بنقل العدوى إلى خلايا RAW264.7 مع luciferase المراسل مراسل جين

Summary

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Abstract

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Introduction

ترنسفكأيشن من الأحماض النووية في خلايا لديه تطبيق متنوعة في مجال البحث العلمي. ومن الأمثلة على ذلك (1) الجينات مراسل لدراسة دور العناصر الجينات المختلفة في التعبير الجيني، (2) البلازميدات التعبير البروتين إلى بإفراط البروتين من الفائدة، و (3) الصغيرة بالتدخل RNA إلى downregulate التعبير الجيني. عن طريق التلاعب في مستوى التعبير عن جينات معينة وقياس الأثر التفاضلي لهذه التلاعبات، يمكن للباحثين استدلال على وظائف الجينات في النظم البيولوجية الذي تم اختياره. ليس كل طرائق نقل توفر نفس الكفاءة ترنسفكأيشن، وحتى نفس الأسلوب ترنسفكأيشن لا transfect جميع أنواع الخلايا على قدم المساواة ^1. وبالتالي، تم وضع طرائق نقل مختلفة مثل طريقة فوسفات الكالسيوم، DEAE ديكستران، الموجبة الدهون ترنسفكأيشن، الموجبة البوليمر ترنسفكأيشن غير الدهون، Electroporation لل، وnucleofection ^2،3.

ترنسفكأيشن إلى الضامة هو ESPEمن الصعب السيما يرجع ذلك إلى حقيقة أن الضامة هي البالعات المهنية التي هي حساسة جدا للمواد الأجنبية بما في ذلك البكتيريا المستمدة (الميثيلي) DNA ^(4). إدخال DNA الخارجية ينشط مسارا-تول مثل مستقبلات 9 (TLR9) مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات وأكسيد النيتريك ^5،6. هذه الضامة تفعيلها قد تكون أقل استجابة للعلاج أن ينوي الباحثون إلى دراسة.

لدينا مختبر transfects بشكل روتيني خط خلية بلعم RAW264.7 مع الجينات luciferase المراسل، ونحن قد وضعت البروتوكول الذي هو قوي بما يكفي ليكون إشارة luciferase المراسل أعلى بكثير من الخلفية، ولكن أيضا لطيف بما فيه الكفاية لالضامة أن تظل في حالة الراحة الخاصة بهم. تم تقييم السلوكيات من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق الجينات مراسل يراعة، luciferase المراسل إيواء منطقة المروج من IκBζ (pGL3- IκBζ). وupregulated IκBζ التعبير من قبل جدار الخلية البكتيرية مكون الشفةopolyssacharide (LPS) ^7،8، وdownregulated من قبل خلوى المضادة للالتهابات، انترلوكين 10 (IL-10) ^8. لحساب التباين بين ترنسفكأيشن الآبار، شاركنا في transfect البلازميد التحكم التي تحتوي على Renilla luciferase المراسل الجين (على سبيل المثال، phRL-TK) لأغراض التطبيع. هو الأمثل بروتوكول صفها بعد اختبار معايير مختلفة بما في ذلك توقيت ترنسفكأيشن، نوع من الكواشف ترنسفكأيشن، وكميات من الكواشف ترنسفكأيشن وDNA البلازميد، وكذلك نسبة كاشف ترنسفكأيشن إلى البلازميد الحمض النووي. الكواشف ترنسفكأيشن اثنين الواردة في هذا البروتوكول هي (1) كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس و(2) بروتين / القائم البوليامين كاشف ترنسفكأيشن.

Protocol

1. البلازميد DNA تنقية

1. استخراج DNA البلازميد باستخدام طقم maxiprep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. و resuspend DNA البلازميد في 500 ميكرولتر من TE العازلة.
2. إجراء الفينول: الكلوروفورم: أيزو أميلي استخراج الكحول والأيسوبروبانول هطول الأمطار لإزالة الملوثات البكتيرية المتبقية. وجود LPS يتداخل مع ترنسفكأيشن ^9.
   1. إضافة 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1، ودرجة الحموضة 8) إلى DNA البلازميد ويهز بقوة لمدة 15 ثانية. الفينول يسبب حروقا جلدية شديدة وغير مخدر حتى لا يشعر حروق دائما حتى لا يكون هناك ضرر شديد. أداء الفينول: استخراج أيزو أميلي في غطاء الدخان وتوخي الحذر: الكلوروفورم.
3. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق على RT. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نقل 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا في أنبوب جديد 1.5 مل المجموعة.
4. إضافة 350 ميكرولتر من TE العازلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقل المرحلة العضوية. هزة بقوة لمدة 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية إلى نفس 1.5 مل أنبوب جمع.
5. إضافة 70 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) وتخلط جيدا. إضافة 700 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان 10 دقيقة في RT. الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 10 minat 4 ° C. إزالة طاف.
6. إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لبيليه. عينات دوامة لخلط وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف. الحمض النووي هو في بيليه.
7. فتح غطاء الأنبوب والهواء الجاف بيليه في RT ل5-10 دقيقة. وينبغي أن تصبح بيليه شفافة. إضافة 500 ميكرولتر من TE عازلة لresuspend الكرية DNA. الحرارة في 50-60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إلى حل بيليه DNA.
8. قياس الامتصاصية في 260 نانومتر (A260) و 280 نانومتر (A280) مع مطياف. حساب تركيز الحمض النووي عن طريق ضرب قيمة A260 بنسبة 50 نانوغرام / ميكرولتر. تقييم نوعية الحمض النووي عن طريق calculatinز نسبة A260 / A280. DNA ذات جودة عالية يجب أن تعطي نسبة A260 / A280 من 1،8-2،0.

2. زراعة خلية والبذر

1. خلايا RAW264.7 الثقافة في DMEM تستكمل مع 9٪ مصل العجل الجنين (DMEM / 9٪ FCS) في 37 ° C، 5٪ CO ₂ الحاضنة. خلال كل مرور، فصل الخلايا من لوحة من قبل pipetting المستمر باستخدام ماصة باستور. مرور الخلايا كل أيام 2، والبذور 1،5-2٬000٬000 الخلايا على طبق نسيج الثقافة 10 سم يعامل سهم. ذوبان الجليد مخزون جديد من الخلايا كل 5-6 أسابيع.
2. في يوم ترنسفكأيشن، البذور 200،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 24-جيدا في حجم 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في C حاضنة 37 درجة.
3. خلايا Transfect إما مع كاشف القائم على الدهون (الخطوة 3.1) أو كاشف يستند البوليامين البروتين / (الخطوة 3.2).

3. ترنسفكأيشن

1. الدهون على أساس ترنسفكأيشن:
   1. الاحماء reagen ترنسفكأيشنر لRT في الظلام. الاحماء المصل خالية المتوسطة وDMEM / 9٪ FCS إلى 37 درجة مئوية.
   2. إضافة 0.5 ميكروغرام من DNA البلازميد إلى 50 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة في أنبوب 1.5 مل. إضافة 2 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع طرف ماصة تحت سطح السائل. دوامة لمدة 6 ثانية.
   3. ترك الخليط كاشف / DNA في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة.
   4. أثناء الحضانة 30 دقيقة، وإزالة وسائل الاعلام من البئر وإضافة 250 ميكرولتر من جديد FCS DMEM / 9٪ إلى كل بئر.
   5. بعد 30 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS إلى خليط كاشف / DNA. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
   6. إضافة 300 ميكرولتر من خليط المخفف إلى كل بئر. احتضان لمدة 2-4 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   7. إزالة الحل ترنسفكأيشن وإضافة 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان لمدة 24 - 48 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO ₂ الحاضنة قبل التحفيز الخلية.
2. بروتين / القائم البوليامين ترنسفكأيشن:
   1. الاحماء المصل خاليةالمتوسطة وDMEM / 9٪ FCS إلى 37 درجة مئوية.
   2. إضافة 0.75 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 18.75 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة. دوامة لفترة وجيزة لخلط. في احتضان RT لمدة 5 دقائق. إضافة 0.5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / DNA ميكرولتر في كاشف transfected المخفف. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
   3. أثناء الحضانة 10 دقيقة، وإزالة وسائل الإعلام من كل بئر من 24 لوحة جيدا وإضافة 250 ميكرولتر الطازجة DMEM / 9٪ FCS إلى كل بئر.
   4. بعد 10 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS في خليط كاشف / DNA.
   5. إضافة 270 ميكرولتر من خليط المخفف إلى البئر. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ حاضنة لل2-4 ساعة.
   6. إزالة الحل ترنسفكأيشن وإضافة 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان لمدة 24 - 48 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO ₂ الحاضنة.

4. تحفيز الخلية وluciferase المراسل الفحص

1. استبدال وسائل الإعلام في البئر مع 250 ميكرولتر من الطازجة DMEM / 9٪ FCS.
2. إضافة 50 ميكرولتر من LPS أو LPS + IL-10 عند التراكيز المطلوبة إلى البئر. العودة إلى لوحة 37 ° C، 5٪ CO ₂ الحاضنة. تحفيز ل2-6 ساعة.
3. إزالة حل التحفيز بواسطة الشفط، ويغسل مع الثلج الباردة PBS، وإضافة 200 ميكرولتر من 1X السلبي الاحتياطي تحلل. موسيقى الروك في RT لمدة 30 دقيقة. كشط ونقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب وإزالة الحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
4. نقل 40 ميكرولتر من المحللة تطهيرها (طاف) إلى الأبيض، واضح أسفل لوحة 96-جيدا لتحديد إشارات luciferase المراسل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
5. قراءة إشارة luciferase المراسل مع luminometer عبر ضوء كامل الطيف المرئي.

5. تحليل البيانات

1. حساب يراعة: نسبة Renilla بقسمة القيم الفردية من يراعة luciferase من قيم Renilla luciferase المراسل من كل بئر.
2. حساب التغير أضعاف بقسمة يراعة: نسبة Renilla من معاملة حسنة من قبلأن البئر غير المعالجة.

النتائج

الشكل 1 يقارن كفاءة ترنسفكأيشن من اثنين من الكواشف ترنسفكأيشن في RAW264.7. أعطى كاشف القائم على الدهون عادة معدل ترنسفكأيشن حوالي 25٪، في حين أدى ترنسفكأيشن أساس البوليامين البروتين / في حوالي 5٪ كفاءة (الشكل 1A). وقد لوحظ الفرق في الكفاءة ترنسفكأيشن أيضا ?...

Discussion

وصف بروتوكول هنا لا يركز فقط على كفاءة ترنسفكأيشن، ولكن يهدف إلى تحقيق التوازن بين الكفاءة والحفاظ على الدول الفسيولوجية للخلايا. على وجه التحديد، نجحت إجراءاتنا في التقليل من سمية ترنسفكأيشن الكاشف وتعظيم إشارة luciferase المراسل.

...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal bovine serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5x Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910