قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Summary

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Abstract

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Introduction

قوة الذرية المجهر (AFM) يولد صورة لسطح عن طريق المسح الضوئي عبر منطقة من العينة باستخدام ناتئ مع طرف حاد جدا ^1. حركة ناتئ المسابير طوبولوجيا سطح العينة. وقد تم تطبيق AFM على نطاق واسع لجزيئات البيولوجية - بما في ذلك البروتينات والحمض النووي، والأغشية، نظرا لتنوعها في تحليل عينات الثابتة في الهواء أو دولة شبه الأم في السائل ^2-5.

وبصرف النظر عن قدرتها التصوير عالية الدقة في نطاق نانومتر، يعمل ناتئ AFM بمثابة ربيع للتحقيق القوات التفاعل (التصاق والتنافر) والخواص الميكانيكية للعينة ^5،6. هذا هو المعروف باسم قوة التحليل الطيفي. في هذا الوضع، وتحقيق نهج أول العينة ويمارس قوة على ذلك، ومن ثم تراجع حتى أنه يفقد الاتصال مع العينة (الشكل 1A). تظهر منحنيات ولدت القوة كدالة للمسافة ناتئ لكل من التطبيقصرصور وتراجع. العديد من الخصائص بما في ذلك معامل المرونة لقياس صلابة من المواد، وقوات التصاق يمكن أن تستمد.

طبقات ثنائية الدهون المعتمدة هي الأغشية البيولوجية نموذج الكذب على رأس دعم قوي - عادة الميكا، والزجاج البورسليكات، السيليكا تنصهر فيها، أو المؤكسد السيليكون ^7. انهم مستعدون باستخدام تقنيات مختلفة مثل ترسب حويصلة، طريقة انجميور-بلودجيت وتدور طلاء ^8،9. وقد استخدم التصوير AFM لمتابعة تشكيل هذه طبقات ثنائية بدعم ^10، وتحقيق مختلف الهياكل التي شكلتها أغشية تركيبات مختلفة ^11-15.

أداء قوة التحليل الطيفي على النتائج طبقات ثنائية المعتمدة في قمة في منحنى النهج. هذه الذروة تشير إلى القوة اللازمة لاختراق طبقة ثنائية، ويسمى القوة الخارقة. كما يمكن قياس سمك طبقة ثنائية باستخدام منحنى القوة ^6. قوة اختراق نموذجية من طبقات ثنائيةتتراوح ما بين 1-50 ن ن ^6. هذه الخصائص تعتمد على التعبئة الدهون (المرحلة سائل أو هلام) وهيكل (أسيل طول السلسلة ودرجة التشبع) وتعديلها من قبل غشاء نشط وكلاء ^16. وقد شرحت النظرية وراء القطيعة ¹⁷ والمعلمات تجريبية أخرى مثل النعومة ناتئ، دائرة نصف قطرها طرف وسرعة نهج تؤثر أيضا على قوة اختراق ^15،16،18. وقد استخدمت القوة الطيفي لتحليل خصائص مراحل مختلفة الدهون ^11،19، والتغيرات التي تعتمد على تكوين ^12،20، فضلا عن آثار الجزيئات الحيوية الأخرى، مثل الببتيدات، على استقرار الغشاء ^21.

التوجه شقة من طبقات ثنائية معتمد من المفيد للجمع بين AFM مع وسائل أخرى مثل مأكل سطح الرنين ²² ومضان المجهر ^11،19 لتوصيف هيكل وخصائص الأغشية بشكل أفضل.

هذا بروتو فيديو تفصيليوالمقصود العقيد لإعداد طبقات ثنائية الدهون تدعم استغلال ترسب الحويصلة وتحليلها مع AFM وقوة التحليل الطيفي. في حين الحويصلات من مختلف الأحجام يمكن استخدامها لإعداد طبقات ثنائية، ويركز هذا البروتوكول على الحويصلات unilamellar الصغيرة والكبيرة. وتميزت بدعم طبقات ثنائية تلك المرحلة تفصل في أمر السائل (L _س) والسائلة المختلين (L _د) مراحل ^11،15. ويتكون الغشاء من دى oleoyl-فسفاتيديل (DOPC)، سفينغوميالين (SM)، والكولسترول (شول) في 2: 2: 1 النسبة. هذه نماذج تكوين الطوافات الدهنية، والتي من المقترح أن تتصرف كما منابر هامة للاتجار البروتين والفرز، مما يشير الى الخلايا والعمليات الخلوية الأخرى ^23،24.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد المعتمدة الدهن طبقات ثنائية (SLB) ^11،12،21

1. إعداد خليط الدهن وعديد الصفاحات الحويصلة معلقات
   1. إعداد المخازن التالية مسبقا.
      1. إعداد العازلة PBS بتركيزات 2.7 ملي بوكل، 1.5 ملي KH ₂ PO _4، 8 ملي نا ₂ هبو _4، و 137 ملي كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2.
      2. إعداد SLB (بدعم طبقة ثنائية الدهن) عازلة في تركيزات 150 ملي كلوريد الصوديوم، و 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4.
      3. تحضير محلول 1 M CaCl _2.
   2. حل الدهون التالية في الكلوروفورم في التركيز المطلوب: على سبيل المثال، دى oleoyl-فسفاتيديل (DOPC) في 25 ملغ / مل، سفينغوميالين (SM) في 25 ملغ / مل والكولسترول (شول) في 10 ملغ / مل.
   3. خذ 18.38 ميكرولتر من DOPC، 17.10 ميكرولتر من SM و11،30 ميكرولتر من تشول لجعل حل مع 1 ملغ من الدهون الكلية في 2: 2: 1 DOPC: نسبة المولي تشول: SM. تختلف أحجام وفقا لذلك على أساس بغية دراسته واقرارهntrations من نسبة الدهون في المعدة و1.1.2. ومع ذلك، والحفاظ على نسبة المولي في 2: 2: 1 DOPC: SM: تشول، وتغيير نسبة المولي وتغيير خصائص المرحلة من غشاء ^25.
   4. مزيج الحل تماما من قبل vortexing. إضافة صبغة الفلورسنت شحمي في 0.05 مول٪ إذا كان أحد يرغب في رؤية طبقة ثنائية بواسطة المجهر مضان.
      ملاحظة: عائلة dialkylcarbocyanines سلسلة طويلة، كما فعلت، الجاذبة وديو تمتد مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، ويمكن استخدامها بشكل مثالي لتسمية الأغشية الدهنية. بدلا من ذلك، والدهون fluorescently المسمى، مثل رودامين-فسفاتيديل إيثانولامين أو BODIPY الكولسترول يمكن استخدامها. في أي حال، يجب أن يكون الأمثل للتركيز الصبغة وفقا لإعداد المجهر، مع الأخذ في الاعتبار أن تركيزات عالية من fluorophore بد أن الدهون يمكن تغيير سلوك الدهون ^19.
   5. تجفيف قبالة الكلوروفورم باستخدام N ₂ الغاز (أو أي غاز خامل المتاحة مثل هارون وقال).
   6. مزيد تي الجافانه خليط الدهن تحت فراغ لا يقل عن 1 ساعة.
      ملاحظة: إذا تخزين هذا الخليط الدهون، تطهير الهواء مع غاز خامل (N _2، AR أو و) وتخزينها في -20 ° C. قسامة الدهون في والكلوروفورم الزائدة في قوارير صغيرة بنية اللون. تجفيفها بطريقة مماثلة لخليط الدهن، محل الهواء مع غاز خامل (N _2، AR أو و) وتخزينها في -20 ° C.
   7. حل الدهون المجففة في المخزن برنامج تلفزيوني إلى تركيز من 10 ملغ / مل.
   8. دوامة الخليط بقوة لمدة 20 ثانية إلى 1 دقيقة للحصول على تعليق غائم، التي تحتوي على حويصلات عديد الصفاحات. تأكد من أن ليست هناك أفلام الدهون العالقة على جانبي القارورة.
   9. توزيع هذا التعليق في 10 مكل (1 ملغ من الدهون يجعل 10 قسامات).
   10. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
2. إعداد Unilamellar الحويصلات
   ملاحظة: أحجام مختلفة من الحويصلات unilamellar يمكن إعداد باستخدام طريقة صوتنة أو طريقة قذف. يستخدم صوتنة الصورةاوند الطاقة للتحريض على الخليط وفصل طبقات تعليق عديد الصفاحات. ويدل على ذلك توضيح لتعليق ضبابي. القوات قذف الحويصلات عديد الصفاحات لتمرير من خلال مرشح غشاء مع حجم المسام واضح.
   1. الطريقة صوتنة
      1. أخذ 10 ميكرولتر من تعليق الدهون عديد الصفاحات وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة SLB.
      2. نقل الخليط الصغيرة (2 مل) قوارير زجاجية توج وختم مع parafilm.
      3. يصوتن الخليط في درجة حرارة الغرفة في sonicator الحمام لمدة 10 دقيقة أو حتى يصبح من الواضح أن تسفر الحويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي، أقل من 50 نانومتر في القطر).
   2. قذف الطريقة
      1. أخذ 10 ميكرولتر من تعليق الدهون عديد الصفاحات وإضافة 150 ميكرولتر من العازلة SLB.
      2. نقل تعليق في أنبوب المبردة.
      3. تجميد تعليق الدهون التي غمرت أنبوب المبردة لبضع ثوان في النيتروجين السائل.
      4. ذوبان الجليدالدهون التعليق من غمر أنبوب المبردة في حمام مائي عند درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية لمدة بضع دقائق. كرر الخطوات تجميد أذاب 10 مرات على الأقل.
      5. من أجل قذف تعليق الدهون، واستخدام غشاء البولي مع 200 نانومتر حجم المسام (أحجام المسام الأخرى المتاحة مثل، 100 نانومتر أو 400 نانومتر) وقذف التجاري الجهاز ^26.
         ملاحظة: في الوقت الراهن، هناك نوعان من الأجهزة الطارد متاحة تجاريا: الطارد يدوي متوفر للكميات صغيرة (200 ميكرولتر لبضع مل). في هذه الحالة، هو مقذوف العينة من خلال الغشاء عن طريق دفع يدويا تعليق ذهابا وإيابا بين اثنين من الحقن. اعتمادا على الشركة المصنعة، سيحتاج قسامات الدهون لتكون جنبا إلى جنب للوصول إلى الحد الأدنى من حجم المجموعة لأعلى. لكميات أكبر (يصل إلى 50 مل) وتستخدم أجهزة أكثر تطورا في الذي أجبر على تعليق من خلال الغشاء البولي باستخدام الغاز المضغوط. انشاء وقذف الظروف يمكن أن تتغير وفقا لوزارة الدفاعايل. الرجوع إلى تعليمات من الشركة المصنعة قبل الاستخدام. يشير هذا البروتوكول إلى الطارد اليدوي لأحجام صغيرة.
      6. تتوازن الطارد في الماء عن طريق تمرير الماء من خلال الطارد. تزج الغشاء في الماء.
      7. وضع الغشاء بين المكابس اثنين وتجميع الجهاز وتتوازن في المخزن، عن طريق تمرير المخزن المؤقت من خلال الطارد، من حقنة واحدة إلى أخرى. هذه الخطوة يسمح يختبر وبالإضافة إلى ذلك التسرب من النظام. إذا كان تسرب، تفكيك وإعادة تجميع ذلك تغيير مرة أخرى الغشاء.
      8. خذ تعليق الدهون باستخدام حقنة واحدة من الطارد ('الجانب القذر').
      9. نعلق حقنة تحتوي على تعليق الدهون في غرفة واحدة وحقنة فارغة على غرفة المتعارضة.
      10. دفع حقنة واحدة على نهاية. تمرير حل من خلال الغشاء وإلى حقنة المعارضة. هذا هو تمرير 1 ^{الحادي والعشرين.}
      11. تمريرها عبر الغشاء ليصبح المجموع 31 مرات هذهأن الحل ينتهي على حقنة المعارضة ('الجانب نظيفة').
          ملاحظة: التحقق من الغشاء بعد البثق. إذا تم كسرها، ثم كانت عملية قذف لم تكن ناجحة وتحتاج إلى أن يتكرر.
      12. إفراغ الحقنة في أنبوب صغير. الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs) مستقرة لمدة 1-2 أيام إذا كان يحتفظ بها في 4 درجات مئوية.
3. إعداد ميكا وCoverslips
   1. غسل coverslips أولا في الماء ثم في الإيثانول. الهواء الجاف.
   2. أخذ أقراص الميكا وتقشر الطبقة الخارجية باستخدام شريط لاصق.
   3. إرفاق القرص الميكا على ساترة. المواد اللاصقة البصرية الشفافة هي الأمثل بحيث يمكن للمرء أن تحقق من طبقات ثنائية مع المجهر مضان.
   4. إرفاق اسطوانات البلاستيك (2.5 سم القطر الخارجي، 2 سم القطر الداخلي، و 0.5 سم ارتفاع) باستخدام البصرية الغراء / الشحوم. تأكد من أن كل شيء مختومة وأن هناك أي تسرب. استخدام الشحوم عند الرغبة في إعادة استخدام اسطوانات لأنها يمكن أن تكون منفصلة بسهولة من عشرالبريد ساترة وغسلها. أبعاد اسطوانات البلاستيكية تعتمد على حجم حامل ناتئ AFM ولابد من تعديل وفقا لذلك.
4. ترسب Unilamellar الحويصلات على دعم قوي
   1. الماصة الحل الحويصلية كله مباشرة على الميكا. إضافة المزيد من عازلة SLB للوصول إلى حجم 300 ميكرولتر.
   2. إضافة 0.9 ميكرولتر من 1 M محلول كلوريد الكالسيوم للوصول إلى تركيز النهائي من 3 ملي كا ^2+.
   3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل. تغطية دائما طبقات ثنائية مع العازلة. سوف نتصل مع فقاعات الهواء، والهواء تدميره. خلال فترة الحضانة، وإضافة المزيد من العازلة إذا لزم الأمر، خصوصا إذا يحتضنها عند ارتفاع درجات الحرارة.
      ملاحظة: تختلف درجات حرارة الحضانة وفقا لخليط من الدهون والمراحل المطلوبة. هناك حاجة إلى فترة حضانة من 10 دقيقة على الأقل لتشكيل طبقات ثنائية المعتمدة، ولكنها قد تكون أطول، اعتمادا على درجة الحرارة والتكوين.
   4. غسلطبقة ثنائية مع الساخن (65 درجة مئوية) العازلة SLB 15-20 مرات لإزالة الكالسيوم والحويصلات غير مدمجة. اتخاذ مزيد من الحذر خلال خطوات الغسيل للحفاظ على طبقة ثنائية تحت العازلة والماصة بلطف حل الغسيل لتجنب تدمير طبقة ثنائية.
   5. طبقات ثنائية باردة معتمدة لدرجة حرارة الغرفة قبل قياسات AFM. وهذا مطلوب لتشكيل مراحل مختلفة من الغشاء وكذلك تقليل الانجراف الحراري في الصك.

2. قياسات القوة الذرية المجهر ^11،12

1. التصوير
   ملاحظة: إجراء القوة الذرية التصوير المجهري في وضع الاتصال أو التنصت واسطة. الصور المدعومة طبقات ثنائية في حل؛ لا تسمح حل لتتبخر تماما حيث سيؤدي ذلك إلى تدمير طبقات ثنائية. باعتبارها واحدة سوف تعمل مع العازلة، يرجى مراعاة احتياطات السلامة في التأكد من أن أي جزء AFM محمي من انسكاب السوائل.
   1. حدد تعزية لينة (أقل من ينصح 0.2 N / م ربيع ثابت) وتركيبها لرانه AFM. اختيار ناتئ صلابة أكثر خطورة لقوة التحليل الطيفي (وسيتم هذا مناقشته لاحقا).
   2. جبل العينة على المسرح AFM وتأكد من أن يتم تشغيل جميع وحدات الاهتزاز والعزل جرا. انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل لكي تتوازن والحد من الانجراف الحراري للنظام. اعتمادا على AFM مجموعة المتابعة، قد تختلف ضبط والتصوير المواصفات. الرجوع إلى دليل الشركة المصنعة.
   3. الاقتراب من العينة مع طرف AFM حتى للإتصال به.
   4. منذ طبقات ثنائية الدهون وعادة ما تكون 4 نانومتر في الطول، واستخدام Z-مجموعة من الصك من شأنها أن تعطي أعلى ض القرار (على سبيل المثال 1،5 ميكرون).
   5. حدد منطقة إلى الصورة. للحصول على لمحة عامة عن طبقة ثنائية الدهون، 50 ميكرون × 50 ميكرون أو 25 ميكرون و× 25 ميكرون المنطقة ستكون نقطة انطلاق جيدة لصورة. إذا ظهرت معالم أصغر، يمكن للمرء الصورة في مساحات أصغر (10 ميكرون × 10 ميكرون، أو 2 × 2 ميكرون ميكرون). اختيار منطقة التصوير يعتمد أيضا على ص العملانجى من الماسح الضوئي كهرضغطية. يرجى الرجوع إلى دليل أداة لهذا الغرض.
   6. كما طبقات ثنائية هشة للغاية، وضبط نقطة مجموعة من غيض AFM أثناء التصوير للحفاظ على القوة في الحد الأدنى وتصحيح الانحراف الحراري، مع الحفاظ على اتصال مع العينة. في وضع الاتصال، والتقليل من نقطة التحديد. في التنصت واسطة، وتحقيق أقصى قدر من نقطة التحديد.
   7. صور عملية من المناسب لكل خط مسح لوظائف التسوية متعدد الحدود. إجراء عملية إزالة خط لاجراء الفحوصات التي تفقد الاتصال مع غشاء باستخدام البرمجيات المملوكة للشركة التصنيع AFM.
2. قوة التحليل الطيفي
   1. معايرة ناتئ اتباع التعليمات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. معايرة تتيح تحويل الإشارة الكهربائية من ثنائيات ضوئية لقوة (الشكل 1B).
      1. معايرة حساسية طرف لقياس انحراف كحركة ض بيزو (في وحدات الطول) بدلا من إشارة كهربائية في فولت. ملاحظة: AFM بالكشف عن التغيرات في انحراف ناتئ باستخدام الليزر تنعكس على الجزء الخلفي من ناتئ. الليزر يصل الضوئي التي يمكن الكشف عن مكانيا موقف بقعة الليزر. تم الكشف عن تغيير في انحراف ناتئ كما ينحني على اتصال مع عينة من هذا الثنائي الضوئي بأنها "انحراف العمودي"، وهذا في وحدات الجهد. منذ يتم نقل ناتئ من قبل ض بيزو، يرتبط انحراف العمودي للحركة في ض بيزو. وتسمى النسبة بين الانحراف الرأسي وض حركة حساسية ويحول الجهد إلى مسافة.
      2. حساب ثابت ناتئ الربيع باستخدام طريقة تردد الضوضاء الحرارية، التي تأسست عادة في البرنامج AFM. في هذه الطريقة، رسم سعة الاهتزاز من الضوضاء فيما يتعلق تيرة التذبذب، وخلق الكثافة الطيفية مؤامرة السلطة. سوف تظهر هذه المؤامرة ذروته حول تردد الرنين. تردد حيث ط السعةق أعظم هو تردد الرنين. تناسب وظيفة Lorentzian حول الذروة لحساب تلقائيا ثابت الربيع من قبل البرنامج. يتم إعطاء بعض الموارد المفيدة لنظرية أسلوب الضوضاء الحرارية في المراجع ^27-30.
   2. بعد التصوير مساحة طبقة ثنائية، حدد 5 ميكرون المنطقة × 5 ميكرون في طبقة ثنائية لأداء قوة التحليل الطيفي.
   3. إعداد AFM بحيث يأخذ منحنيات القوة في 16 × 16 شبكة من تلك المنطقة. هذه النتائج في 256 منحنيات القوة في المنطقة. يجب أن تكون المسافة بين نقطتين المجاورة بما فيه الكفاية لتجنب أن المنطقة غشاء يجري سبر بفارق نقطة واحدة سوف يتزامن مع النقطة التالية. هذا يعتمد على دائرة نصف قطرها طرف. ومن شأن مسافة 100 نانومتر بين نقطتين يكون مثاليا. تقسيم 5 × 5 ميكرون المنطقة ميكرون إلى 16 × 16 شبكة. اعتمادا على حجم المرحلة، يمكن للمرء تحديد منطقة أصغر أو أكبر، ومن ثم ضبط حجم الشبكة وفقا لذلك.
   4. تعيين النزوح ض بيزو ل400 نانومتر. هذا يحدد أقصى مدى من حركة ض بيزو. يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للتأكد من أن ناتئ قد تراجع تماما بعيدا عن عينة بين القياسات.
   5. ضبط سرعة النهج إلى 800 نانومتر / ثانية وسحب السرعة إلى 200 نانومتر / ثانية. استخدام سرعة مقاربة بين 400 إلى 6000 نانومتر / ثانية اعتمادا على تكوين طبقة ثنائية ومرحلة الدهون التي يتعين دراستها ^6،16.
   6. بعد إعداد جميع المعلمات، والحصول على منحنيات القوة، عن طريق الضغط على زر "تشغيل" من البرنامج AFM.
   7. حفظ منحنيات قوة كقوة مقابل منحنيات الطول (مقياس حركة ض بيزو). هذا لا يأخذ بعين الاعتبار الانحناء للناتئ عندما تكون في اتصال مع العينة. خلال خطوة لمعالجة البيانات، والبرمجيات AFM يسمح تصحيح ناتئ الانحناء للحصول على القوة مقابل منحنيات الفصل طرف عينة (الشكل 1C)، والتي سوف تعطي القيم المناسبة لسمك طبقة ثنائية. وعادة ما يتم دمج قيم التصحيح في calibrأوجه، والتي يتم حفظها مع كل منحنى القوة. حساب الفصل طرف عينة عن طريق طرح انحراف الرأسي من حركة بيزو عند نقطة معينة.
      ملاحظة: قمة في منحنى القوة نهج (قيمة القوة وتنخفض حتى إذا كانت الحركة ناتئ لا تزال على اتباع منهج دورة) هي القوة اختراق الغشاء، في حين أن الفرق بين موقف هذه الذروة وموضع نقطة حيث تبدأ القوة لترتفع مرة أخرى يقدم سمك الغشاء.
   8. الحصول على ما لا يقل عن 500 منحنيات القوة لكل حالة للحصول على إحصاءات جيدة. رسم بياني لقيم باستخدام برامج مثل المنشأ أو مطلب، وتناسب رسوم بيانية لتوزيع جاوس للحصول على الذروة وعرض للتوزيع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

طبقات ثنائية بدعم الدهون تتكون من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تم تصويره في AFM (الشكل 2 AC). بسبب تركيبة الدهون، لوحظت SM / تشول الغنية L _O و DOPC الغنية L _د مراحل. يمكن الشخصى ارتفاع من التصوير AFM توفر معلومات هامة عن هيكل الغشاء. من خلال النظر في ملف الارتفاع، ويمكن قي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

SLBs تتألف من DOPC: SM: تشول (2: 2: 1) تشكلت على الميكا بعد الامتزاز الحويصلة وتمزق الناجمة عن كلوريد الكالسيوم. هذه التركيبة الدهنية فصل إلى L _د وL _س مراحل. وأثرى مرحلة L _س في سفينغوميالين والكوليسترول وأقل السائل / أكثر لزوجة (الشكل 1A) من _د مرحلة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200