Electrospun ألياف نانوية السقالات مع التدريجات ​​في منظمة الألياف

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لافتعال السقالات electrospun ألياف نانوية مع منظمة على مراحل من الألياف واستكشاف تطبيقاتها في تنظيم التشكل خلية / التوجه. التدرجات فيما يتعلق الخواص الفيزيائية والكيميائية للالسقالات ألياف نانوية تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الطب الحيوي.

Abstract

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Introduction

ألياف النانو هي أداة شعبية لهندسة الأنسجة بسبب قدرتها على تقليد المصفوفة خارج الخلية في هيكلها والحجم النسبي ^1. ومع ذلك، بعض واجهات الأنسجة الأم، مثل موقع الإدراج وتر إلى العظم، وتحتوي على ألياف الكولاجين، والتي تظهر على الهيكل التنظيمي المتغير الذي يزيد في محاذاة نحو وتر والنقصان في الموقع العظام ^2-5. لذلك، على تجديد الأنسجة فعالة هناك حاجة الى افتعال السقالة التي يمكن أن تحاكي بشكل فعال هذا التدرج الهيكلي.

بحث في السابق، كان هناك أجريت على تغييرات تدريجية في تكوين الألياف، وتحديدا، المحتوى المعدني ^6. ومع ذلك، وإعادة العنصر الهيكلي للأنسجة الضامة لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. وتناولت دراسة سابقة التدرجات المورفولوجية من خلال دراسة تأثير السيليكا سطح كثافة الجسيمات على انتشار الخلايا بانية العظم قبي الفئران وجدت في إنفرحد ذاتها العلاقة بين كثافة الجسيمات السيليكا وتكاثر الخلايا ^7. ولكن التغييرات الشكلية التي تتوسط تكاثر الخلايا في الأعمال السابقة كانت في معظمها ذات الصلة إلى السطح خشونة تفتقر إلى القدرة في محاكاة التغييرات التنظيمية الألياف ^7،8. حاولت إحدى الدراسات الأخيرة إلى افتعال سقالة تحاكي فريدة من نوعها توجهات ألياف الكولاجين باستخدام جامع رواية للغزل كهربائي ^9. بينما نجحت هذه الدراسة في إنتاج سقالة مع ألياف كلا الانحياز وعشوائية، فإنه فشل في محاكاة التغيرات التدريجية عرضت في أنسجة الأم. أيضا، في إنتاج مكونات منفصلة، ​​مع تغيير فوري من الانحياز إلى التوجه عشوائي، وخصائص النشاط الحيوي لهذه سقالة انخفضت بشكل ملحوظ. لم يكن هناك عمل سابق قادرة على إنتاج السقالات ألياف نانوية قابلة للتطبيق مع تدرجات المستمرة في توجهات الألياف من الانحياز وعشوائي. وقد أظهرت دراستنا الأخيرة الترفيه الناجح السقالات ألياف نانويةمع التدرج في المؤسسة الألياف التي يمكن أن يحتمل تقليد منظمة الكولاجين الأم في وتر إلى العظام الإدراج ^10. ويهدف هذا العمل إلى تقديم البروتوكولات المستخدمة لإنتاج السقالات ألياف نانوية مع الهيكل الذي يشبه أن التنظيم الألياف في واجهة الأم الأنسجة وتر إلى العظام.

هياكل ألياف نانوية التدرج ويحتمل أن تكون التطبيقات عبر مجموعة متنوعة من المجالات بعيدة المدى. ركزنا على تطبيقات لهندسة الأنسجة للموقع الإدراج وتر إلى العظام عن طريق الجمع بين السقالات لدينا مع الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSCs) التي تستخدم بالفعل لتجديد الأنسجة على مختلف ركائز ^11-14. وبالإضافة إلى ذلك، ADSCs متشابهة جدا في الطبيعة إلى الخلايا الجذعية نخاع العظام من حيث multipotency ومواردها وفيرة والتي يمكن حصادها باستخدام بسيط ^15،16 إجراء شفط الدهون. بذر هذه الخلايا على السقالات على مراحل ألياف نانوية أخرى يعزز تيس بهممقاضاة التطبيقات الهندسية من خلال السماح لتوزيع رقابة من الخلايا التي يحتمل أن تفرق في الأنسجة المختلفة. بالإضافة إلى بذر الخلايا الجذعية، ألياف النانو يمكن أن تكون مغلفة مع الإشارة الجزيئات لتنظيم الاستجابة الخلوية. اقتران nanoencapsulation مع التدرج التنظيمي لهذه السقالات يسمح لدراسة السلوك الخلوي أو التصاميم والطلاء زرع الممكنة. يمكن تغليف جزيئات الوظيفية مثل العظام البروتين المخلق 2 (BMP2)، وهو ما ثبت للحث على بناء العظم التمايز ^15،16، تزيد من تعزيز تطبيقات هندسة الأنسجة من هذه السقالات ^10.

Protocol

1. إعداد الحل

1. يعد حل من بولي (ε-caprolactone) (PCL) (M _ث = 80،000 جم / مول) في تركيز تقريبي من 100 ملغ / مل. حل PCL في خليط من ثنائي كلورو ميثان (DCM) وN، N-dimethlyformamide (DMF) بنسبة 4: 1 (ت / ت) مع تركيز 10٪ (ث / ت).
2. وضع الحل في أنبوب زجاجي 20 مل لخلط. وضع أنبوب زجاجي في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة، أو حتى الحل هو شفافة.

2. جهاز إعداد

1. إضافة محلول PCL أعدت في حقنة 5 مل مع إبرة حادة 21 مقياس المرفقة.
2. ضع ضخ حقنة في موقف غزل كهربائي العمودي، وفقا لشكل 1.
3. استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الفجوة جامع مع فضاء مفتوح 2 سم × 5 سم للألياف الركيزة الانحياز. ضع جامع 12 سم من رأس الإبرة.
4. توصيل الجهد العالي التيار المباشر (DC) إمدادات الطاقة إلىالمطحون إبرة وجامع. تأكد من أن جامع يرتكز بشكل فردي مع أي اتصال مع غيرها من المعدات المخبرية.

3. غزل كهربائي

1. يتم استبدال مجموعة ضخ حقنة إلى 1.50 مل / ساعة، حتى قطرات تشكيل في طرف الإبرة فورا عند إزالتها. ثم، تعيين معدل تدفق إلى 0.50 مل / ساعة.
2. تحويل المشغل الجهد إلى 12 كيلو فولت.
3. Electrospin حتى الألياف الانحياز أحادى المحور تغطي تماما الفجوة على جامع.
4. تطبيق الغراء على حواف لوحة زجاجية صغيرة ونقل الألياف من جامع الفجوة إلى لوحة زجاج. وضع لوحة زجاجية على رأس قطعة من رقائق الألومنيوم الذي يحتوي على نفس حجم لوحة من الزجاج والارض.
5. ضع جامع حقنة الثاني وفقا لالشكل 3.
6. إرفاق قناع من البلاستيك لضخ حقنة الثانية وضعه 2 مم فوق جامع.
7. إضافة الكومارين 6 في 1٪ (وزن / وزن) إلى PCL حل إذا نانoencapsulation هو desired- وتخلط حتى الحل هو شفافة.
8. تحميل PCL أو PCL / الكومارين 6 الحل في إبرة 5 مل مع إبرة حادة 21 قياس. ضبط مضخة عمودية إلى 0.50 مل / ساعة والأفقي لسحب في 9 مل / ساعة أو في سرعة التقريبية من 1 مم / دقيقة.
9. انتقلت Electrospin حتى القناع تماما تقريبا قبالة جامع، ولكن مع منطقة حافة تزال تحت القناع.

4. الألياف توصيف

1. مكان العينات مع الوجهين شريط موصل إلى مسمار معدني ومعطف مع البلاتين لمدة 40 ثانية باستخدام المغطي تفل في 40 مللي أمبير.
   1. فحص الألياف من خلال المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وفقا لدراساتنا السابقة ^17،18.
   2. جمع الصور في الجهد المتسارع لل15 كيلو فولت.
2. أداء سريع تحويل فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) التحليل على عينة من الألياف منفصلة لقياس محاذاة الألياف. معلومات مفصلة على قياس محاذاة الألياف التي كتبها الاتحاد الفرنسي للتنس يمكن أن يشير رس دراسات سابقة ^19،20.

5. الخلايا الجذعية البذر.

1. تعقيم العينات الألياف عن طريق نقع في محلول الإيثانول 70٪ لمدة 2 ساعة. ثم يغسل الألياف مع الماء المقطر لإزالة أي ملوثات.
2. الحصول ADSCs البشرية وخلايا الثقافة في 25 سم ² قارورة عند 37 درجة مئوية في جو من 95٪ الهواء / 5٪ CO _2. تغيير مستنبت خلية كل يوم ^10.
3. يعرض للتريبسين الخلايا وحساب عدد الخلايا. على وجه التحديد، وإزالة جميع مستنبت من قارورة زراعة الخلايا وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين. ثم يضاف 1 م ^لتر من محلول 0.25٪ التربسين-EDTA (ما قبل الحار في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية) لتغطية أحادي الطبقة الخلية واحتضان القارورة في الحاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-3 دقائق. إضافة 4 مل مستنبت وتغسل جميع الخلايا من السطح قبل pipetting المتوسطة في جميع أنحاء السطح. عشر الطرد المركزي تعليق خلية وإعادة تفريقالبريد بيليه خلية في المتوسط ​​الثقافة. عدد الخلايا عبر عدادة الكريات. البذور حوالي 1 × 10 ⁴ الخلايا إلى سقالة ألياف نانوية وضعها في طبق ğ ثقافة 35 ملم واحتضان لمدة 3 و 7 أيام.
4. خلايا وصمة عار باستخدام ثنائي الأسيتات فلوريسئين (5 ملغ / مل في الأسيتون) (FDA) ثم صورة العينات باستخدام المجهر الفلورسنت. على وجه التحديد، إضافة 100 ميكرولتر من حل FDA إلى الطبق الثقافة واحتضان لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات قبل التصوير الفلورسنت. تحليل التوجه خلية باستخدام برنامج حصيرة-مختبر مخصص بناء على دراساتنا السابقة ^(10).

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، تم تشكيل حصيرة الألياف مع التدرج التنظيمي. ويبين الشكل 3 صور SEM التي اتخذت في مواقع مختلفة على منصة الاعدام ألياف نانوية. نوعيا، فإنه يمكن تحديد أن هناك تطور من الألياف الانحياز أحادى المحور في 0 مم (الشكل 3A) إلى الألياف متنوع...

Discussion

The most critical part of the protocol is generation of the gradient scaffold. It is imperative that the mask covering the collector moves at a constant velocity so there is a gradual change within the fiber scaffold. The correct preparation of PCL solution is also important to ensure electrospinning success. Checking the fiber morphology prior to electrospinning is recommendable, especially after the encapsulation of Coumarin-6, which may require a higher voltage to electrospin correctly.

Fu...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polycaprolactone	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamide	Fisher Chemical	D-119-1
Dichloromethane	Fisher Chemical	AC61093-1000
Coumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
Adipose Derived Stem Cells	Cellular engineering Technologies	HMSC.AD-100
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	26140-111
Fluorescein Diacetate	Sigma-Aldrich	F7378
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25300-054
α-Modified Eagle's Medium	Invitrogen	a10490-01
Acetone	Fisher Scientific	s25120a
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	10010023
Glass Slides	VWR international, LLC	101412-842
Syringe Pump	Fisher Scientific	14-831-200	Single syringe
Ultrasonic Cleaner	Branson	1510
High Voltage DC Power Supply	Gamma High Voltage Research	ES30
Scanning Electron Microscope	FEI	Nova 2300
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Imager 2