المدى الطويل حيوي داخلي Multiphoton المجهر التصوير من الخلايا المناعية في السليمة والمريضة الكبد عن طريق الفئران CXCR6.Gfp مراسل

Summary

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Abstract

التهاب الكبد كرد فعل على الإصابة هي عملية ديناميكية للغاية تنطوي على تسلل فرعية متميزة من الكريات البيض بما في ذلك حيدات، العدلات، T مجموعات فرعية الخلايا، والخلايا B، القاتلة الطبيعية (NK) والخلايا NKT. intravital المجهري للكبد لرصد هجرة الخلايا المناعية هو تحديا من نوع خاص نظرا لمتطلبات عالية فيما يتعلق إعداد العينات وتثبيت، القرار البصرية وبقاء الحيوان على المدى الطويل. ومع ذلك، ويمكن أن ديناميات العمليات الالتهابية وكذلك دراسات التفاعل الخلوية توفير المعلومات الهامة لفهم أفضل للبدء، تقدم وتراجع أمراض الكبد التهابات. لذلك، أنشئ طريقة حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها لدراسة الهجرة وخلية خلية التفاعلات الخلايا المناعية المختلفة في الكبد الماوس على مدى فترات طويلة (حوالي 6 ساعات) من خلال حيوي داخلي ثنائي الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) في تركيبة مع العناية المركزة الرصد. والأنف والحنجرة "> طريقة المقدمة يتضمن إعداد لطيف وتثبيت مستقر الكبد مع الحد الأدنى من اضطراب في الجهاز، التصوير حيوي داخلي المدى الطويل يستخدم متعدد الألوان multiphoton المجهري مع عمليا أي photobleaching من أو التأثيرات الضوئية على مدى فترة زمنية تصل إلى 6 ساعات، مما يتيح تتبع من مجموعات فرعية الكريات البيض محددة؛ وشروط التصوير مستقرة بسبب مراقبة واسعة من الماوس المعلمات الحيوية واستقرار الدورة الدموية، درجة الحرارة وتبادل الغازات.

للتحقيق في الهجرة اللمفاويات على التهاب الكبد CXCR6.gfp الضربة القاضية في الفئران تعرضوا للتصوير الكبد حيوي داخلي في ظل ظروف خط الأساس وبعد تلف الكبد الحاد والمزمن الناجم عن حقن داخل الصفاق (ق) من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ _4).

CXCR6 هو مستقبلات chemokine أعرب عن الخلايا الليمفاوية، وذلك أساسا على الطبيعية القاتل T (NKT) - القاتلة الطبيعية (NK) - ومجموعات فرعية من الخلايا الليمفاوية T مثل خلايا CD4 T ولكن أيضا associ المخاطيةated ثابتة (مائت) خلايا تي ^1. في أعقاب نمط الهجرة وتحديد المواقع من CXCR6.gfp ⁺ الخلايا المناعية يسمح نظرة مفصلة في سلوكهم تغير على اصابة الكبد، وبالتالي مشاركتهم المحتملة في تطور المرض.

Introduction

لقد كان التصور من الخلايا والوظائف الخلوية في أجهزة كاملة أو الكائنات حتى كلها ذات أهمية كبيرة لأكثر من 50 عاما، بما في ذلك كل أجزاء الجسم ^2. لذلك، فإن بعض الدراسات المبكرة استخدمت بالفعل التصوير حيوي داخلي في الكبد ^3،4. ومع ذلك، توجد العديد من القيود على آخر المستجدات المتعلقة المدى الطويل عالية الدقة مستقر التصوير من أنسجة الكبد.

بسبب موقف التشريحي للكبد في اتصال وثيق مع الحجاب الحاجز والجهاز الهضمي ^5، والمشكلة الأكثر شيوعا للتصوير حيوي داخلي المجهري هي الحركة بسبب التنفس، وإلى حد أقل، تحوي من الأمعاء ^6. وبالمقارنة مع الأجهزة الصلبة الأخرى، وجراحة الكبد هي تحديا من نوع خاص. نظرا لهيكل الاوعية الدموية الدقيقة كثيفة، يمكن التلاعب الجراحية تؤدي إلى آفات النزفية واسعة النطاق، وضعف دوران الأوعية الدقيقة ^7، وكذلك تفعيل المقيمين طخلايا مناعية مثل خلايا كوبفر ^8. ولذلك، التثبيت الميكانيكي للأنسجة كما نشرت في أماكن أخرى ^6،9 من المحتمل أن تتداخل مع التصوير intravital المجهري.

في كبد صحي، 10-15٪ من حجم الدم الكلي يكمن داخل الأوعية الدموية والكبد، والجهاز يستقبل حوالي 25٪ من النتاج القلبي العام ^10، مما يجعل الجهاز عرضة للتغيرات في الدورة الدموية (على سبيل المثال، وتقلبات ضغط الدم ). ولذلك، فإن اضطرابات في تدفق الدم الكبدي بسبب مثل إجهاد القص، والتشرد، والإصابة التي كتبها معالجة الأنسجة المفرط أو تداول مركزية تؤدي إلى تغيرات مصطنعة في الكريات البيض سلوك الهجرة، الأوكسجين الكبد وضعف، وبالتالي المزيد من تلف الكبد، مما يؤثر على الكبد الاستجابات المناعية وكذلك كما الحفاظ على الجهاز والوقت حياة الشامل للحيوان.

واستندت الدراسات المجهرية في وقت مبكر على ميل epifluorescence حيوي داخليcroscopy، ولكن العديد من المعوقات الفنية مثل تبيض الصورة وعمق الاختراق المنخفض تحد من استخدام هذه التقنية لتصوير الكبد على المدى الطويل ^4،11،12. مع تطور المجهر multiphoton في 1990s، تم حل القيود المفروضة على الصورة تبيض أو عمق الاختراق بشكل رئيسي، كما كان هذا الأسلوب الجديد قادر من الناحية الفنية لإجراء دراسات التصوير في تقريبا جميع الأجهزة تحت مواقف الحياة الحقيقية ^13-15. ومع ذلك، كانت التحديات الرئيسية المتبقية فيما يتعلق التصوير الكبد: حركات التنفس، وتألق ذاتي من أنسجة الكبد، وتأمين تدفق الدم دون تغيير في الجيوب الكبدية، والتصوير مستقر وخاصة لفترات أطول من عدة ساعة ^16.

على الرغم من أن العديد من الدراسات تناولت وظيفة والهجرة من مختلف الكريات البيض في الكبد ^17، على سبيل المثال، NKT خلايا ^18-20، وخلايا T ^{21،22، 23،24} الضامة الكبد أو العدلات ^25، المدى الطويل multiphoton ملم يتم بعد إنشاء التصوير icroscopy بنجاح، وهي مهمة أكثر صعوبة في الحيوانات مع مرض الكبد الحاد أو المزمن بسبب الأضرار الموجودة وبالتالي ارتفاع قابلية لمزيد من الضرر ^26. ومع ذلك، ومراقبة سلوك الهجرة وظيفة الخلوية من الكريات البيض في الكبد في الوقت الحقيقي يتيح رؤى جديدة في دورها معين في التوازن الكبد ومرض ^27.

يتم التعبير عن CXCR6 مستقبلات chemokine على عدة مجموعات فرعية لمفاوية، بما في ذلك القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، والخلايا NKT وبعض السكان الخلية T ^18،28. وقد أشارت الدراسات السابقة في الفئران التي CXCR6 وCXCL16 يجند لها وما شابه ذلك قد السيطرة على الدوريات الخلايا NKT على الجيوب الكبد خلال التوازن. ونتيجة لذلك، وقد وصفت استخدام الفئران CXCR6.gfp (يحمل في المغلوب من البروتين الفلوري الأخضر [GFP] في موضع CXCR6) للتحقيق في الهجرة من الخلايا الليمفاوية في مختلف أجهزة مثل الدماغ ²⁹وكذلك الكبد ^18،20، والتي تبين زيادة تسلل خلايا CXCR6.gfp على الالتهاب.

مع أسلوب المقدمة في هذه الدراسة كان من الممكن أن تتبع هذه العمليات على مدى فترة طويلة من الزمن في ظل ظروف مستقرة. يسمح الإجراء multiphoton حيوي داخلي يستند التصوير التي كان استنساخه للغاية مع الحد الأدنى من اضطراب الحيوان والجهاز. الأمثل لبقاء الحيوان على المدى الطويل من خلال رصد واسعة تليها مراقبة وثيقة من التنفس والدورة الدموية. ومرنة للغاية وسهلة تعتمد أيضا على أجهزة متني أخرى مثل الكلى أو الطحال.

Protocol

ملاحظة: وأجريت التجارب وفقا للتشريعات التي تحكم الألماني الدراسات على الحيوانات في أعقاب "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (منشورات NIH، الطبعة 8، 2011) والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات تستخدم لأغراض العلمية (الجريدة الرسمية للاتحاد الأوروبي، 2010). تم منح إذن رسمي من الحكومة رعاية الحيوان واستخدام المكتبي (LANUV نوردراين فيستفالن، ركلينغاوسين، ألمانيا).

ملاحظة: الخطوات التي يمكن حذفها للتصوير على المدى القصير (على سبيل المثال المفاجئة الطلقات، مداخن 3-D أو أيضا مدة قصيرة الوقت الفاصل بين المجهري) يتم وضع علامة مع النجمة (*) للحد من الوقت اللازم لإعداد وتبسيط البروتوكول الجراحي. ويمكن أيضا أن يؤديها التصوير دون رقابة رصد وتداول واسعة النطاق إذا لزم الأمر، ومع ذلك، سيتم تخفيض الوقت البقاء على قيد الحياة بشكل ملحوظ.

1. إعداد المجهر وجراحة قبل إعداد (5-10 ميلن)

1. نظام التبديل على (المجهر، مختبر السلطة، ليزر، وسادة التدفئة، وغرفة المناخ، وكاميرا ويب، جهاز ضخ حقنة، التنفس).
2. ربط O ₂ العرض لالأيزوفلورين بخار وتعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 1.5٪ المجلد (ت / ت)، وربط لجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة.
   1. للتصوير على المدى القصير، والحفاظ على التخدير باستخدام الأيزوفلورين إلا بعد الأولي للتحريض التخدير IP (راجع الخطوة 2.2). ثم استخدام 2 المجلد٪ (ت / ت) الأيزوفلورين، والحفاظ على وقت التصوير أقل من 2 ساعة لضمان استقرار دوران الأوعية الدقيقة في الكبد.
3. ضبط التنفس إلى 120-140 دورات التنفس / دقيقة مع حجم 150-200 ميكرولتر.
4. إعداد مرحلة الماوس الاغاروز. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز، وسكب عليه في طبق (حوالي 10 سم × 15 سم القاعدة) في زاوية من 40 درجة.
5. اقامة منطقة العمل الجراحي جمع الأجهزة المطلوبة. لمنع العدوى الميكروبية، وتطهير الأدوات باستخدام محلول 1٪ من Sekusept فورت S (9.9٪ ث / ت)، غلوتارال 9.8٪ ث / ت، الفورمالديهايد لمدة 5 دقائق قبل التجربة (الشكل 1A).
6. الحصول على المكونات المتبقية: مطهر الجلد (على سبيل المثال، 10٪ محلول البوفيدون اليود)، ومرحلة الكبد (مداخن والجسر)، والحل الاغاروز (3٪ (ث / ت) في PBS)، ضخ حقنة مع 5٪ (ث / ت) حل الجلوكوز (G-5)، ضخ حقنة مع الحل مخدر I (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل)، ومسحات القطن، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat، وبرنامج تلفزيوني 1X. وضع طبق مرحلة الاغاروز إلى غرفة الحضانة لالتسخين.

2. القصبة الهوائية (10-15 دقيقة)

1. استخدام C57BL / 6 الفئران من المنزل في تربية وزنها 25-28 ز. بيت الفئران في ظل ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة وفقا للمبادئ التوجيهية FELASA، في و للحرارة البيئة التي تسيطر عليها الرطوبة مع 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام. تسمح الحيوانات حرية الوصول إلى النظام الغذائي العادي الفئران (الشمة ستاندرد القوارض الدايت) والمياه الإعلانية libitum.
2. تخدير الماوس عن طريق الحرف الأولالاتحاد العالمي للتعليم داخل الصفاق (IP) حقن 250 ميكرولتر من محلول مخدر II (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 1 ملغ / مل، البوبرينورفين 10 ميكروغرام / مل).
   1. * للصيانة خلال التصوير حيوي داخلي وإدارة باستمرار حل مخدر I عن طريق الحقن الملكية الفكرية المستمر (الكيتامين 0.1 ملغ / مل، زيلازين 0.5 ملغ / مل، الفنتانيل 5 ميكروغرام / مل) باستخدام جهاز ضخ حقنة مع معدل تدفق 0.2 مل / ساعة في بالاشتراك مع inhalative الأيزوفلورين 0.5 المجلد٪ (ت / ت).
   2. تحقق من ردود الفعل بعد 5 دقائق (مثل قرصة وسادة القدم مع ملقط)، وتطهير الجلد لالقصبة الهوائية، وبدء التحضير إذا الفأر هو في حالة التخدير الجراحي متسامحة.
   3. تطبيق كريم العين واقية (على سبيل المثال، ديكسبانتينول 50 ملغ / غ) لمنع القرنية من الجفاف (الشكل 1B).
3. يحملق الماوس على إعداد جدول فضح الجانب البطني باستخدام شريط لاصق لالأطراف. تنهك بلطف الرقبة، يحملق في هذا الموقف، على سبيل المثال، باستخدام الشريط المطاطي مدمن مخدرات رس القواطع.
   1. تطهير الجلد والفرو باستخدام محلول اليود البوفيدون، من خلال تطبيق مطهر مع مسحة القطن.
4. أداء قطع الجلد الأولي (0.5-1 سم طول) أدناه الذقن مباشرة (الشكل 1C)
   1. تشريح بعناية النسيج الضام بين الغدد اللعابية (الشكل 1D).
   2. المسيل للدموع بعناية مفتوحة العضلات المحيطة أنبوب القصبة الهوائية (الشكل 1E، F).
5. وضع موضوع الجراحي تحت القصبة الهوائية لاحق أنبوب التهوية تثبيت (الشكل 1G).
   1. فتح القصبة الهوائية مع مقص الصغرى بين حلقات الغضروف إجراء شق على شكل حرف T (الشكل 1H)
6. وضع أنبوب التهوية إلى القصبة الهوائية من خلال شق (~ 0.5 سم). لدفع أنبوب إلى الأمام، والاستيلاء على نهاية الذيلية مع ملقط التشريحية الصغيرة ودفع بلطف أنبوب في القصبة الهوائية (الشكل 1I)
7. يحملق أنبوب مع موضوع الجراحية (على سبيل المثال ، 5-0) مع موضوع وضعت في الخطوة 2.5 ربط عقدة حول أنبوب داخل القصبة الهوائية. أداء تثبيت الجمجمة الثاني من الأنبوب في الجلد لتجنب الاعادة العرضي (الشكل 1J، K).
8. ختم قطع مع الغراء الأنسجة (على سبيل المثال، ن بوتيل-2-Cyanoacrylat) (الشكل 1L).
9. يحملق أنبوب على رأس باستخدام شريط لاصق.

3. Laparatomy (15-20 دقيقة)

1. ضع الماوس على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. حلق البطن، إزالة بعناية الشعر من الجلد. تطهير الجلد والفرو حلق باستخدام محلول البوفيدون اليود.
2. إجراء خفض أدناه القص باستخدام مقص جراحي (الشكل 2A) الجلد صغير. تمديد خفض أفقيا تحت الأضلاع لكلا الجانبين، كية جميع الأوعية الدموية واضحة لمنع النزيف.
3. أداء بعناية قطع صغيرة في ألبا الخط تحت القص، وفتح الغشاء البريتوني (الشكل 2B). تمديد خفض لكلا الجانبين باستخدام cauterizأوجه لمنع النزيف (الشكل 2C، D).
4. ضع الماوس إلى الاغاروز طبق المرحلة (الشكل 2E). وضع أكوام من الارتفاع المناسب على كلا الجانبين من الماوس (عادة 12-14 زلات الغطاء) (الشكل 2F).
5. ضع الجهاز التنفسي استشعار الزناد تحت أعلى الظهر لمزامنة المجهر مع التنفس. تفعيل وحدة الزناد (الشكل 2G).
6. وضع موضوع الجراحي (5-0) من خلال القص لسحب الأضلاع (الشكل 2I).
7. قطع بعناية الرباط الذي يربط الكبد والحجاب الحاجز (المنجلي الرباط)، وكذلك الكبد والجهاز الهضمي المسالك باستخدام مقص جراحي منحنية. قطع في الرباط المنجلي وصولا الى الشريان الأبهر (الشكل 2J).

4. إعداد نموذج (10-15 دقيقة)

1. ضع الماوس على الجانب الأيمن مع بزاوية 45 درجة لسهولة الوصول إلى الفص الكبد واسع.
2. إضافة جسر تنظيم تحت الأضلاع، الذي يغطي البطنتجويف. تصنيع جسر باستخدام غطاء زلة القياسية مع شريط لاصق الطلاء لتغطية حواف حادة (الشكل 2K).
3. وضع الفص الكبد كبير على خشبة المسرح. زلة بعناية كروي مزدوج قلم التحقيق أو ملعقة مبطن أسفل الكبد مع الاستمرار على رأس الجهاز باستخدام قطعة من القطن مبللة أو الأنسجة الرطبة. رفع الفص على الشريحة وتطبيق السحب لطيف. الفص يمكن أن تكون عازمة أو مطوية. توفير المزيد من الحيطة لطيف فقط التلاعب في الكبد (الشكل 2L).
4. ضع دعم الوحشي المخاطر، على سبيل المثال، أكوام من زلات صغيرة غطاء (20 ملم × 20 ملم)، ما يقرب من نفس الارتفاع من الفص الكبد بجانبه لدعم تغطية زلة.
5. ضع زلة غطاء كبير (24 ملم × 50 ملم) على الفص الكبد. تأكد من أن غطاء زلة موجه كما الأفقي ممكن (الشكل 2M).
   ملاحظة: يجب أن يكون زلة تغطية على اتصال مع الأنسجة دون الضغط عليه. التحقق من وجود علامات واضحة على ضعف تدفق الدم (الأنسجة البيضاء). إذا microcircتعطل ulation، إضافة مزيد من دعم حصص.
6. * مكان اثنين من القسطرة داخل الصفاق المستقلة (الشكل 2N) للتخدير المدى الطويل وG-5 التطبيق. تثبيت القسطرة أفقيا في الجزء الأسفل من البطن بالقرب من أطرافه الخلفية.
   ملاحظة: يمكن للالقسطرة داخل الصفاق يكون من خلال ربط الإبر 27 G مع مرونة أنابيب السيليكون (الشكل 3) من صنع الذات.
7. * يحملق إبرة مع حلقة من 5-0 موضوع الجراحي للجلد لتجنب النزوح عرضي.
8. * إرفاق ضخ حقنة مع حل التخدير I لقثطار 1، تعيين معدل التدفق إلى 0.2 مل / ساعة. إرفاق ضخ حقنة مع G-5 لقسطرة 2، تعيين معدل التدفق إلى 0.1 مل / ساعة.

5. رصد ماوس

1. * أقطاب مكان ECG إلى الأمام والأطراف الخلفية (الشكل 4A).
2. * إرفاق أنابيب انتهاء إلى CO ₂ استشعار مستوى.
3. إضافة جهاز استشعار درجة الحرارة الخارجي المتصل سادة الحرارة (الشكل 4C).

6. تضمين وتثبيت الأنسجة (5-10 دقيقة)

1. إعداد 100 مل من 3٪ (ث / ت) الاغاروز في برنامج تلفزيوني 1X. تضمين الكبد عندما تكون درجة الحرارة في 41 ° C باستخدام حقنة 5 مل و 18 G إبرة (الشكل 5A).
2. صب المتبقية الاغاروز على ساترة وحول الماوس (الشكل 5B، C). انتظر حتى يتم مهيلم الاغاروز بالكامل.
3. إزالة الاغاروز الزائد باستخدام ملعقة هايدمان، وإعداد viewfield كبيرة بما يكفي لمسح الفص الكبد إعداد (الشكل 5D، E).

7. التصوير

1. نقل الماوس إلى غرفة المناخ المجهر.
2. إضافة 50-100 مل من برنامج تلفزيوني 1X (مسخن على 37 ° C).
3. تغطية صحن عينة لمنع التبخر (الشكل 5F).
4. * تصغير الأيزوفلورين inhalative إلى 0.5٪ المجلد (ت / ت).
5. * ابدأ برنامج مراقبة وتسجيل تخطيط القلب، معدل ضربات القلب وCO ₂ الزفير.
6. بدء تصوير: فتح لامصاريع سر، وتحديد جهة نظر المجالات ذات الاهتمام، وتحديد الحدود العليا والدنيا للZ-مداخن، وبدء تسجيل مرور الوقت. تعدل Z-مداخن إذا لزم الأمر لتصحيح Z-الانجراف (على سبيل المثال. نظرا للتغيرات في ضغط الدم أو درجة حرارة تذبذب، الشكل (5G).
   ملاحظة: بعد الانتهاء من فترة التصوير أو إذا كان التداول أو تخدير الحيوانات يصبح غير مستقر، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم (بدون الصحوة من التخدير).

النتائج

للتحقق من صحة نهج TPLSM حيوي داخلي لدينا، وتعرض CXCR6 ^{GFP / +} الفئران لتصوير TPLSM حيوي داخلي. تم الفئران يقم إما غير المعالجة والضوابط الأساسية أو تعرض لحقن داخل الصفاق واحد من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ ₄₎ للحث على تلف الكبد الحاد ^20.

Discussion

وكان الهدف من دراستنا لتطوير طريقة موحدة للغاية، ومستقرة وقابلة للتكرار للتصوير TPLSM حيوي داخلي في الكبد. وقد أعطى التصوير حيوي داخلي بشكل عام معلومات قيمة حول سلوك الخلوية في ظل ظروف الحياة الحقيقية بعد صاروخ موجه وتفاعل السكان الكريات البيض مختلفة في التنمية، والت?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetics
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl	Rotex Medica	charge: 30819
Fluovac anesthesia system	Harvard Apparatus	34-1030
Glucose 5%	Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser	Eickemeyer	4802885
Isoflurane	Forene Abbott	B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution	DeltaSelect GmbH	PZN 00765145
Ketamin 10%	ceva	Charge: 36217/09
Xylazin 2%	medistar	Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe	BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask	Schott Duran	21 226 36
25 ml Beaker 2x	Schott Duran	50-1150
2 ml syringe	BD Plastipak
4-0 Vicryl suture	Ethicon	V7980
Agarose	commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit	Fine Science Tools Inc.	18010-00
Cotton Gauze swabs	Fuhrmann GmbH	32014
Cover Slip 24x50 mm	ROTH	1871
Durapore silk tape	3M	1538-1
Feather disposable scalpel	Feather	02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID	Smiths medical	800/100/200
Histoacryl	Braun	1050052	5x 0.5 ml
Leukoplast	BSN Medical Inc.
Microscope Slides	ROTH	1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
Sterican needle 18 G x 1	B. Braun	304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1	B. Braun	4657705
Tissue paper	commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL	Gatz	0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2	Storz&Klein	S-01134
Dumont No.7 forceps	Fine Science Tools Inc.	91197-00
Graefe forceps curved x1	Fine Science Tools Inc.	11151-10
Graefe forceps straight x2	Fine Science Tools Inc.	11050-10
Heidemann spatula HD2	Stoma	2030.00
Needle holder Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
Scissor	Fine Science Tools Inc.	14074-11
Semken forceps	Fine Science Tools Inc.	11008-13
Small surgical scissors curved	Fine Science Tools Inc.	14029-10
Small surgical scissors straight	Fine Science Tools Inc.	14028-10
Standard pattern forceps	Fine Science Tools Inc.	11000-12
Vannas spring scissors	Fine Science Tools Inc.	15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit	Rapid Biomedical	3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer	AD Instruments
Minivent Typ 845	Harvard Apparatus	73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I	LaVision
Perfusor Compact	B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder	AD Instruments	PL3508
Temperature controlled heating pad	Sygonix	26857617
Temperature sensor	comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box	Life Imaging Services