الحقن في العضل وإلى جانب لوحات السيارات نهاية: نهج المناظير لمكوك الراسمات مباشرة إلى الخلايا العصبية للسيارات

Summary

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Abstract

الأمراض التي تؤثر على سلامة الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي هي من بين الحالات العصبية الأكثر إضعافا. على مدى العقود الماضية، وقد وفرت تطوير عدة نماذج حيوانية من هذه الاضطرابات العصبية والعضلية المجتمع العلمي مع سيناريوهات العلاجية المختلفة التي تهدف إلى تأخير أو عكس تطور هذه الشروط. من خلال الاستفادة من آلية الوراء من الخلايا العصبية، واحدة من هذه الطرق كان لاستهداف عضلات الهيكل العظمي لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في النخاع الشوكي المقابلة. على الرغم من مرة واحدة واعدة، وقد أعاق نجاح نهج تسليم هذا الجين من قبل عدد دون المستوى الأمثل من الخلايا العصبية الحركية transduced فقد أظهرت حتى الآن أن تحقق. لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق متخصصة للغاية على الجهاز العضلي والهيكل العظمي التي هي على اتصال مباشر متشابك إلى الحبل الشوكي α الخلايا العصبية الحركية. في هذا الصدد، من المهم أن نلاحظ أنه حتى الآن، والجهود المبذولة لretrogradelyوقدمت الجينات نقل إلى الخلايا العصبية الحركية من دون الإشارة إلى موقع المنطقة MEP في العضلات المستهدفة. هنا، نحن تصف بروتوكول بسيطة 1) للكشف عن الموقع الدقيق للأعضاء البرلمان الأوروبي على سطح عضلات الهيكل العظمي و2) لاستخدام هذه المعلومات لتوجيه تسليم العضلي واللاحق النقل إلى الوراء الأمثل لاستشفاف الوراء في الخلايا العصبية الحركية. نأمل الاستفادة من نتائج هذه التجارب تتبع في إجراء المزيد من الدراسات إلى التحقيق النقل إلى الوراء من الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري الحبل من خلال استهداف أعضاء البرلمان الأوروبي.

Introduction

فقدان السيطرة على حركة الطوعية التي تنتج من الحالات العصبية مثل مرض العصبون الحركي وspinal- وكذلك دوشين ضمور العضلات هو شرط المنهكة التي لديها تأثير دائم عالية وطويلة على الحياة كل يوم من الأفراد المتضررين. على مدى العقد الماضي، الجهود البحثية التي تهدف إلى وقف أو على الأقل تأخير الآثار الضارة لهذه الأمراض العصبية والعضلية وكانت أولوية بالنسبة لكثير من الأطباء والعلماء في جميع أنحاء العالم. وفي هذا الصدد، فإن الجيل الأخير من النماذج الحيوانية التي تحاكي هذه الأمراض العصبية والعضلية دورا أساسيا في الحصول على رؤى أساسية في آليات الفسيولوجية الكامنة وراء تطور وتقدم هذه الشروط ^13/01. علاج هذه الأمراض العصبية والعضلية تتطلب الوصول المباشر إلى الحبل الشوكي ويمكن أن يتحقق عن طريق الحقن في النخاع الشوكي ^14،15. واستهدفت التطورات الحديثة في مجال العلاج الجيني أيضا العضلات المخططة العليا والأطراف السفلية لمكوك الجينات العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α التي تقع داخل القرن البطني للنخاع الشوكي ^1،9-13. ومع ذلك، فقد فشلت هذه الاستراتيجية مرة واحدة واعدة لتحسين نتائج هذه الظروف العصبية. في حين أنه من الإنصاف أن نستنتج أن هذه النتائج السيئة يمكن أن يكون، جزئيا على الأقل، أن يعزى إلى انخفاض فعالية هذه الجينات الواقية، لا يمكن استبعاد فعالية منخفضة من هذه الأساليب توصيل الجينات.

لوحات السيارات نهاية (البرلمان الأوروبي) هي مناطق المتخصصة التابعة للmyofibres الهيكل العظمي التي يتم تحريكها من قبل المحطات محور عصبي من الألياف الحركية المحيطية الكبيرة القادمة من α الخلايا العصبية الحركية. معا، والنهايات الطرفية الألياف العصبية وأعضاء البرلمان الأوروبي تشكل الوصل العصبي العضلي، أي الموقع حيث يتم تشغيلها النبضات متشابك من قبل الافراج تقدمي من الناقل العصبي، الأستيل كولين. الأهم، والعلاقة بين الألياف العصبية الطرفية وأعضاء البرلمان الأوروبي هي ثنائية المباشرهtional، على الرغم من أن محركات مختلفة هي المسؤولة عن نقل الجزيئات وعضيات نحو وكذلك بعيدا عن العصبية somata ^16-18. في ضوء هذه الاعتبارات التشريحية، ويبدو أن أعضاء البرلمان الأوروبي أن تكون الأهداف المفضلة للتسليم ونقل إلى الوراء لاحق من المادة الوراثية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة. في هذا السياق، فإنه ليس من المستغرب أن نجاح العصبون الحركي تنبيغ يعتمد إلى حد كبير على المسافة بين الحقن العضلي من ناقلات فيروسية وأعضاء البرلمان الأوروبي في العضلة ^19-20. والمثير للدهشة، ومع ذلك، فإن الموقع الدقيق للمناطق MEP على myofibres من الفئران المخبرية والماوس، وهما نوعا من خيار لنموذج الأمراض العصبية والعضلية، لم تكن متاحة حتى وقت قريب.

أنتجنا خرائط شاملة للمنطقة MEP لعدة عضلات forelimb في الفئران والفأر ^21-22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أظهرنا تفاصيل تنظيم ص MEPegion لعدة عضلات hindlimb الماوس ²³ ونحن في صدد تحليل ملامح البرلمان الأوروبي على hindlimb الفئران. في أيدينا، أعطى الحقن في العضل من استشفاف الوراء الموجهة إلى مناطق MEP بأكملها في هذه العضلات يؤدي إلى الخلايا العصبية الحركية أكثر المسمى التي تغطي قطاعات الحبل الشوكي أكثر مما ذكر سابقا. هنا نقدم البروتوكول الذي تم تطويره على مدى السنوات القليلة الماضية للكشف عن مكان وجود أعضاء البرلمان الأوروبي على السطح الخارجي، وكذلك في جميع أنحاء عمق hindlimb وforelimb العضلات في كل من الفأر والجرذ.

Protocol

جميع الإجراءات التجريبية وصفها هنا امتثلت لجنة الرعاية وأخلاقيات الحيوان في نيو ساوث ويلز أستراليا وتم إجراء وفقا الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا لوائح التجارب على الحيوانات. يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات في هذا البروتوكول وفقا لمتطلبات لجنة رعاية الحيوان والأخلاق ذات الصلة.

1. أستيل الكيمو تلطيخ

1. إعداد خليط التفاعل أستيل
   1. إضافة 290 ملغ من Acetylthiocholine يوديد إلى 200 مل من 0.1 M الفوسفات عازلة (PB). الاختلاط مع محرك مغناطيسي في 900 دورة في الدقيقة.
   2. إضافة 600 ملغ من الجلايسين مع التحريك المستمر.
   3. إضافة ببطء 420 ملغ من كبريتات النحاس لخليط التفاعل مع التحريك المستمر حتى يذوب المنتج تماما.
2. إزالة الجلد على الذبيحة (تم الحصول عليها من خلال تقاسم الأنسجة) عن طريق شقوقفي الجلد من الفئران perfused لأو الماوس، واستيعاب الجلد من منطقة الرقبة وتجعله الماضي قدميها. تأكد من أن لفافة تغطي كل العضلات إما إزالتها أو مثقبة بشكل كبير في ضمان التعرض وافرة من الألياف العضلية إلى محلول التفاعل.
3. تزج كامل الجسم أو أحد أعضائه من الاهتمام الى خليط التفاعل واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية.
4. غسل الذبيحة لمدة 2 دقيقة في الماء المقطر. ملاحظة: في هذه المرحلة، والعضلات يحمل يمكن أن ينظر إلى تلوين الأزرق واللوحات نهاية المحرك (البرلمان الأوروبي)، وبقع بيضاء.
5. فضح الذبيحة إلى 10٪ محلول كبريتات الأمونيوم لمدة 3-5 ثانية.
   ملاحظة: إن الألياف العضلية تتحول بسرعة البني وسوف البرلمان الأوروبي يمكن ملاحظتها كنقاط الأرقط الأسود. إذا حدث رد فعل بسرعة كبيرة جدا، وملطخة ألياف العضلات مظلمة جدا التمييز بين أعضاء البرلمان الأوروبي وألياف العضلات حاول استخدام تركيزات أقل من الأمونيوم حل كبريتيد (على سبيل المثال، 5٪). في وقت رد الفعل للحصول علىعلى النقيض الأمثل بين أعضاء البرلمان الأوروبي وألياف العضلات يختلف من عينة واحدة إلى أخرى. وبالتالي فإنه من الصعب تحديد وقت التعرض المحدد للكاشف. وينبغي رصد رد الفعل بشكل وثيق، وتوقفت عند يعتبر على النقيض كافية.
6. غسل الذبيحة مرتين، مع الإثارة في الماء المقطر، ويربت بلطف الذبيحة الجافة.
7. صورة كل من النواحي الجانبية وسطي من أطرافهم، وضمان أن أعضاء البرلمان الأوروبي لجميع عضلات الفائدة يتم التقاطها.

2. العضلي الحقن في لوحات السيارات نهاية

1. سحب بال micropipettes الزجاج مع مجتذب micropipette (استخدام بال micropipettes متدرج مع الغطاسون يوصى). بمساعدة المجهر تشريح، وكسر نصائح من بال micropipettes مع زوج من ملقط مثل أن القطر الداخلي من التجويف من micropipette ما يقرب من 0.5 مم.
2. التأكد من أن جميع الأدوات الجراحية المستخدمة يتم تعقيمها طازجة والعشرينفي منطقة العمليات الجراحية غير المعقمة.
3. شغل بال micropipettes مع الفلوري الذهب (5٪ في الماء المقطر).
4. حمل خدر في الحيوان في غرفة الاستقراء مع Isofluorane (4٪ في O _2). تحقق من وجود المنعكس التقويمي وضمان عدم وجوده قبل إزالته من غرفة تحريض. تأمين مخروط الأنف على الخطم من الفئران وتسليم Isofluorane (2٪ في O ₂₎ لصيانة التخدير. قرصة أصابع الحيوان وتلمس بلطف العين الحيوان لضمان أن كلا من انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية غائبة. ملاحظة: يمكن أيضا مزيج من الكيتامين وxylazil أن تستخدم (80 و 10 ملغ / كغ على التوالي، تسليم البريتونى). الكيتامين هو الجدول 8 ("التحكم") المخدرات والبروتوكولات اللازمة المرتبطة بشراء واستخدام وتخزين والتخلص من المخدرات سيتعين الالتزام بها.
5. تطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف العينين أثناء الإجراء.
6. حلق رأطرافهم argeted واستخدام الشاش لمسح منطقة حلق مع ثلاثة الدعك بالتناوب من بالكلورهيكسيدين و 70٪ كحول. نقل الحيوان إلى منطقة العمليات الجراحية.
7. وضع الحيوان على underpad نظيفة ووضعها بشكل مناسب لضمان سهولة الوصول إلى العضلات المستهدفة (ق).
8. استخدام زوج من ملقط مع قبضة الأسنان لرفع الجلد فوق العضلة المستهدفة بعيدا عن العضلات الكامنة وإجراء شق في الجلد مع مقص جراحي. تأكد من أن شق كبير بما فيه الكفاية لفضح تماما العضلات (ق) من الفائدة. ضمان وجود الحد الأدنى من تعطيل لفافة.
9. استخدام الصور MEP لتبديل عقليا موقع وشكل المنطقة MEP على العضلات (ق).
   ملاحظة: A شعر علامة غرامة يمكن أن تساعد على إعادة إنتاج المنطقة MEP من صورة على العضلات (ق) من الفائدة.
10. أداء الحقن متعددة على طول كامل المنطقة MEP (لالفلوري الذهب، 3-4 حقن 1-2 ميكرولتر كل لياليhould معها يكون كافيا). يمسح برفق العضلات (ق) لإزالة أي تسرب.
11. جلب طرفي الجلد قطعي قريبة من بعضها البعض مع ملقط كليلة وإغلاق الجرح مع لقطات الجراحية. تسلل 0.1 مل بوبيفاكايين (0.5٪ في الماء) (أو التخدير الموضعي الأخرى) على طول فترة كاملة من الجرح.
12. تحويل آلة التخدير قبالة ومراقبة الحيوانات حتى أنه قد تعافت تماما من التخدير.
13. الانتظار لمدة 14 يوما بين إدارة الحقن داخل العضلات ونضح من الحيوانات.

3. Perfusions

1. إدارة جرعة قاتلة من حل الصوديوم بنتوباربيتون (على سبيل المثال Lethabarb، 150 ملغ / كلغ) للحيوان عن طريق الحقن داخل الصفاق.
   1. عن كثب مراقبة الحيوانات حتى يتم التوصل إلى مستوى عميق من التخدير، وهو ما أكدته غياب انسحاب دواسة وردود الفعل القرنية.
2. وضع الحيوان على ظهرها على لوحة تشريح وضعها فوق perfusioن الحوض.
3. استخدام زوج من ملقط مع قبضة الأسنان لرفع الجلد الذي يغطي قاعدة القص. جعل شق الجلد صغير مع زوج من مقص جراحي قوية مباشرة أسفل عظم القص ثم استخدام ملقط لقبضة الغضروف الخنجري من القص. في حين الضغط على الغضروف الخنجري، وتوسيع شق على جانبي تجويف الصدر، من القص إلى الآباط.
4. قطع الحجاب الحاجز لفضح القلب.
   1. حقن 0.ml الهيبارين مباشرة في قمة القلب لمنع تخثر الدم.
   2. قطع قمة للسماح للادراج قنية إلى البطين الأيسر، ومن ثم المشبك بسرعة قنية في مكان مع المعونة من haemostat.
   3. إجراء شق في الأذين الأيمن مع زوج من مقص غرامة والبدء فورا مضخة تحوي. يروي مع 0.1 M PB حتى السائل المتدفق من الأذين نقدمه مجانا تقريبا من الدم ولون الكبد يصبح البني الفاتح. ثم، يروي مع المحاليلنشوئها من امتصاص العرق (4٪ في 0.1 M PB) حتى الجسم كله من الحيوان يصبح جامدة.

4. الحبل الشوكي العنقي تشريح والتحضير للعلم الأنسجة

1. وضع الذبيحة على البطن.
2. قطع الجلد في خط الوسط في الجسم مع مشرط وتعكس ذلك من قاعدة الجمجمة إلى مستوى العظم الحرقفي.
3. قطع طريق وتعكس عضلات مجاورة للفقرة للكشف عن الجانب الظهري للعمود الفقري.
4. تعريف العملية الشائكة العظمية أطلس، والجزء الثاني عنق الرحم (أي، C2)، وإزالته مع زوج من رينجرز الجراحية أو ملقط لتحديد الجذر الظهري المقابلة الكامنة.
   1. تحديد جذر C2 الصحيح من خلال تلوين مع علامة شعر دائمة.
   2. إزالة الفقرات التالية واحدا تلو الآخر، وعلامة على الجذور الظهرية اليمنى بالتناوب مع الألوان (أي، C2، C4، C6، وC8 يمكن أن تكون ملونة باللون الأخضر وC3، C5، C7، T1 يمكن أن يكون العقيدored باللون الأزرق).
5. استخدام إبرة جراحية صغيرة (على سبيل المثال، 30 G إبرة قياس) لبلطف بيرس خلال الجافية يغطي الطرف الأدنى من الحبل الشوكي. مع شطبة من الإبرة مواجهة، رفع الجافية بعيدا عن الحبل بينما تتحرك الإبرة rostrally لإجراء شق طولي.
   1. تعكس الجافية.
6. قطع عرضيا الحبل الشوكي إلى كتل واحد أو اثنين من القطاعات بشفرة مشرط جديدة.
   1. ترك شرائح النخاع الشوكي في الموقع، ولكل كتلة، وجعل بعناية علامة إيمانية صغيرة على الجانب الأيسر من كل كتلة مع منتصف الطريق شفرة المشرط بين اثنين من جذور المجاورة. تأكد من أن علامة إيمانية عميقة بما فيه الكفاية من خلال النسيج لتكون مرئية من الناحية البطنية من الكتل. جعل علامة إيمانية في زاوية ما يقرب من 45 درجة مئوية، لافتا سواء الأمامية أو الخلف فيما يتعلق تشريح الحيوان، للمساعدة في توجيه قطاع النسيج بعد تشريح.
7. جمع القطع الفردية في وزجاجات صغيرة علامات واضحة تحتوي على محلول بارافورمالدهيد (4٪ في 0.1 M PB) وترك في RT O / N.
8. نقل كتل في زجاجات نظيفة، وصفت بوضوح يحتوي على محلول السكروز (30٪ في 0.1 M PB) والحفاظ على 4 درجات مئوية لمدة يومين على الأقل.
9. وضع شرائح في البرد قوالب وغطوها تجميد الأنسجة المتوسطة. لإعداد النسيجي الطولي، توجيه الكتل مع الجانب الظهري مواجهة واستخدام علامة إيمانية لتوجيه كتلة في البرد قوالب.
10. تجميد البرد قوالب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، وقطع مع ناظم البرد في 50 أقسام ميكرومتر سميكة. ملاحظة: المقاطع يمكن تركيبه مباشرة على شرائح المجهر التصاق وتترك لتجف O / N. بدلا من ذلك، المقاطع يمكن طرح في لوحات 48-جيدا مليئة 0.1 M PB والتي شنت في وقت لاحق باستخدام علامة إيمانية لتوجيه أقسام الأنسجة على الشرائح.

5. قطني العمود الفقري المشاركطريق تشريح والتحضير للعلم الأنسجة

1. وضع الذبيحة على انها الظهر.
2. إجراء شق خط الوسط على طول البطن من الحيوان وإزالة الأحشاء. تشريح خارج عضلات جدار البطن الخلفي لفضح الجانب البطني من العمود الفقري.
3. تحديد موقع القصير الذيلية الأكثر الصدري والمجاورة T13 فقرة لها حيث يخرج الجذر البطني T13 العظام.
   1. على التوالي إزالة واحدا تلو الآخر منقاري اثنين أو ثلاثة فقرات لT13 (أي، T12، T11، وإذا لزم الأمر، T10) مع رينجرز الجراحية الدقيقة لمتابعة الجذر البطني T13 حتى نقطة دخوله في الجانب البطني من الحبل البطني و وضع علامة عليه مع علامة شعر دائمة.
   2. من هذه النقطة، كرر نفس الإجراء لتحديد مكان وجود نقاط الدخول جذر بطني لL1، L2، L3، L4، L5، L6 وS1، والتلوين لهم بالتناوب مع الألوان.
4. اتبع الإجراء نفسه كما هو موضح في القسم 4،5 حتي 4،10 للومشريط تشريح الحبل الشوكي.

النتائج

أستيل تلطيخ النسيجية يكشف موقع لوحات نهاية المحرك عبر عرض عضلات الشكل 1 يوضح نتائج هذا تلطيخ أجريت على الفئران forelimb كله. ويقترح لتحسين تركيز المحلول كبريتيد الأمونيوم (على سبيل المثال، 5-7٪ بدلا من 10٪)، وكذلك في وقت مغمورة العينة في حل إذا كان تلوين الخلف?...

Discussion

استهداف العضلي ونقل إلى الوراء لاحق من الجينات المحورة العلاجية إلى الخلايا العصبية الحركية المقابلة α لعلاج تجريبي للحالة العصبية والعضلية ليست استراتيجية جديدة. على سبيل المثال، تم استخدام هذا الأسلوب تسليم تأخير الضمور العضلي العصبي في مراحل مختلفة من تطور الم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluted to 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µl	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	accompanied with plungers
Acetylthiocholine Iodide	Sigma Life Science	A5751-25G
Copper(II) Sulfate Anhydrous	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Tissue-Tek O.C.T Compound	Sakura Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin	Life Technologies	D-3312	Diliuted in distilled water
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurane inhalation vapour
Autoclip 9 mm Wound Clips	Texas Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Australia) Pty Ltd.	LETHA450
Formaldehyde Solution	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus glass slides	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Ammonium Sulphide	Sigma-Aldrich	A1952	Diluted to 10%
Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)	Astrazenca		Diluted to 0.25%