JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Abstract

ترسيم التركيب الدقيق للخلية مهم لفهم وظيفتها. يمكن أن يكون هذا المشروع شاقة لأنواع الخلايا نادرة تنتشر في جميع أنحاء الأنسجة المصنوعة من أنواع الخلايا المختلفة، مثل الخلايا enteroendocrine من ظهارة الأمعاء. وكانت هذه المجسات الجهاز الهضمي من الطعام والبكتيريا من الصعب دراسة لأنها فرقت بين الخلايا الظهارية الأخرى بنسبة 1: 1000. مؤخرا، تم إنشاؤها الفئران المعدلة وراثيا مراسل لتحديد الخلايا enteroendocrine عن طريق مضان. واحد من هؤلاء هو الببتيد YY-GFP الماوس. باستخدام هذا الفأر، قمنا بتطوير طريقة لربط متحد البؤر والمسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني. أطلقنا على هذه الطريقة cocem3D وتطبيقه لتحديد خلية enteroendocrine محددة في الأنسجة وكشف النقاب عن التركيب الدقيق للخلية في 3D. حل cocem3D غير كافية لتحديد عضيات صغيرة مثل الحويصلات الإفرازية وللتمييز أغشية الخلايا لحجم إعادةndering. Cocem3D يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التركيب الدقيق 3D من أنواع معينة من الخلايا الأخرى في الأنسجة وطنهم.

Introduction

الحياة داخل خلية تحدث في الزمان والمكان. وغالبا ما تتم دراسة التغيرات على مر الزمن باستخدام المجهر مرور الزمن جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير مضان، مثل فائقة الدقة المجهر. الفضاء، ولا سيما ترتيب عضيات داخل الخلية أو الخلية الى خلية التفاعلات، لا يمكن إلا أن تستمد من خلال حساب كامل للبنية الخلية على ما يرام. يمكن حساب شامل لهيكل الخلية غرامة أيضا يجلب الوضوح الى وظيفة الجينوم في الحالات التي يكون فيها الجينوم هو متاح، مثل C. ايليجانس الخيطية 1 أو placozoa tricoplax شقة الملتصقة 2. المسلسل المجهر باجتزاء الإلكترون هو الآن استنساخه وفعالة وقت، وذلك بفضل مهمة أقل تكلفة لتطوير تكنولوجيات المجهر الإلكتروني 3D الآلي، مثل المسلسل كتلة وجه المسح الإلكترون المجهري 3 (SBEM).

الحاجة إلى المعلومات الهيكلية لتوضيح وظيفة واضحة جدا في سل معينأنواع لتر حيث تعتمد الدالة على المادية الخلية الى خلية التفاعلات، مثل الخلايا العصبية، الدبقية، أو الخلايا الظهارية الحسية. نحن مهتمون بشكل خاص في توضيح كيفية transduced إشارات حسية من المواد الغذائية في تجويف الأمعاء إلى إشارة كهربائية أن ينظم في نهاية المطاف السلوكيات مشهي. والدائرة هي معقدة ولكنها تبدأ في جدار الأمعاء حيث تأتي المواد الغذائية في اتصال مع الخلايا الظهارية الحسية، تسمى خلايا enteroendocrine. على عكس الخلايا الظهارية الحسية الأخرى، مثل الخلايا الذوقية، وفرقت الخلايا enteroendocrine في جميع أنحاء ظهارة الأمعاء في نسبة 1-1000 4-7. ونتيجة لذلك، فقد كان من الصعب تحديد ودراسة، ومنذ فترة طويلة أنها كان ينظر فقط كمصدر للهرمونات القناة الهضمية. ولكن مع تطور الفئران مراسل مضان خلية محددة، وظيفة حسية معقدة من هذه الخلايا في الظهور. باستخدام أحد هذه الفئران المراسل، الببتيد YY-GFP (PyyGFP) الماوس، وجدنا أن enteroendocrالمعهد الوطني للإحصاء الخلايا لها ذيل حشوية البارز الذي نحن اسمه neuropod. ظهور neuropods اقترح وظيفة الحفظ في خلية الاتصال إلى الخلية. وبالتالي، فإننا معللة ذلك من خلال توثيق التركيب الدقيق للخلية enteroendocrine، ويمكن أن تستمد وظيفة neuropods.

وكانت الحاجة إلى فهم هيكل ذيلا في زنزانة فرقت التي من الصعب تحديد المبرر الرئيسي لتطوير طريقة للجمع بين المجهري متحد البؤر وSBEM. تم التعرف على خلية ذات الاهتمام باستخدام PyyGFP enteroendocrine خلية محددة الفئران مراسل. سمح لنا طريقة لتوثيق التركيب الدقيق الكامل للخلية enteroendocrine وneuropod لها. ضمن neuropods، وجدنا السمات الهيكلية من المحاور العصبية، وخارج neuropods، وجدنا علاقة جسدية لالدبقية المعوية 8. في الواقع، neuropods تحتوي على حوالي 70٪ من جميع الحويصلات الإفرازية يشير دورا أساسيا في وظيفة إفرازية من هذه الخلايا. بناء علىالبيانات الهيكلية، وفي الآونة الأخيرة وجدنا أنه من خلال هذه neuropods، خلايا enteroendocrine والخلايا العصبية التعصيب الأمعاء تشكيل الدائرة الظهارية العصبية، مماثلة لتلك التي من خلايا الذوق في اللسان 8،9.

كشف مثل هذه السمات آليات حسي كيميائي الجهاز الهضمي تنبع من البيانات الهيكلية التي تم جمعها باستخدام هذا الأسلوب المجهري مترابط. ونعتقد أن هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة في مناطق أخرى من بيولوجيا الخلايا، لا سيما عندما فرقت الخلايا داخل الأنسجة في نسبة منخفضة جدا. أشرنا إلى الأسلوب كما متحد البؤر مترابط ومتسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني في 3D (Cocem3D). يتكون أسلوب الخطوات الرئيسية التالية: تشريح الأنسجة، والفحص المجهري متحد البؤر، والتصوير SBEM، SBEM ومتحد البؤر ارتباط الصورة، وتجزئة اليدوية. بالمقارنة مع الطرق المترابطة أخرى، فإن مفهوم بسيط إلى حد ما لأن الإرتباط المادي بدلا من المواد الكيميائية.

Protocol

وقد فعلت كل رعاية الحيوان والتجارب وفقا للبروتوكول الذي وافقت عليه لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ديوك.

تنبع Cocem3D من مجموعة من البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 10،11 وكان يطبق هنا لدراسة الخلية enteroendocrine محددة باستخدام الماوس مراسل PyyGFP 12. يمكن بسهولة هذه الطريقة يمكن تطبيقها على الخلايا الأخرى ذات الاهتمام باستخدام المتاحة تجاريا الفئران المعدلة وراثيا مراسل. يوصف الأسلوب في ثلاثة أقسام: المتلازم المجهري متحد البؤر، المسلسل كتلة وجه المجهر الإلكتروني (SBEM)، والبيانات جعلها في 3D.

متلازم متحد البؤر المجهر

والهدف من هذا القسم هو حصاد جزء من أنسجة القولون البعيدة من الأبعاد التي تسمح متحد البؤر مترابط وSBEM التصوير. البروتوكول هو على النحو التالي:

1. حصاد الأنسجة

  1. إعداد10 مل من 50 ميكروغرام حل / الهيبارين مل في برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد زيلازين / الكيتامين الأسهم مخدر عن طريق خلط 10 مل من الكيتامين (100 ملغ / مل) و 1 مل من زيلازين (20 ملغ / مل).
    1. تمييع زيلازين / الأسهم الكيتامين 1: 4 في 0.1M برنامج تلفزيوني.
  3. إعداد 100 مل من محلول تثبيتي تحتوي على 4٪ لامتصاص العرق و 0.1٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني.
  4. تخدير PyyGFP الماوس، 6-10 أسابيع من العمر، مع جرعة قاتلة من زيلازين / الكيتامين مخدر. حقن مخدر داخل الصفاق في 0.15 مل لكل 20 غراما من وزنه الماوس.
  5. تأكيد تخدير الماوس السليم عن طريق معسر الذيل أو أصابع القدم، واستخدام مرهم على العينين لمنع جفاف.
  6. استخدام تدفق مضخة تحوي المتغيرة ليروي تثبيتي intracardially 10. باستخدام مقص جراحي (13 سم طول) قطع فتح تجويف البطن لفضح الأمعاء والقلب والرئتين. عقد القلب مع ملقط ضيق نمط منحنية (12 سم طول) وإدراج إبرة فراشة (19 G) من مضخة تحوي طn لترك البطين. على الفور، وقطع الأذين الأيمن مع المقص مباشرة ربيع (طول 4 ملم). يروي بمعدل 2 مل / دقيقة لأول مرة مع الحل الهيبارين لمدة 1 دقيقة، وبعد ذلك مع حل تثبيتي المثلج لمدة 15 دقيقة حتى ذيل الماوس غير جامدة تماما.
    ملاحظة: من المهم جدا أن يروي بمعدل بطيء لمنع انفجار الأوعية الصغيرة في الغشاء المخاطي في الأمعاء. سوف تنفجر الأوعية تنازلات التركيب الدقيق للأنسجة و. إذا نضح كافية، يجب الكبد يتحول شاحب في اللون داخل 3-5 دقائق.
  7. باستخدام مقص صغير فتح تجويف البطن واستئصال القولون بأكمله من تقاطع مع الأعور إلى المستقيم البعيدة. وضع الأنسجة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. في حين غارقة في برنامج تلفزيوني، وقطع مفتوحة مع مقص الربيع الصغيرة القولون على طول مساريق.

2. تشريح وتحديد قطاعات الأنسجة

  1. باستخدام مشرط، وقطع حوالي 6 شرائح الأنسجة الصغيرة (2 مم 2) من القولون البعيدة. القيام بذلك على ورقة سالشمع الأسنان و وغارقة في بضع قطرات من برنامج تلفزيوني.
  2. بعد إصلاح قطاعات النسيج في محلول تثبيتي لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية.

3. كتل الأنسجة تشريح مايكرو

  1. إعداد 5٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في برنامج تلفزيوني وابقائه في حمام مائي عند 45 ° C.
  2. تضمين شرائح الأنسجة في 5٪ منخفضة ذوبان الاغاروز باستخدام وعاء صغير من البلاستيك، مثل حجم قياسي الأنسجة تيك Cryomold.
  3. جبل الأقسام جزءا لا يتجزأ من على تهتز شفرة مشراح وملء علبة عازلة مع PBS الجليد الباردة.
  4. قطع 300 ميكرون شرائح الأنسجة في 0.8 السعة و 0.04 ملم سرعة / ثانية. ملاحظة: عند هذه النقطة، سيتم فكها شرائح الأنسجة من الاغاروز.
  5. إعادة تضمين 300 شرائط الأنسجة ميكرون في الاغاروز وجبل لهم على مشراح عموديا إلى شفرة vibratome ل.
  6. باستخدام vibratome، وقطع شرائح الأنسجة في سمك 50 ميكرون. ملاحظة: يجب أن تكون كتل الأنسجة النهائية حوالي 300 ميكرون واسع × 50 ميكرون سميكة. هذه دهي الأمثل imensions من التجارب متحد البؤر التجريبية التي أظهرت أن سمك خلية enteroendocrine ما بين 15-20 ميكرومتر وطول 30-70 نانومتر في neuropod ل. ولذلك، يمكن احتوى على الخلية بأكملها داخل كتلة من الأنسجة 300 ميكرون واسع بنسبة 50 ميكرون سميكة إذا توجه الخلية موازية لمواجهة كتلة الأنسجة. تختلف هذه الأبعاد اعتمادا على الأنسجة والخلايا نوع من الفائدة.
  7. تخزين كتل الأنسجة في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.

4. متحد البؤر التصوير

  1. يعد حل وصمة عار النووي عن طريق تمييع دابي في برنامج تلفزيوني في 1: 4000.
  2. احتضان كتل الأنسجة في دابي النووية وصمة عار لمدة 5 دقائق. ملاحظة: تلوين دابي يسهل الخلايا الفردية المميزة التي النواة، وهو أمر مفيد لربط ومتحد البؤر وSBEM الصور.
  3. جبل كتل الأنسجة على اتهام شريحة زجاجية، إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني، وتغطيتها مع ساترة.
  4. باستخدام المجهر متحد البؤر، وتحديد كتلةالصورة مع الزغب سليمة والخلايا PyyGFP المصالح وتصوير لهم الحصول على ض مداخن المقاطع البصرية.
    1. استخدام الهدف زايس خطة امزيغ 20X / 0.8 للحصول على أكوام-Z من 1 ميكرومتر المقاطع البصرية.
    2. لض المكدس، واستخدام قنوات 405 نانومتر (دابي) لتحديد العلاقة إلى خلايا أخرى، 488 GFP الذاتية نانومتر إلى توطين الخلية من الفائدة، وتدخل الفرق النقيض (DIC) لتحديد موقع الخلية المتعلقة التجويف.
    3. استخدام صورة من القرار 1024 بكسل أو أعلى.

5. تضمين كتل في الاغاروز

  1. إعداد 10 مل من تثبيتي تحتوي على 4٪ لامتصاص العرق و 2.5٪ غلوتارالدهيد في برنامج تلفزيوني.
  2. إزالة كتل الأنسجة من شريحة زجاجية عن طريق إضافة بعناية PBS في حواف زلة غطاء لتمرير ساترة بعيدا عن شريحة زجاجية دون الإضرار كتلة الأنسجة. ثم، استخدم الفرشاة الفنون الجميلة لنقل كتلة الأنسجة من الشريحة إلى 10.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على 4٪ لامتصاص العرق و 2.5٪ غلوتارالدهيد مثبت.
  3. ما بعد الإصلاح كتل الأنسجة O / N عند 4 درجات مئوية.
  4. نقل كتل الأنسجة لبرنامج تلفزيوني. ثم، تضمين كتل مسطحة في 5٪ منخفضة ذوبان الاغاروز التي يقحم بها بين الشرائح الزجاجية.
    ملاحظة: تضمين الكتل في طبقة رقيقة من الاغاروز تخفف التلاعب الخلفي خلال تلطيخ.
  5. قطع الاغاروز في ساحة وجعل الشق على الجانب العلوي. ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على التوجه في الخطوات اللاحقة.
  6. متجر بنات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل مع برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

كتلة وجه التسلسلي المجهر الإلكتروني (SBEM)

في هذا القسم، يتم إعداد كتلة الأنسجة وتصويرها مع SBEM في انخفاض التكبير. ثم يرتبط الصورة مسح وجهه كتلة مع البيانات مبائر لتحديد المنطقة التي تحتوي على الخلايا في المصالح. مرة واحدة في المنطقةوالتي تم تحديدها، وتصوير الأنسجة في القرار 7 نانومتر / بكسل وشرائح من 70 نانومتر. وكان هذا كافيا للحل والتمييز الحويصلات الإفرازية الأساسية كبيرة كثيفة من العضيات الأخرى. في الخلايا enteroendocrine، وهذا النوع من الحويصلات يتراوح بين 100 و 150 نانومتر في القطر 13. البروتوكول هو على النحو التالي:

6. أقسام الأنسجة تلطيخ

  1. إزالة الأنسجة من برنامج تلفزيوني وشطف ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، في 0.1 M عازلة كاكوديلات.
  2. كتل وصمة عار للحمض التانيك 1 ساعة في 0.1٪ حلت في 0.1 M عازلة كاكوديلات لتعزيز النقيض من أغشية الخلايا 14.
  3. تنفيذ تلطيخ وجفاف الأنسجة لاحقة وفقا لبروتوكول نشر 11. بعد Deerinck وآخرون. بروتوكول، تعد هذه الحلول: 1) 1٪ (ث / ت) thiocarbonhydrazide (THC)؛ 2) يؤدي حل اسبارتاتي. 3) خلات اليورانيل 1٪، و 4) فيروسيانيد الأوسيميوم tetraoxyde / البوتاسيوم (أوسو 4 / K فيروسيانيد). مزيج 4٪ أوسو 4 و 2XK فيروسيانيد الاسهم [0.3g K فيروسيانيد و0.86g نا كاكوديلات في 10 مل H 2 O] في نسبة 1: 1 لجعل أوسو 4 / K فيروسيانيد. ملاحظة: وجود الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الاغاروز يسهل المناولة خلال تلطيخ. إزالة الاغاروز لاحق الراتنج تسلل بعناية.
  4. عينات شطف ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، في 0.1 M عازلة كاكوديلات ثم صمة عار مع حل OsO4 / K فيروسيانيد لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  5. شطف في الماء النقي جدا ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما، وصمة عار مع TCH لمدة 30 دقيقة في 60 ° C.
  6. شطف في الماء النقي جدا ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما وصمة عار مع 2٪ أوسو 4 (بدون K فيروسيانيد) لمدة 60 دقيقة في RT. شطف مرة أخرى في الماء النقي جدا ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما.
  7. وصمة عار مع 1٪ خلات اليورانيل O / N عند 4 درجات مئوية. شطف في الماء النقي جدا ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما.
  8. وصمة عار مع اسبارتاتي الرصاص لمدة 30 دقيقة في 60 ° C. شطف في الماء النقي جدا ثلاث مرات، 5 دقائق لكل منهما.
  9. يذوى الأنسجة بشطفها في solutioنانوثانية مع زيادة تركيزات الايثانول. شطف 2 مرات، 5 دقائق لكل منهما، مع 50٪، 75٪، 85٪، 95٪، ومطلق الإيثانول بنسبة 100٪. في النهاية، شطف المقاطع مع أكسيد البروبيلين مرتين، 10 دقيقة لكل منهما.

7. التسلل وتضمينها أقسام الأنسجة في الراتنج

  1. اختراق كتل الراتنج مع استخدام عدة متوافر تجاريا. الأنسجة تضمين في الراتنج باستخدام عدة الإي بي التضمين. إعداد خليط الراتنج من 48٪ الايبوكسي، و 20٪ مل DDSA، و 30٪ مل NMA، و 2٪ DMP30. تستنهض الهمم خليط الراتنج بقوة لمدة 5 دقائق ثم ضع المزيج في فراغ لمدة 30 دقيقة للسماح فقاعات أن يأتي إلى السطح.
  2. خلط الراتنج مع أكسيد البروبيلين في نسبة 1: 1 ويهز بقوة. إزالة شطف الجفاف النهائي من الأنسجة، وإضافة الراتنج المختلط مع أكسيد البروبيلين. مكان قارورة مع العينات في O المدورة / N وترك قنينة لم يسبق لهم اللعب. في اليوم التالي، إضافة تقدم طازجة الراتنج EPON وتخلط لمدة 90 دقيقة في الدوار.
  3. كتل تضمين في الراتنج شقة ممكن عن طريق يقحم لهم فيبين الشرائح الزجاجية التي تم علاجها مع وكيل الافراج سائل لمنعها من الالتصاق كل 15 آخرين.
  4. مرة واحدة هي جزء لا يتجزأ من كتل شقة، وعلاج لبنات لإضافة 48 ساعة على 60 درجة مئوية.
  5. سحب الشرائح بصرف النظر للافراج عن كتل.

8. تركيب والتشذيب كتلة الأنسجة للتصوير

  1. تحت نطاق تشريح، وتتطابق مع التوجه للكتل الأنسجة جزءا لا يتجزأ من الراتنج مع أن من الميكروسكوب متحد البؤر لتسهيل التعرف على المناطق التي تحتوي على خلايا الفائدة قبل أن يقلص الكتلة.
  2. تقليم الراتنج جزءا لا يتجزأ من كتلة يدويا وصولا الى ميكرون كتلة وجه ~ 500 × 500.
  3. جبل كتلة شقة على دبوس تحتوي الايبوكسي موصل وجافة لمدة 30 دقيقة. ثم، وضع كتلة شقة على السطح وO جاف / N في 60 ° C.
  4. معطف كتلة مع الفضة الغروية السائل. الحفاظ على أقسام الأنسجة شقة لضمان تقطيع كتلة في الزاوية اليمنى لتسهيل التعاونrrelating مسلسل كتلة الوجه ومتحد البؤر الميكروسكوب.

9. SBEM

  1. صورة كتلة باستخدام المجهر الإلكتروني الضوئي مجهزة بنظام SBEM (ه .G.، 3View).
  2. تعيين سمك الباب الأول في ~ 2 ميكرون الزيادات وقطع حتى مواجهة الأنسجة يخرج من كتلة.
  3. الحصول على صورة surver من الوجه كتلة بأكمله.
  4. باستخدام برنامج فيجي، أخذ قياسات كل من المسلسل كتلة الوجه ومتحد البؤر الميكروسكوب لتوليد قاسم مشترك وحساب لعينة تزييفها أثناء التثبيت وتلطيخ 16.
  5. تحديد مجال الاهتمام على وجهه كتلة بضرب القاسم إلى إحداثيات في الصور مبائر. أيضا استخدام الميزات الهيكلية الأخرى، مثل موقف زغيبات، والخلايا الكأسية، أو الصفيحة المخصوصة، كمرجع.
  6. المنطقة صورة من الفائدة عند 2.25 كيلو فولت و 7 نانومتر / بكسل (أو 15،147X التكبير) في وضع فراغ عالية. يجب تعيين الزيادات شريحةفي 70 نانومتر أو أقل.
  7. جمع البيانات SBEM في الخام 16 بت شكل .dm3.

10. الأمثل SBEM صور لتقسيم السطح

  1. تحويل الصور من صيغة SBEM .dm3 الخام إلى .tiff 8 بت.
  2. تصفية .tiff الصور باستخدام فلتر 0.8 التمويه الضبابي في فيجي.
  3. تقليص مجموعة البيانات إلى 25٪ من الحجم الأصلي وحفظه كما كومة .tiff لتقليل كمية الذاكرة RAM اللازمة للتعامل مع مجموعة.
  4. محاذاة كومة من الصور SBEM باستخدام البرنامج المساعد فيجي "محاذاة كومة الخطية مع فرزت" في وضع الترجمة واقتصاص باستخدام "3D المحاصيل" المساعد. ملاحظة: الاقتصاص يساعد على مزيد من خفض كمية الذاكرة RAM اللازم للتجزئة وجعل حجم.

التقديم البيانات في 3D

11. متحد البؤر المجهر

  1. إعادة ض مداخن باستخدام التلقائي وضع من "السطوح" أداة تفوق. 1D الشكل، ويظهر تفصيلonstruction من كل قناة باستخدام الخيار على نحو سلس على، منطقة الأسطح التفاصيل في 0.126 ميكرون، والعتبة كما كثافة المطلقة.

12. المسلسل بلوك وجه SEM

ملاحظة: دليل تجزئة البيانات هو الوقت ذاته إجراء طويلا واعتمادا على الميزات التي ستقدم هذا الإجراء يمكن أن يستغرق عدة أسابيع. وقد تم تقسيم لأشرطة الفيديو والأرقام الواردة في Bohórquez وآخرون 2014 8 يدويا واستغرق حوالي 500 ساعة من العمل. فمن المستحسن لتحديد أولويات الميزات الأساسية التي تحتاج إلى جعل قبل البدء في عملية تجزئة. هذا الإجراء هو على النحو التالي:

  1. استخدام "السطوح" أداة في وضع التعادل و"كفاف" الخيار في وضع رسم من 50 مللي ثانية إلى قطاع يدويا وحجم المقدمة الخلية من الفائدة.
  2. تتبع معالم على كل شريحة من الخلية لتقديم أكثر سلاسة أو كل 5 شرائح لتقديم أسرع.
  3. تصدير ايم النهائيالأعمار باستخدام أداة "لقطة" بدرجة وضوح 300 نقطة في البوصة أو أكثر.

النتائج

تم استخدام أسلوب المقدمة هنا لدراسة التركيب الدقيق للخلية معينة داخل طبقة من ظهارة. الخلية من الفائدة في هذه الحالة هي الخلية enteroendocrine بعيد المنال. وقد تم التعرف عليهم في الموقع ممكنا إلا في السنوات القليلة الماضية مع تطور الفئران مراسل مضان خلية محددة. في عام 2011، وضعنا ماوس التي المروج من هرمون PYY يدفع التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء 17. في هذا PyyGFP الماوس، وتتميز الخلايا enteroendocrine في الجزء الأقصى من الأمعاء الدقيقة والقولون بسهولة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. كان هذا نموذج الفأر أساسا لتحديد كتلة الأنسجة التي تحتوي على خلية enteroendocrine وبمعالجة ذلك SBEM. يشار طريقة ارتباط هنا كما cocem3D وبنيت على البروتوكولات التي تم نشرها مسبقا 10،11.

الاستفادة المثلى من أبعاد كتلة الأنسجة هو أمر حاسم لالارتباط. في التجارب الأولية،تقرر أن في كتلة الأنسجة 300 ميكرون طويل × 50 ميكرون سميكة يتم تقليل عدد الصور SBEM إلى أدنى حد ممكن في حين تغطي الجسم كله من الخلايا في المصالح. ويبين الشكل 1A يتجاهل من تشريح باستخدام تهتز شفرة microtrome ل الحصول على كتلة الأنسجة مع الأبعاد الصحيحة. ويتم الحصول على ما لا يقل عن 100 الكتل قبل الفرز من خلال لهم لاختيار تلك مع خلايا سليمة من الفائدة. يتم تصوير كتل اختيارها بواسطة المجهر متحد البؤر وصورة ض مداخن متباعدة بصريا كل 1 ميكرون (الشكل 1B و C). 1D الشكل يبين وجهة نظر المقدمة حجم خلية enteroendocrine في الدقاق من الفأرة. في neuropod بارزة تمتد تحت الخلايا الظهارية لل~ 60 ميكرون.

تم العثور على خلية من الفائدة عن طريق الربط بين مبائر ض المداخن مع صورة SBEM من الوجه كتلة بأكمله. ويقدم مثالا هنا كتلة من القولون البعيدة من PyyGFPالماوس. بعد الحصول متحد البؤر Z-مداخن (الشكل 2A)، وجزءا لا يتجزأ من كتلة في طبقة رقيقة من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز (الشكل 2B). وهذا أمر ضروري للتلاعب لاحق من الكتلة. فمن المهم للحفاظ على التوجه للكتلة شقة ممكن لتتناسب مع شرائح الضوئية مع شرائح SBEM. في الشكل 2C، يظهر صورة ممثل من وجهه كله من كتلة الأنسجة. أجزاء من هذا الرقم وقد نشرت سابقا في Bohorquez وآخرون، 2014 (8). وكان ذلك مترابطا في وقت لاحق مع صورة مبائر مع الأخذ في الاعتبار معالم الأنسجة والأبعاد. ويبين الشكل 2D تراكب من متحد البؤر وSBEM صورة كتلة، وكشف عن الموقع الدقيق لدينا خلية من الفائدة.

مرة واحدة وقد تم التعرف على الخلية، ويتم التصوير SBEM في قرار عالية بما فيه الكفاية لتحديد الحويصلات الإفرازية وعضيات الخلايا الأخرى. مجموعة البيانات قدم سعادةتم تصويرها في إعادة 7 نانومتر لكل بكسل كما تم التقاط صور من كتلة كل 70 نانومتر. مجموعة البيانات الواردة 643 الصور التي تمتد 45 ميكرون من عمق الأنسجة. وحلق بضعة ميكرونات أثناء التصوير الأولي من الوجه كتلة بأكمله في التكبير المنخفض. وقد اكتسب الخام مجموعة البيانات SBEM في .dm3 شكل وتحويلها إلى .tiff لمعالجة لاحقة. تم اقتصاص كومة SBEM باستخدام برنامج فيجي المساعد "المحاصيل (3D)" كتلة لتحتوي فقط على المنطقة من اهتمام. هذا يقلل من كمية الذاكرة RAM اللازمة لجعل حجم. تم التعرف على الخلية موقفها وحويصلات إفرازية، ومجزأة باستخدام برنامج Imaris الشكل 3 يحتوي على التقديم في 3D الخلية enteroendocrine.

figure-results-3382

الشكل 1: المتلازم متحد البؤر المجهري (A) سير العمل لتشريح قطعة منالأنسجة المعوية في منديل كتلة 300 × 50 ميكرون سميكة. (B) كتلة النسيج التمثيلي للأبعاد الصحيحة. لاحظ أن كتلة الأنسجة من هذه الأبعاد من الأمعاء الدقيقة الماوس يمتد حوالي 3 الزغب أو، في حالة القولون حوالي 8 الخبايا. (C) وزغابة في الأمعاء الدقيقة تحتوي على خلية من الفائدة. (D) A متحد البؤر ض المكدس المقدمة في 3D باستخدام برنامج Imaris يظهر خلية enteroendocrine مع neuropod بارزة تعمل تحت ظهارة الأمعاء. الأزرق = دابي وصمة عار النووية. الحانات = 10 ميكرون. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4349
الشكل 2: كتلة وجه المسلسل المجهر الإلكتروني (A) صورة متحد البؤر من سيلي.المديرية كتلة من أنسجة القولون تحتوي على خلايا PyyGFP enteroendocrine (الأخضر) من الفائدة. (B) حالما يتم تصويرها الكتلة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، وجزءا لا يتجزأ من ذلك، ثم شقة في انخفاض ذوبان الاغاروز باستخدام الشرائح الزجاجية. تضمين كتلة الأنسجة في الاغاروز يسهل التلاعب لاحق، والشق في الزاوية اليسرى يساعد على جبل كتلة داخل SBEM في الاتجاه الصحيح. (C) SBEM صورة وجه الكتلة. (D) ارتباط البيانات مبائر مع SBEM لتحديد خلية من الفائدة (السهم الأبيض). يتم تعديل الصور في ج، د من هذا الرقم من Bohorquez وآخرون، 2014 8. الأزرق = دابي وصمة عار النووية. الحانات = 10 ميكرون. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5420
الشكل 3: بيانات جعلها في 3D (A) حجم جعل من خلية enteroendocrine باستخدام برنامج Imaris. تحتوي الخلية على neuropod محملة حويصلات إفرازية. للحصول على وصف كامل للالتركيب الدقيق للخلية enteroendocrine، يرجى الرجوع إلى Bohórquez وآخرون، 2014 8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

chemosensation الهضمي يبرز بوصفه مجالا جديدا ومثيرا في مجال البحوث الطبية الحيوية. هذا هو في جانب كبير منه بسبب اكتشاف مستقبلات الذوق وظيفية في الخلايا enteroendocrine 18. وقد أظهرت الدراسات اللاحقة أن الخلايا enteroendocrine تعبر عن مستقبلات معينة على المواد الغذائية، بما في ذلك الكربوهيدرات، والدهون، والأحماض الأمينية 5،6،19،20. وكان العامل المحفز لهذه الاكتشافات تطوير الفئران المراسل، في الخلايا التي enteroendocrine وfluorescently المسمى 20. وضعنا واحد من هذه الفئران، والفأر PyyGFP، لدراسة الخلايا enteroendocrine من الأمعاء الدقيقة القاصي والقولون 17،21. هذه الخلايا هي التي تهم لأنها تفرز PYY ومثل الجلوكاجون الببتيد 1، وكلاهما المحرضات بالشبع 22،23. في ذلك الوقت، كان حساب فائقة الهيكلي الكامل لهذه الخلايا في عداد المفقودين، والتي كنا نعتقد أمر أساسي لفهم آليات يشير الخاصة بهم.

ontent "> هنا، وصفنا على طريقة بصريا لسد متحد البؤر المجهري مع SBEM. ويشار إلى الأسلوب كما Cocem3D، الأمر الذي سمح لنا لتوثيق التركيب الدقيق الكامل للخلايا enteroendocrine. لقد ذكرت أن هذه الخلايا لديها neuropod يحتوي على ثلاثة أرباع كل من الحويصلات الإفرازية 8. وفي neuropod، هناك neurofilaments ومثل الكثير من المحاور العصبية، ورعايتها من قبل neuropods الخلايا الدبقية المعوية 8. والأهم من ذلك، هو على الرغم من هذه neuropods أن enteroendocrine خلايا الاتصال فعليا إلى الخلايا العصبية التعصيب الأمعاء و القولون 9.

واحدة من نقاط القوة في cocem3D هو بساطته. الحد من عينة الأنسجة في كتلة التي يمكن تصويرها من قبل مبائر وSBEM يسهل التعرف على خلية معينة داخل الأنسجة. ويمكن تحديد الحويصلات الإفرازية وعضيات أخرى بكل سهولة في القرار 7 نانومتر / بكسل. لأنه يتم التخلص منها المقاطع في SBEM، المزيد من بروسسالغناء من الأنسجة لتحديد بروتينات معينة ليس خيارا في هذه المرحلة. ومع ذلك، وتطوير أساليب مثل آتوم 24، التي يتم الاحتفاظ المقاطع من كتلة الأنسجة، ومن المرجح أن تمكين من التعرف على بروتينات معينة في الخلية. تحديد موقع محدد من المستقبلات حسي كيميائي على خلايا enteroendocrine هي المعلومات الأساسية لتطوير علاجات العقاقير لعلاج السمنة، لأن الخلايا enteroendocrine هي واجهة الحسية بين الطعام في القناة الهضمية والشبع في الدماغ.

Disclosures

الدكتور ساتيش Medicetty هو موظف من ويحصل على 100٪ من الراتب Renovo العصبية شركة. ولكن هذا لا يغير التزام مقدم البلاغ إلى سياسات إن الرب على البيانات والمواد المشاركة. يعلن أي تضارب في المصالح للمؤلفين المتبقية.

Acknowledgements

Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Bohórquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered salineLife technologies10010023
Heparin sodium saltSigmaH4784
Paraformaldehyde Sigma1581274%, freshly made in PBS, final pH 7.4
GlutaraldehydeSigmaG5882
Dental waxElectron Microscopy Sciences72660
Low-melting agaroseLife technologies16520-1005%, freshly made in PBS
Standard Tissue-Tek CryomoldElectron Microscopy Sciences62534-25
DAPI  nuclear stainLife technologiesD1306
Postively charged glass slides and coverslips
Fine art paintbrush #1
Cacodylate bufferElectron Microscopy Sciences11650
Tannic acidElectron Microscopy Sciences21700
EMbed 812 kit Electron Microscopy Sciences14120
Liquid releasing agent Electron Microscopy Sciences70880
Liquid silver colloidal   Electron Microscopy Sciences12630
CircuitWorks conductive epoxy  ITW ChemtronicsCW2400
Variable flow peristaltic pumpVWR70730-064
VT1200S Vibrating blade microtomeLeica
Zeiss 780i confocal microscopeCarl Zeiss 
Sigma VP Scanning Electron Microscope Carl Zeiss 
3view systemGatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)http://www.renovoneural.comRenovo provides 3d EM services
Fiji softwareOpen access software
Computer station with 16 GB of RAM or more
Data visualization software Imaris 7.5 Bitplane

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329 (2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881 (2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. . NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

101 3D neuropod chemosensation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved