جيل من الليمفاوي المجهرية الدقيقة وكشف لهم تأثير Proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء

Summary

الخلية المجهرية الدقيقة-تسليط غشاء (النواب) هي الحويصلات البيولوجية النشطة التي يمكن أن تكون معزولة وآثارها المرضية في جسم المريض التحقيق في نماذج مختلفة. نحن هنا تصف طريقة لتوليد النواب المستمدة من الخلايا الليمفاوية T (LMPS) ولإظهار تأثير proapoptotic على الخلايا الظهارية مجرى الهواء.

Abstract

تزايد الاهتمام في الأدوار البيولوجية للخلية الحويصلات المشتقة من الغشاء في التواصل خلية خلية في السنوات الأخيرة. المجهرية الدقيقة (النواب) هي واحدة مثل هذا النوع من الحويصلات، والتي تتراوح قطرها من 0.1 ميكرومتر إلى 1 ميكرومتر، وتسلط عادة من غشاء البلازما من خلايا حقيقية النواة تمر تفعيل أو موت الخلايا المبرمج. نحن هنا وصف جيل من T-المستمدة اللمفاويات المجهرية الدقيقة (LMPS) من خلايا CEM T أفكارك حفز مع أكتينوميسين يتم عزل D. LMPS من خلال عملية الطرد المركزي التفاضلي متعددة الخطوات، وتميزت باستخدام التدفق الخلوي. ويعرض هذا البروتوكول أيضا في الموقع موت الخلايا طريقة الكشف لإثبات تأثير proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية الشعب الهوائية المستمدة من الماوس الابتدائية الجهاز التنفسي إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. الطرق الموضحة في هذه الوثيقة توفر الإجراء استنساخه لعزل كميات وفيرة من LMPS من الخلايا الليمفاوية أفكارك في المختبر. المستمدة LMPSفي هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم خصائص النماذج المرض المختلفة، والصيدلة وعلم السموم الاختبار. وبالنظر إلى أن ظهارة الهوائية تقدم حاجز مادي وعملي وقائي بين البيئة الخارجية والأنسجة الكامنة، واستخدام إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية بدلا من خطوط الخلايا الظهارية خلد يوفر نموذج فعال للتحقيقات التي تتطلب الأنسجة المسالك الهوائية.

Introduction

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

Protocol

ملاحظة: ذكر C57BL / 6 الفئران (5-7 أسابيع من العمر) هي من نهر تشارلز مختبرات الدولية، وشركة (سانت المستمر، كيبيك، كندا.) والتلاعب بها وفقا لبروتوكولات التي وافق عليها سانت جوستين جنة رعاية الحيوان CHU. توفر الماوس إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية مصدر جيد للخلايا الظهارية القصبية الأولية للتحقيق في الآثار proapoptotic من LMPS على الخلايا الظهارية. يصف هذا البروتوكول الجيل في المختبر من LMPS، وكذلك وسيلة للكشف عن الخلايا الظهارية أفكارك على LMPS المعاملة إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية. ويتكون هذا البروتوكول من 3 أقسام.

1. LMPS الإنتاج وتوصيف

ملاحظة: لمنع التلوث، وضمان أن جميع المواد المستخدمة في هذه التجربة هي معقمة أو تعقيمها. تنفيذ جميع الخطوات في RT في خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة، ما لم يذكر خلاف ذلك.

1.1) تحفيز ومجموعة من النواب⁹

1. ذوبان الجليد قسامة من 10 مليون خلية CEM T في 37 ° C حمام الماء. تمييع في 10 مل قبل حرارة متوسطة للدم مثل X-VIVO، في 15 مل أنبوب معقم والطرد المركزي في 200 GX 5 دقائق خالية من المصل. نضح خلايا وطاف resuspend في 5 مل المتوسطة قبل تحسنت.
2. نقل الخلايا إلى ثقافة قارورة الأنسجة T75 (للخلايا تعليق) مع 15 مل المتوسطة المكونة للدم قبل تحسنت مثل X-VIVO واحتضان لمدة 4 أيام في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
3. بعد 4 أيام، ونقل جميع مستنبت والخلايا في قارورة الثقافة الأنسجة T175 تحتوي على 100 مل متوسطة جديدة. مواصلة احتضان الخلايا لمدة 72 ساعة في ظل نفس الظروف حتى أنها قد نمت لكثافة من 2 مليون خلية / مل.
4. تقسيم بالتساوي بين خلايا أربعة قوارير T175 تحتوي كل منها على 150 مل متوسطة جديدة ومواصلة زراعة الخلايا حتى نمت الخلايا (ما يقرب من 48 ساعة حضانة) إلى كثافة من 2 مليون / مل.
5. جمع الخلايا من كل قارورة بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend 300 × 10 ⁶ خلايا في قارورة T175 جديدة تحتوي على 150 مل متوسطة جديدة، للحفاظ على / كثافة الخلية مل من 2 مليون.
6. إضافة أكتينوميسين D (الذائبة في DMSO في 2 ملغ / مل) إلى متوسطة في تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل واحتضان لمدة 24 ساعة.
7. نقل جميع مستنبت إلى 50 مل أنابيب مخروطية وتدور أسفل الخلايا في 750 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1،500 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة شظايا خلية كبيرة.
8. نقل طاف في زجاجة 250 مل ونابذة فائقة السرعة في 12،000 x ج لمدة 50 دقيقة. تجاهل طاف وجمع الكريات.
9. غسل الكريات LMPS المخصب مع PBS 40 مل العقيمة في أنبوب 50 مل بواسطة الطرد المركزي عند 12،000 x ج لمدة 50 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين.
10. جمع غسل الماضي طاف. سيتم استخدامها كما السيطرة على السيارة. تعليق الكريات LMPS في 1مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى 1.5 مل microtube العقيمة. قسامة وتخزين LMPS معزولة في -80 ° C (لتجنب متعددة دورات خالية من ذوبان الجليد).

1.2) توصيف النواب عن طريق تحليل FACS ⁴

1. إعداد 2 عينات من العازلة annexin (1)، مع وأخرى دون CaCl _2: HEPES 10 ملي، كلوريد الصوديوم 140 ملم، زائد أو ناقص 5 ملي CaCl _2.
2. تصفية عازلة annexin وFACS السائل غمد تدفق باستخدام فلتر 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات.
3. تمييع 1 ميكرولتر من LMPS في 44 ميكرولتر من العازلة annexin مع 5 ملي CaCl ₂ في أنبوب FACS. إعداد أنبوب آخر مع 1 ميكرولتر من LMPS في 44 ميكرولتر من العازلة annexin دون CaCl ₂ (المراقبة السلبية).
4. إضافة 5 ميكرولتر من annexinV-Cy5 في كل أنبوب وتخلط جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام. وقف رد فعل عن طريق تمييع المزيج مع 400 ميكرولتر من FACS السائل غمد التدفق في كل أنبوب.
5. إضافة 10 ميكرولتر (200،000 الخرز) من 7 ميكرون العد BEAتعليق DS كمعيار داخلي في كل أنبوب للحصول على عدد المطلق.
6. إنشاء بوابات الحجم النسبي (FSC-H، PMT E00، تسجيل النطاق) وتحبب النسبي (SSC-H، PMT 325، تسجيل نطاق و) مؤامرة نقطة على تدفق عداد الكريات باستخدام معايرة حجم حبات الفلورسنت من 1 ميكرون (بوابة 1) و عد حبات البوابة في 7 ميكرون (بوابة 2).
7. تحليل عينة LMPS على FSC-H / SSC-H مؤامرة باستخدام البوابات التي أقامتها وFL-4 قناة لannexin (PMT 765، تسجيل نطاق و) مؤامرة نقطة، من خلال الحصول على إشارة حتى يتم التوصل إلى 20،000 الخرز العد والفرز في بوابة 2.
8. تحديد الأحداث annexinV الإيجابية للLMPS في المخزن annexin تحتوي على CaCl _2، ومن ثم طرح أحداث LMPS في المخزن annexin دون CaCl ₂ (المراقبة السلبية).
9. حساب العدد المطلق للنواب على أساس المعادلة التالية:
   

1.3) تحديد النائب Protein التركيز (برادفورد الفحص)

1. إعداد 5 التخفيفات المسلسل من مستوى البروتين 1،25-20 ميكروغرام / مل. ماصة 800 ميكرولتر من كل حل معيار وعينة في أنبوب اختبار نظيف في مكررة. إضافة 200 ميكرولتر من برادفورد صبغ كاشف لكل أنبوب. تخلط جيدا، ثم يحضن في RT لمدة 5 دقائق.
2. قياس الامتصاصية في 595 نانومتر. تحديد تركيز البروتين من LMPS باستخدام الانحدار الخطي للمنحنى القياسية.

2. إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائية وعلاج LMPS

ملاحظة: إيلاء اهتمام خاص لبيئة العمل معقمة، وجو معقم و مطهر إعداد الحلول والوسيلة المستخدمة في التجارب التالية. لإعداد الشفاء التام المتوسطة، إضافة 1 مل من الأنسجة شفاء ملاحق المتوسطة مع المصل (إذابة على الجليد) إلى 100 مل الأنسجة شفاء متوسطة وتخلط جيدا.

2.1) إعداد الشعبي إإكسبلنتس الأنسجة

1. قبل زراعة، خدش 6 مجالات 1 سم ²كل على حافة سطح كل 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة بشفرة المشرط. معطف كل خدش 100 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع 2 مل من محلول طلاء صحن الثقافة، واحتضان الطبق في ترطيب CO ₂ حاضنة O / N عند 37 درجة مئوية. فراغ نضح الحل الفائض وملء الطبق مع 15 مل من الأنسجة غسل المتوسطة.
2. الموت ببطء C57BL / 6 الفئران (5 إلى 7 أسابيع من العمر) من خلال CO ₂ الاستنشاق وفقا لبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة الأخلاق رعاية الحيوان.
3. جو معقم و مطهر تشريح أنسجة الرئة مع مشرط، دومون منتاش السوبر غرامة، ومقص جراحي. إزالة حمة والأوعية الدموية بعناية. وضع أنسجة الرئة في الجليد الباردة الأنسجة غسل المتوسطة لنقلها إلى المختبر، إن وجدت.
4. وعلاوة على ذلك تشريح القصبات الهوائية غارقة في الأنسجة غسل المتوسطة وفصل القصبات الهوائية التي يبلغ قطرها بين 1 و 2.5 ملم من أنسجة الرئة الطرفية. أنسجة الشعب الهوائية شريحة إلى ~ 5 ملم حلقات الشعب الهوائية سميكة مع مشرط.
5. تستخدم حركة شفط مع ملقط معقم microdissecting منحنية لالتقاط شظايا الشعب الهوائية ووضعها على المناطق خدش من الأطباق.
6. إزالة الأنسجة غسل المتوسطة، واحتضان شظايا في RT ل~ 5 دقائق للسماح لهم الانضمام إلى الأطباق.
7. إضافة 10 مل من الشفاء التام من متوسطة إلى كل طبق ووضعها في جو يسيطر غرفة الحاضنة وحدات. مسح الغرفة مع ارتفاع خليط الغاز O ₂ (70٪ O _2، 25٪ N ₂ و 5٪ CO _2،). وضع الغرفة في حاضنة المدارية الفوق والتخلص منه في 37 ° C. يهز الغرفة لمدة 24 ساعة على 10 دورة في الدقيقة للسماح المتوسط ​​وتتدفق بشكل متقطع على مدى شظايا.
8. بعد 24 ساعة الحضانة، ومراقبة إإكسبلنتس الأنسجة تحت المجهر الضوء على النقيض من المرحلة مقلوب. حدد إإكسبلنتس الشعب الهوائية مع كاملة، حركة الشعر الجميلة وظهارة الشعب الهوائية حية للعلاج LMPS اللاحقة.

2.2) LMPS العلاج

1. إعداد الكامل المتوسطة النمو على النحو التالي: المكملات المتوسطة النمو ذوبان الجليد مع المصل والخلايا الليفية المانع على الجليد. إضافة 1 مل من مكملات النمو المتوسطة مع المصل و 200 ميكرولتر المانع الخلايا الليفية إلى 100 مل من النمو المتوسطة. تخلط جيدا. تدفئة متوسطة النمو الكامل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل استخدامها.
2. تمييع LMPS المعزولة في أنبوب إيبندورف العقيمة جديد مع PBS لإعداد الأوراق المالية LMPS بتركيز 800 ميكروغرام / مل.
3. إضافة 0.5 مل من النمو الكامل متوسطة إلى كل بئر من 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة.
4. نقل إإكسبلنتس الشعب الهوائية المختارة مع ملقط microdissecting المنحنية من البروتوكول السابق (القسم 2.1) إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة.
5. تسمية لوحة الثقافة بشكل مناسب لتحديد الآبار العلاج LMPS وآبار المراقبة. إضافة 25 ميكرولتر الأسهم LMPS في كل معاملة LMPS جيدا (لتركيز النهائي من 40 ميكروغرام / مل) و 25 مركبة سيطرة ميكرولتر (انظر LMP الصورة الإنتاج) إلى آبار المراقبة.
6. تستمر الحضانة في جو يسيطر غرفة الحاضنة وحدات عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف.
7. بعد 24 ساعة، ويغسل إإكسبلنتس 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، والشروع في الخطوة التالية (4٪ بارافورمالدهيد [PFA] تثبيت).

3. المرضية فحص

3.1) إعداد الحلول التالية قبل الشروع في خطوات التالي

1. إعداد 1X العازلة في برنامج تلفزيوني عن طريق خلط 137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا ₂ هبو _4، 1.76 ملي KH ₂ PO _4، ودرجة الحموضة 7.4.
2. لإعداد 4٪ PFA، حل 20 غراما من PFA في 400 مل من الماء، يسخن في 60 درجة مئوية مع التحريك. إضافة بضع قطرات من 10 M هيدروكسيد الصوديوم لمسح الحل. التالي إضافة 1X PBS عازلة وضبط مستوى الصوت إلى 500 مل ودرجة الحموضة إلى 7.4. تصفية وقسامة. تخزين في -20 ° C.
3. إعداد الكواشف الجفاف أو الإماهة التالية: 100٪، 90٪، 70٪، 50٪ من الإيثانول والزيلين.

e_step "> 3.2) يزدرع التثبيت والأنسجة القسم Deparaffinization

1. وضع كل يزدرع في أنبوب microcentrifuge المسمى مع 1.5 مل من 4٪ PFA واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. شطف إإكسبلنتس مرتين مع 1X PBS.
2. يذوى إإكسبلنتس من خلال سلسلة الكحول (70٪ من الإيثانول: 3 مرات كل 30 دقيقة، 90٪ من الإيثانول: 2 مرات 30 دقيقة لكل منهما؛ 100٪ من الإيثانول: 3 مرات كل 30 دقيقة، ثم زيلين: 3 مرات 20 دقيقة لكل منهما). تنفيذ جميع الخطوات في RT في غطاء الدخان.
3. إطمر إإكسبلنتس الأنسجة في البارافين في 58 ° C في الفرن. إعداد 5 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة باستخدام مشراح الدوارة.
4. تعويم المقاطع في 56 ° C حمام الماء، ومن ثم تحميل المقاطع على الشرائح النسيجية المسمى. ضع الشرائح في رفوف تلطيخ اليدوية وجافة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. السماح للشرائح لتبرد في RT.
5. تراجع الرفوف في 4 أطباق وصمة عار على التوالي التي تحتوي على الزيلين لمدة 10 دقيقة كل لإزالة البارافين. تراجع الرفوف في سلسلة الإيثانول لإزالة زيلين: 100٪، ثم 95٪، الEN 80٪، ثم 70٪ ثم 50٪ من الإيثانول (5 دقائق لكل خطوة). شطف الرفوف مع ماء الصنبور لمدة 5 دقائق لإزالة الايثانول.

3.3) الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ

1. مواصلة العمل مع أقسام الأنسجة الثابتة. وضع رف في طبق تلطيخ مليئة الهيماتوكسيلين ماير لمدة 15 دقيقة. شطف رف مع ماء الصنبور لإزالة الهيماتوكسيلين لمدة 20 دقيقة.
2. وضع في الماء المقطر لمدة 30 sec.Place في 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية. ضع في يوزين Y طبق الحل تلطيخ لمدة 1 دقيقة. يذوى الى 2 التغييرات من الايثانول 95٪، و 100٪ من الإيثانول، والزيلين لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
3. إجراء فحص سريع تحت المجهر للتأكد من أن تتم إزالة يوزين الزائد. ضع 2 إلى 3 قطرات من تصاعد المتوسطة (فيشر SP15-100) على كل شريحة، ثم تغطية مع غطاء زجاجي.

3.4) في الموقع خلية كشف الإعدام: الفحص TUNEL

1. قبل بداية، وإعداد بروتين K الحل العمل: 20 ميكروغرام / مل في10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4.
2. كرر الخطوات من 1 إلى 5 من القسم 3.2 (تثبيت النباتى والأنسجة قسم deparaffinization). شطف الشرائح مع منزوع الأيونات H ₂ O.
3. تزج الشرائح مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة. استنزاف PBS الزائد. احتضان أقسام الأنسجة لمدة 30 دقيقة في RT مع بروتين K الحل العمل. شطف الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني 1X.
4. إجراء فحص TUNEL كما هو موضح في دليل التعليمات من موت الخلايا كشف عدة. جبل باستخدام تصاعد المتوسطة، وساترة يدويا مع coverslips الزجاج.
5. تحليل العينات تحت المجهر الضوئي. استخدام صورة برو 4.5 لتحليل الخلايا أفكارك في اللون البني.

النتائج

واتسمت LMPS مع annexin V تلطيخ ¹⁰ بواسطة خلية مضان تنشيط الفرز (FACS) تحليل وبوابات باستخدام 1 ميكرومتر الخرز التي كانت 97٪ من النواب (≤1 ميكرون) annexin-V-Cy5 الإيجابي (الشكل 1A و 1B). عادة، تم الحصول على حوالي 2.5 ملغ من LMPS بعد هذا البروتوكول. إإكسبلنتس الأنسجة الشعب الهوائ?...

Discussion

النواب هي سطاء نشطة من عبر الحديث بين الخلايا ودراستهم واعد في العديد من مجالات العلم. وقدمت هذه الدراسة ¹¹ بروتوكول مفصلة لفي المختبر جيل واسع النطاق للLMPS المستمدة من خط الخلية T أفكارك. هؤلاء النواب تعبر عن ذخيرة كبيرة من الجزيئات اللمفاويات وتورط بيولوجي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E