JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي صغيرة أطلق سراحهم من الخلايا، من اقل من 10 عينات مصل ميكرولتر. هذا النهج تلتف الحاجة إلى تنبيذ فائق، لا يتطلب سوى بضع دقائق من الوقت الفحص، وتمكن من عزل المركبات الكهربائية من عينات من وحدات التخزين محدودة.

Abstract

الحويصلات خارج الخلية (المركبات الكهربائية)، والجسيمات غشائي المفرج عنهم من أنواع مختلفة من الخلايا، عقد إمكانات كبيرة للتطبيقات السريرية. أنها تحتوي على حمض النووي والبروتين البضائع ويتم الاعتراف بشكل متزايد كوسيلة للتواصل بين الخلايا التي يستخدمها كلا حقيقي النواة والخلايا بدائيات النوى. ولكن نظرا لصغر حجمها، والبروتوكولات الحالية لعزل المركبات الكهربائية وغالبا ما تكون مضيعة للوقت، مرهقة، وتتطلب كميات عينة كبيرة ومعدات باهظة الثمن، مثل نابذة فائقة السرعة. لمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير منصة immunoaffinity الورقية لفصل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية التي هي سهلة وفعالة، ويتطلب كميات عينة منخفضة تصل إلى 10 ميكرولتر. عينات بيولوجية يمكن pipetted مباشرة على مناطق رقة الاختبار التي تم تعديلها كيميائيا مع جزيئات القبض التي لديها قابلية عالية لعلامات محددة سطح EV. ونحن تحقق من صحة الفحص باستخدام المجهر الإلكتروني (SEM)، الورقية انزيم مرتبط immunosorbenر المقايسات (P-ELISA)، وتحليل Transcriptome على. ستمكن هذه الأجهزة الورقية دراسة المركبات الكهربائية في العيادة وإعداد البحوث للمساعدة في دفع فهمنا من وظائف EV في الصحة والمرض.

Introduction

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membranous particles that range in size from 40 nm to 5,000 nm and are released actively by many cell types via different biogenesis routes1-9. They contain unique and selected subsets of DNA, RNA, proteins, and surface markers from parental cells. Their involvement in a variety of cellular processes, such as intercellular communication10, immunity modulation11, angiogenesis12, metastasis12, chemoresistance13, and the development of eye diseases9, is increasingly recognized and has spurred a great interest in their utility in diagnostic, prognostic, therapeutic, and basic biology applications.

EVs can be classically categorized as exosomes, microvesicles, apoptotic bodies, oncosomes, ectosomes, microparticles, telerosomes, prostatosomes, cardiosomes, and vexosomes, etc., based on their biogenesis or cellular origin. For example, exosomes are formed in multivesicular bodies, whereas microvesicles are generated by budding directly from plasma membrane and apoptotic vesicles are from apoptotic or necrotic cells. However, the nomenclature is still under refined, partly due to a lack of thorough understanding and characterization of EVs. Several methods have been developed to purify EVs, including ultracentrifugation14, ultrafiltration15, magnetic beads16, polymeric precipitation17-19, and microfluidic techniques20-22. The most common procedure to purify EVs involves a series of centrifugations and/or filtration to remove large debris and other cellular contaminants, followed by a final high-speed ultracentrifugation, a process that is expensive, tedious, and nonspecific14,23,24. Unfortunately, technological need for rapid and reliable isolation of EVs with satisfactory purity and efficiency is not yet met.

We have developed a paper-based immunoaffinity device that provides a simple, time- and cost-saving, yet efficient way to isolate and characterize subgroups of EVs22. Cellulose paper cut into a defined shape can be arranged and laminated using two plastic sheets with registered through-holes. In contrast to the general strategy to define the fluid boundary in paper-based devices by printing hydrophobic wax or polymers25-27, these laminated paper patterns are resistant to many organic liquids, including ethanol. Paper test zones are chemically modified to provide stable and dense coverage of capture molecules (e.g., target-specific antibodies) that have high affinity to specific surface markers on EV subgroups. Biological samples can be pipetted directly onto the paper test zones, and purified EVs are retained after rinse steps. Characterization of isolated EVs can be performed by SEM, ELISA, and transcriptomic analysis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ويرد المخطط العام لإجراء عملية في الشكل 1. عن طريق الممارسات الأخلاقية، فإننا جمع عينات الدم من الأصحاء، والحصول على عينات الخلط المائي من المرضى من خلال تايتشونغ مستشفى المحاربين القدماء العام (TCVGH)، تايتشونغ، تايوان تحت افق IRB البروتوكولات ( IRB TCVGH رقم CF11213-1).

1. تصنيع أجهزة ورقة

  1. قطع ورقة اللوني الى دوائر من 5 ملم في القطر لتوفير نفس التخطيط باعتباره وحة microtiter 96-جيدا. ساندويتش هذه القطع الورقية مع ورقة من البوليستيرين مع اثنين من المسجلين من خلال الثقوب، وصفح.
  2. تعديل الأجهزة الورق باستخدام طريقة الاقتران الكيميائية موضح في الخطوات التالية 28.
    1. علاج أجهزة رقة مع البلازما الأكسجين (100 ميغاواط، 1٪ أكسجين و 30 ثانية) في غرفة البلازما.
      تنبيه: يجب أن تؤخذ بحذر خاص عند العمل مع trimethoxysilane 3-mercaptopropyl وN--γ maleimidobutyryloxy succinimideاستر (GMBS)، لأنها على حد سواء الرطوبة حساسة وسامة. ارتداء القفازات الواقية وتجنب استنشاق أو ملامسة الجلد والعينين. إبقاء زجاجة الأسهم مغلقة بإحكام والسماح لها لكي تتوازن لRT قبل فتح لتجنب تكثيف الماء. بدلا من ذلك، فتح زجاجة الأسهم داخل كيس القفازات مليئة النيتروجين أو مربع. قسامة في قوارير صغيرة لتجنب افتتاح المتكرر لزجاجة الأسهم.
    2. على الفور احتضان تعامل الأجهزة الورق في 4٪ (ت / ت) حل 3-mercaptopropyl trimethoxysilane في الإيثانول (200 دليل) لمدة 30 دقيقة.
    3. شطف أجهزة رقة مع الايثانول واحتضان لهم مع 0.01 مكرومول / GMBS مل في الإيثانول لمدة 15 دقيقة.
    4. شطف مع الإيثانول (200 دليل)، واحتضان الأجهزة الورق مع 10 ميكروغرام / مل حل أفيدين في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تخزينها في 4 ° C إذا لزم الأمر، واستخدام في غضون 4 أسابيع.
  3. الرطب كل مناطق رقة الاختبار مع 10 ميكرولتر PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 3 × 10 دقيقة قبل اكتشاف 10 ميكرولتر المعقدة البيروكسيديز جزيئات القبض لمدة 3 × 10 دقيقة. استخدام مكافحة CD63 الأجسام المضادة (20 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA وبنسبة 0.09٪ (ث / ت) أزيد الصوديوم) أو annexin V (1:20، / V V V في annexin العازلة ملزمة) كما جزيئات الالتقاط.
  4. شطف غير منضم الأجسام المضادة أو annexin V مكافحة CD63 الجزيئات باستخدام 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V حلول العازلة ملزمة لمدة 3 × 1 دقيقة، على التوالي.

2. المصل ومائي فكاهة جمع العينات وتجهيز

  1. جمع المصل.
    1. جمع 10 مل من الدم المحيطي من بزل الوريد في أنابيب فصل المصل وعكس بلطف أنبوب خمس مرات. تعيين أنبوب في وضع عمودي والانتظار لمدة 30 دقيقة.
    2. الطرد المركزي في 1،200 × ز لمدة 15 دقيقة. نقل المصل من الطبقة العليا إلى أنبوب نظيفة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 3،000 × ز لمدة 30 دقيقة.
    3. تمرير طاف خلال 0.8 ميكرون سن الفيلثالثا. الحفاظ على عينة في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. مائي جمع النكتة: جمع عينات من الخلط المائي من المرضى الذين شخصت من قبل طبيب عيون مباشرة من خلال الإجراءات وعينات متجر الغازية في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3. عزل خارج الخلية الحويصلات

  1. عينات بقعة على كل منطقة اختبار الورق بمعدل 5 ميكرولتر / دقيقة.
  2. شطف المركبات الكهربائية غير منضم مع 10 ميكرولتر المقابلة PBS تحتوي على 1٪ (ث / ت) BSA أو annexin V ملزمة حلول عازلة لمدة 3 × 1 دقيقة لأجهزة رقة بين functionalized مع مكافحة CD63 الأجسام المضادة أو annexin V الجزيئات، على التوالي. إجراء المقايسات المصب التالية.

4. المصب الفحص مثال 1: Electromicrographs الضوئي

  1. إصلاح المركبات الكهربائية القبض على بين functionalized منطقة اختبار الورق باستخدام 10 ميكرولتر 0.5 × تثبيتي Karnovsky لمدة 10 دقيقة.
  2. شطف العينات مع PBS واسعا ل2 × 5 دقائق.
  3. يذوىالعينات مع احق الايثانول 35٪ لمدة 10 دقيقة، والإيثانول 50٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 70٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول 95٪ لمدة 2 × 10 دقيقة، والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 4 × 10 دقيقة.
  4. تنتقد الجافة وتفل معطف العينات مع البلاديوم / الذهب، ودراسة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح تعمل في انخفاض تسارع الإلكترون الجهد (~ 5 كيلو فولت).

5. المصب الفحص مثال 2: ELISA الورقية

  1. إضافة إلى حل 5 ميكرولتر تحتوي على مكافحة CD9 الأجسام المضادة الأولية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني على كل منطقة الاختبار التي تحتوي على المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. انتظر 1 دقيقة.
  2. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  3. إضافة 5 ميكرولتر محلول يحتوي الفجل البيروكسيديز (HRP) -linked الضد الثانوية في 1: 1،000 التخفيف في برنامج تلفزيوني وانتظر 1 دقيقة.
  4. شطف عينات مع 30 مل PBS اهتزت عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  5. إضافة 5 ميكرولتر الركيزة اللونية التي تحتوي على نسبة 1: 1 حجم الهيدروجين بيروكسيد لد 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) والمسح الضوئي باستخدام ماسحة سطح المكتب.

6. المصب الفحص مثال 3: عزل الحمض النووي الريبي

  1. تزج العينات في 35 ميكرولتر من المساعدات العزلة RNA القائم على بوفيدون و 265 ميكرولتر من تحلل / العازلة ملزمة لليز المركبات الكهربائية التي تم التقاطها. دوامة بقوة.
  2. إضافة 30 ميكرولتر جناسة المنصوص عليها في عدة العزلة إلى المحللة. دوامة بقوة وضعت على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام حمض فصل الفينول كلوروفورم موضح في الخطوات التالية.
    1. تأخذ 330 ميكرولتر من الفينول كلوروفورم من الطبقة السفلى من القمقم وإضافة إلى جناسة / المحللة. دوامة بقوة.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل (العليا) المرحلة المائية لأنبوب نظيفة ونلاحظ حجم إزالتها.
  4. ترسيب الحمض النووي الريبي مجموع مع الإيثانول بنسبة 100٪ من حجم هذا هو 1.25 أضعاف حجم المرحلة المائية إزالتها في الخطوة السابقة والتعاونllect الحمض النووي الريبي في حل شطف مسخن إلى 95 ° C.
  5. التركيز ومواصلة تنقية RNA باستخدام طقم تنظيف RNA فقا لبروتوكول تصنيع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

قدرة الجهاز رقة لعزل مجموعات فرعية من المركبات الكهربائية تعتمد بكفاءة عند التحقق حساس ونوعي لها من علامات سطح EV. ويتحقق تعديل مستقر للألياف ورقية مع جزيئات التقاط باستخدام أفيدين-البيوتين الكيمياء كما هو موضح في أماكن أخرى 28-30. ويتم تقييم فعالية تصريف المواد ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية لعزل الناجحة لمجموعات فرعية من الحويصلات خارج الخلية هي: 1) اختيار جيد من الورق. 2) تغطية مستقرة وعالية من جزيئات القبض على السطح من ألياف ورقية. 3) التعامل الصحيح مع العينات. و4) ممارسة النظافة المختبر العام.

وقد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المجلس الوطني للعلوم تايوان grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) وNSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC)، والمحاربين القدامى عامة المستشفيات ونظام جامعة تايوان برنامج البحوث المشتركة (CC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chromatography PaperGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 cellulose paper
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617This chemical reacts with water and moisture and should be applied inside a nitrogen-filled glove bag. Avoid eye and skin contact. Do not breathe fumes or inhale vapors.
EthanolFisher ScientificBP2818Absolute, 200 Proof, molecular biology grade
Bovine serum albumin (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001Often referred to as Cohn fraction V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS is an amine-to-sulfhydryl crosslinker. GMBS is moisture-sensitive.
AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin has 4 binding sites for biotin and its pI value is 6.3, which is more neutral than native avidin
Biotinylated mouse anti-human anti-CD63Ancell215-030clone AHN16.1/46-4-5
biotinylated annexin VBD Biosciences556418Annxin V has a high affinity for phosphatidylserine (PS)
Primary anti-CD9 and secondary antibodySystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1The secondary antibody is horseradish peroxidise-conjugated
Serum separation tubesBD Biosciences367991Clot activator and gel for serum separation
Annexin V binding bufferBD Biosciences55645410x; dilute to 1x prior to use.
TMB substrate reagent setBD Biosciences555214The set contains hydrogen peroxide and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
RNA isolation kitLife TechnologiesAM1560MirVana RNA isolation kit
Polyvinylpyrrolidone-based RNA isolation aidLife TechnologiesAM9690Plant RNA isolation aid contains polyvinylpyrrolidone (PVP) that binds to polysaccharides.
RNA cleanup kitQiagen Inc.74004MinElute RNA cleanup kit is designed for purification of up to 45 μg RNA.
Plasma chamberMarch InstrumentsPX-250
Scanning electron microscopeHitachi Ltd.S-4300
Desktop scannerHewlett-Packard CompanyPhotosmart B1108-bit color images were captured. Cameras and smart phones may be also used.
Image-record systemJ&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX816-bit fluroscence images were captured. Fluroscence microscopes may be also used.

References

  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

98 exosomes microfluidics ELISA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved