز.
   ملاحظة: تعتمد على حجم الطرد المركزي، واستخدام سرعة أجهزة الطرد المركزي مختلفة. فمن الضروري للعثور على سرعة الدقيقة التي تعطلت يتم فصل organoids من الخليط.
5. إزالة طاف وإضافة 500 ميكرولتر من قبل تحسنت التربسين 1X (على غرار 0.25٪ التربسين). و resuspend organoids في التربسين واحتضان3 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
6. تعطيل التربسين بإضافة 3.5 مل من خط الخلية مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين والجلوتامين). أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
7. إزالة طاف لترك بيليه في حوالي 20 ميكرولتر من المتوسط. نقل organoids في هذا المبلغ صغير الأخير من المتوسط ​​في بئر على طبق من ذهب 48-الآبار.
8. إضافة العالية عيار الفيروسة البطيئة في التنبيغ المتوسطة كما هو موضح في الخطوة 2.14، في resuspend وانتقل إلى الخطوة 3.10. عندما تواجه منخفضة التنبيغ فعالية، خطوة 3.9 ويمكن أن يضاف.
   ملاحظة: للحصول على التنبيغ كفاءة، وعادة إضافة قسامة واحدة من 250 ميكرولتر من ارتفاع عيار الفيروسة البطيئة للبئر واحدة من organoids. وهذا يمثل 50٪ من جميع الفيروسة البطيئة تحصد من إنتاج واحد كما هو موضح في الخطوة 2 من هذا البروتوكول.
9. اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، نفذ spinoculation من خلال وضع لوحة تحتوي على الآبار organoids 48 في مرحلة ما قبل درجة حرارة الطرد المركزي على 326؛ C وتدوير في 600 x ج لمدة 1 ساعة.
10. وضع خليط فيروس عضوي الشكل في الثقافة الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة للسماح التنبيغ.
11. اختياريا: لتعزيز فعالية التنبيغ، واحتضان organoids لمدة 3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة.
12. إضافة 1 مل من عضوي الشكل مستنبت و resuspend خليط فيروس عضوي الشكل، ونقل إلى أنبوب microcentrifuge وأجهزة الطرد المركزي في microcentrifuge لمدة 5 دقائق في 850 x ج لتكوير organoids.
13. إزالة طاف و resuspend بيليه في 20 ميكرولتر من matrigel الجليد الباردة. منذ المواد يتصلب عندما يصبح أكثر دفئا، واستخدام نصائح ماصة التي توترت بسبب pipetting صعودا وهبوطا الجليد PBS البارد لعدة مرات.
14. وضع قطرة في منتصف بئر في لوحة 48 بئرا واحتضان في حاضنة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لترسيخ.
15. بعد 15 دقيقة، إضافة بعناية 250 ميكرولتر من عضوي الشكل مستنبت تستكمل مع10 ملي نيكوتيناميد، 10 ميكرومتر Chir99021 و 10 ميكرومتر Y27632. سوف شظايا عضي تعطلت صغيرة تشكل في organoids الكيسي صغير خلال 24 ساعة.

يوم 5:

16. تحديث المتوسطة وتكملة مع مضاد حيوي التحديد (لبوروميسين، استخدم 4 ميكروغرام / مل).

يوم 7:

17. استبدال المتوسطة لمعيار مستنبت عضي، على أن تستكمل مع اختيار المضادات الحيوية.
    ملاحظة: سوف الناشيء تكون كاملة 2-3 أسابيع بعد Chir99021 الانسحاب. بعد الاختيار، قد نمت organoids دون اختيار المضادات الحيوية.

4. عضي إعداد RNA لالكمي RT-PCR أو ميكروأري

1. لإعداد RNA، واستخدام عدة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إزالة المتوسطة من organoids وإضافة 350 ميكرولتر من العازلة RLT، على أن تستكمل مع β المركابتويثانول مباشرة على قبة matrigel تحتوي على organoids. Resuspend والعتادالقاعدة في RLT من قبل pipetting باستخدام P1000 ممص مكروى.
2. أداء مزيد من الإعدادية RNA وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
3. اختياريا: زيادة الغلة RNA عن طريق التضخيم باستخدام نظام الحفاوة بيكو WTA، والتي تتطلب مدخلات الأولي من 50 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
4. اختياريا: لمراقبة الجودة قبل RNA ميكروأري، تشغيل العينات على 2100 bioanalyzer باستخدام حقيقي النواة مجموع RNA نانو رقاقة، وتهدف لعدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من 8.5 أو أكثر (الشكل 5) وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.

5. معالجة Organoids لتضمين البارافين والمناعية

1. قبل الشروع في عضي تضمين ما قبل الحارة كتلة الألومنيوم مع الثقوب لتركيب 12 ملم أنابيب زجاجية قطرها في حاضنة عند 70 درجة مئوية للحفاظ على البارافين السائل.
2. خذ بئر واحد مع organoids كامل نما وإزالة المتوسطة، وترك organoids جزءا لا يتجزأ سليمة.
3. إضافة 1 ملمن بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني مباشرة إلى جيدا وإصلاح في 4 درجات مئوية في أي مكان من 1 ساعة ليلة وضحاها.
4. استبدال بارافورمالدهيد مع 1 مل من الجليد الباردة PBS.
   اختياريا: الحفاظ على organoids الثابتة في برنامج تلفزيوني يصل إلى 1 في الاسبوع عند 4 درجة مئوية بعد هذه الخطوة.
5. و resuspend organoids الثابتة في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومكان في زجاج القارورة.
6. السماح organoids تنزل الى القاع لمدة 1 دقيقة، صب PBS واستبدالها مع 70٪ من الإيثانول التي يتم فيها حل بضع قطرات من محلول يوزين لتمكين التصور من organoids في جميع مراحل عملية التضمين.
7. ترك organoids في 70٪ من الإيثانول في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 دقيقة، وإزالة 70٪ من الإيثانول عن طريق الصب بعناية، والقدرة على تصور organoids قبل العين بسبب بسيط وردي اللون يوزين. استبدال تضمين حل مع 96٪ من الإيثانول.
8. كرر الخطوة 5.7، في كل مرة يحل محل الحل تضمين مع واحد القادم. تمرير organoids من خلال الحلول التالية لاحقا: 70٪ من الإيثانول و 90٪ من الإيثانول و 96٪ من الإيثانول، و 100٪ الإيثانولنول، و 100٪ من الإيثانول، الزيلين والزيلين.
9. صب غسل زيلين الماضي وتصب البارافين في أنبوب. وضع أنبوب على الفور في مرحلة ما قبل درجة حرارة كتلة الألومنيوم عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، واستبدال البارافين مع البارافين نظيفة الجديد.
10. صب البارافين قبالة والماصة organoids في القالب كتلة البارافين باستخدام درجة حرارة ما قبل باستور الماصة مع فتحة كبيرة. الحفاظ باستور الماصة دافئة باستخدام موقد بنسن. وضع كافة organoids في قالب كتلة البارافين في طبقة صغيرة من البارافين السائل.
11. قدر الإمكان، في محاولة للتلاعب كل organoids نحو وسط القالب كتلة البارافين باستخدام إبرة تشريح تحسنت. حافظ على تشريح إبرة دافئة باستخدام بنسن الموقد.
12. عندما توطين organoids في قالب غير مرضية، والبرد القالب قليلا ليصلب طبقة البارافين.
13. الانتهاء من كتلة بصب المزيد من البارافين على رأس وإضافة معيار النسيجي التضمين الكاسيت.

النتائج

تنبيغ lentiviral عضوي الشكل

تقنية التنبيغ عضوي الشكل باستخدام الجزيئات lentiviral تعتمد على المعالجة الصحيحة للorganoids قبل وأثناء التنبيغ. كانت Organoids (الشكل 3A) مثقف وأنها تعطلت في أقبية واحدة (الشكل 3B). كما ذكرت سابقا، ?...

Discussion

يصف بروتوكول الفيديو الحالي تنبيغ lentiviral من organoids من ظهارة الأمعاء الأولية وتحليل المصب من هذه organoids باستخدام تقنيات RNA الكمية والمناعية.

وغالبا ما يقوم التنبيغ Lentiviral في الخلايا الملتصقة أو العائمة في لوحات الثقافة. منذ هيكل ثلاثي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025