بسيطة والشم اختبار لالفئران بمساعدة الحاسوب

Summary

We present a simple and unbiased olfactory test in mice. With this protocol olfactory discrimination, preference, avoidance and sensitivity to a novel odor as compared to water can be assessed in single behavioral sessions. This method is indicated for a single experimenter and analysis is based on computer-assisted video processing.

Abstract

تم الحفظ الشم كبيرة بين الأنواع ومطلوب للتكاثر والبقاء على قيد الحياة.

في البشر، الشم هي أيضا واحدة من الحواس التي تتأثر مع الشيخوخة وغير مؤشرا قويا على أمراض الاعصاب. وبالتالي، يتم استخدام اختبار الشم كوسيلة من وسائل التشخيص غير الغازية للكشف عن عجز العصبية في وقت مبكر. من أجل فهم الآليات الكامنة حاسة الشم قابلية الشبكة، وقد اكتسب البحوث حاسة الشم لدى القوارض الزخم في العقد الماضي.

هنا، نقدم، الوقت الفعال وقابلة للتكرار طريقة اختبار حاسة الشم بسيط جدا من التصور الفطري رائحة والحساسية في الفئران من دون الحاجة إلى أي نوع من الطعام أو الماء تقييد مسبق. يتم إجراء الاختبارات في بيئة مألوفة للفئران، لا يتطلب سوى الروائح وجلسة 2 دقيقة من التعرض الرائحة. يتم إجراء هذا التحليل، بعد خاصة، وذلك باستخدام الأوامر بمساعدة الحاسوب على يماغيج ويمكن أن يكون، ول، نفذت من البداية الى النهاية من قبل أحد الباحثين.

لا يتطلب هذا البروتوكول أي معدات خاصة أو الإعداد ويشار لأي مختبر ترغب في اختبار إدراك حاسة الشم والحساسية.

Introduction

الشم هي واحدة من الوظائف الحسية الأكثر تطورا ومهمة في الثدييات. أي انخفاض في النشاط حاسة الشم قد تؤثر على تناول الطعام، والسلوك الاجتماعي، وفي أسوأ الحالات، حتى البقاء على قيد الحياة. في البشر، وتدهور حاسة الشم هو العمر تعتمد ^1، ويعتبر مؤشرا قويا على الاضطرابات العصبية ^2-6. اختبار تحديد حاسة الشم التي وضعتها جامعة بنسلفانيا يمثل حاليا واحدة من والاختبارات التشخيصية الأكثر استخداما، غير الغازية وقابلة للقياس والتي يمكن قياس العجز العصبية المبكرة ⁷ والتنبؤ باحتمالية عالية تطور الخرف ^8،9.

إمكانية الوصول إلى نظام حاسة الشم، وأهمية الشم لدى القوارض، وأثار خط مكثف للبحوث تتناول آليات وظائف الشم الأساسية ^10. لقد أظهرنا سابقا أن فقدان وظيفة للباستقبال الإشاراتأو Notch1 يؤثر على تجنب حاسة الشم ^11. في هذا البروتوكول نستخدم الفئران التي تفتقر إلى يجند الإشارات، Jagged1، في الخلايا العصبية أو الدبقية لدراسة أداء حاسة الشم.

ويعرف الشم الفطري من قبل ثلاثة المعلمات كما تصور والتمييز بين الروائح وحساسية الشم ^4. ويمكن أن يتم اختبار حاسة الشم لدى القوارض في مجموعة متنوعة من الطرق وبعض الدراسات السلوكية الاستفادة من olfactometers، والتي توفر رائحة للحيوان في تركيزات بخار محددة وفي إطار زمني دقيق ^12-14. ومع ذلك، فإن هذا القياس مكلفة ويمكن أن يكون متاحا إلا في المرافق المتخصصة. في عملنا، ونحن نقدم حاسة الشم بروتوكول اختبار بسيطة وسريعة وقابلة للتكرار، التي نفذت باستخدام الروائح المتطايرة. ووصفت اختبارات قياس الإدراك إلى جاذبة أو طاردة رائحة ويقيم التمييز بين رائحة ^و11،15،16 المياه. باستخدام نفس الإعداد، ثه أيضا يمكن قياس حساسية رائحة بتركيزات مختلفة ^16،17. وبعد خاص بمساعدة الحاسوب معالجة الفيديو، مستوحاة من عمل الصفحة وزملاؤه ^18، ويوفر نتائج مشاركات من دون الحاجة إلى عمى التجريبية والسماح لشخص واحد لتنفيذ التجربة برمتها.

ويهدف هذا البروتوكول إلى توفير نقطة انطلاق لدراسة السلوك حاسة الشم في الفئران.

Protocol

كافة الإجراءات الحيوانية وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / الاتحاد الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية والموافقة عليها من قبل اللجنة المحلية رعاية الحيوان (كانتون فريبورغ، سويسرا).

1. إعداد الحيوانية

1. حيوانات التجارب
   1. إجراء تجارب على البالغين النوع البري من الذكور والفئران المعدلة وراثيا (C57BL / 6 الخلفية) من 3-5 أشهر من العمر. ثلاث مجموعات من الفئران تتوافق مع الضوابط البرية نوع littermate (مجموعة A، Jagged1 flox / flox ¹⁹⁾ واثنان مشروطة خطوط الماوس KO (المجموعة B، C Jagged1ncKO و، Jagged1gcKO).
   2. الفئران منزل تحت ظروف المختبر القياسية في غرفة جيدة التهوية، مع سيطرة دورة الظلام / الضوء 12 ساعة وتوفير الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.

2. الإعداد التجريبية

1. الساحة التجريبية
   1. لالساحة التجريبية، استخدم نظيفة معقمة قفص الماوس (36 سم طول × 20.5 سم عرض × 13.5 سم الارتفاع) (الشكل 1A).
   2. تعيين كل الماوس إلى قفص مرقمة مع أغطية فراش جديدة، 3 سم ارتفاع. إذا تم إعادة استخدام الأقفاص، كما هو الحال في اختبار حساسية رائحة، واتخاذ التدابير التالية لتجنب التلوث المتبادل بين الروائح والفئران.
      1. بمناسبة الجانب المياه.
      2. تنظيف الجدران أضيق من الأقفاص مع ورقتين الأنسجة رش مع 70٪ من الإيثانول، واحدة لكل جانب.
      3. تتراكم أقفاص وفقا لالتركيب الوراثي للفئران وتخزينها مؤقتا تحت غطاء الصفحي.
2. كاميرا
   1. جبل الكاميرا على حامل ثلاثي القوائم المخصصة بهدف في 58 سم من الجزء السفلي من القفص (الشكل 1A). تحديد موقف من ترايبود والقفص وتعيين حدوده مع علامات للسماح للكاميرا أن تركز على الجزء العلوي من القفص.
   2. تسجيل الفيديو في 320 بكسل × 240 بكسل، 15.08 لقطة في الثانية كملفات MOV.
3. الروائح
   1. Resuspend وscen فيالخبر، عندما أشار، في المذيبات التي كانت قابلة للذوبان.
   2. لاختبار تفضيل زبدة الفول السوداني استخدام. Resuspend وزبدة الفول السوداني في زيت الفول السوداني (10٪ ث / ت).
   3. لتجنب اختبار استخدام النقي 2-Methylbutyric (2 MB) حمض (98٪).
   4. لاختبار الحساسية، استخدام البول الإناث من نفس المستعمرة الماوس والخلفية (C57BL / 6).
      1. لراحة جمع البول 1-2 أيام قبل إجراء الاختبار حاسة الشم. كبح جماح مع الاستمرار على الماوس تحت غطاء محرك السيارة مع بطنه فوق شبكة القفص. تحت شبكة القفص وضع طبق بتري بلاستيكية لجمع قطرات من البول.
      2. جمع البول من كل أنثى في أنبوب 1.5 مل وخلط جميع عينات البول لتطبيع للالتباين بين الحيوانات. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      3. في يوم من التجربة، وذوبان الجليد في البول وإجراء 4 التخفيفات في الماء المقطر المزدوج في عامل التخفيف من 10 (1:10، 1: 100، 1: 1000، 1: 10000).

3. اختبار شمي

ملاحظة: في هذا البروتوكول الروائح قد تعمدت التي ينظر إليها على أنها جاذبة قوية (زبدة الفول السوداني والبول الإناث) أو طارد قوي (حامض 2-MB) ^15. من المهم تنفيذ تفضيل واختبارات الحساسية للروائح لطيفة قبل إجراء الاختبار تجنب للقضاء على إمكانية أي تدخل في السلوك حاسة الشم. ومع ذلك، من أجل البساطة، في هذه الورقة، وتفضيل وتجنب اختبار سيتم حد سواء وصفت تحت اختبار التصور. تبدأ كل دورة السلوكية مع مرحلة التعود.

1. التعود المرحلة
   1. وضع الحيوانات في قفص تعيين نظيف واتركها استكشاف لمدة 5 دقائق (الشكل 1B). منذ البيئة من القفص التجريبي هو مألوف إلى قفص المنزل، وهذه المرة قصيرة بما فيه الكفاية للسماح التعود.
   2. إذا تم الانتهاء من اختبار حساسية في يوم واحد، نفذ التعود مرة واحدة فقط قبل الطلبات،ن من أعلى رائحة المخفف. إذا تم تنفيذ اختبار حساسية من في أيام مختلفة، في كل يوم هناك حاجة إلى مرحلة التعود على قفص نظيفة الجديد.
2. تصور اختبار
   1. بعد التعود، وتفعيل الكاميرا وماصة على الفور 60 ميكرولتر من رائحة لطيفة (زبدة الفول السوداني) و 60 ميكرولتر من رائحة محايد (مياه الصنبور) على الجدران المقابلة من القفص في حوالي 10 سم من الأسفل (الشكل 1C).
   2. ترك الماوس استكشاف الروائح لمدة 2 دقيقة (1D الشكل). بعد ذلك، قم بإيقاف تشغيل الكاميرا.
   3. في هذه المرحلة، والمضي قدما مع الماوس المقبل بدءا من مرحلة التعود. إجراء اختبار تجنب بالضبط بنفس الطريقة عن طريق تطبيق 60 ميكرولتر من رائحة طارد (حمض 2-MB) و 60 ميكرولتر من الماء.
3. اختبار حساسية
   1. تقييم عتبة جذب الفئران الذكور إلى زيادة تركيزات البول الإناث بالترتيب التالي: 1: 10000. 1: 1000. 1: 100؛ 1:10 والبول النقي.
   2. بعد التعود، فضح كل الماوس إلى أعلى تخفيف pipetted من قبل المجرب كما هو موضح سابقا في 3.2.1.
   3. تسجيل السلوك الاستكشافي البول مقابل المياه، ضمن إطار زمني 2 دقيقة على كاميرا الفيديو. بعد أن يتم اختبار جميع الأفواج الفئران لأعلى التخفيف (1: 10000)، فضح إلى تركيز أعلى من البول، كما هو مبين أعلاه.

4. ما بعد مخصصة تحليل البيانات

ملاحظة: تتم معالجة جميع الاختبارات السلوكية وصف آخر المخصص اتباع التعليمات تحليل البيانات.

1. فتح ملفات MOV في يماغيج لأنظمة ويندوز
   1. تثبيت وقت سريع للجافا باستخدام إعدادات مخصصة من http://www.apple.com/quicktime/download.
   2. تثبيت البرنامج المساعد وقت سريع من موقع يماغيج (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/qt-capture.html).
   3. استيراد QTJava.zip (C: ملفات البرنامج كويك تايم QTSystem) في EXTENS مكتبةأيون من يماغيج (.ImageJ جري ليب تحويلة).
   4. نسخة أيضا QTJava.zip في مجلد الإضافات وتسميته كما QTJava.jar.
   5. تثبيت ستة النصوص المرفقة في مجلد وحدات الماكرو (يماغيج الإضافات وحدات الماكرو).
   6. فتح يماغيج وترجمة وتشغيل البرنامج المساعد وقت سريع، بعد ذلك بالقرب يماغيج.
   7. إعادة فتح يماغيج وفتح ملف MOV باستخدام ملف> استيراد> باستخدام وقت سريع.
2. تعديل الفيديو
   1. مرة واحدة يتم فتح ملف الفيديو في يماغيج، وقطع الفيديو من أجل الحصول على ثابت استكشاف 2 دقيقة من وقت مجرب وpipetted للعطور في قفص (T0). تحديد إطار المقابلة لT0 وإزالة الإطارات السابقة باستخدام الزيادات من 1 (يماغيج صورة الأكوام ToolsSlice مزيل). استخدام نفس الأمر لحذف كل الإطارات التي تتجاوز التنقيب عن 2 دقيقة.
   2. تأكد من أن القفص يتركز وإذا كان استخدام ما يلزم من صورة> تحويل> الأمر استدارة إلى محاذاة ذلك.
3. بنصيحةس المعالجة
   ملاحظة: معالجة الفيديو بشكل كامل بمساعدة الحاسوب ويستخدم الأوامر وحدات الماكرو يرافق هذه الورقة.
   1. من أجل تقييد المنطقة على قفص من 127 بكسل X 218 بكسل حجم تشغيل الماكرو الخطوة 1 من البرنامج المساعد> وحدات الماكرو> الأمر تشغيل. تحريك مستطيل ثابتة على القفص (الشكل 2، الخطوة 1).
   2. اقتصاص المنطقة من القفص على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) باستخدام الماكرو الخطوة 2 (الشكل 2، الخطوة 2).
   3. استخدام الماكرو الخطوة 3 لاستخراج صورة الماوس من الخلفية عن طريق تعيين إشارة العتبة، despeckling وتصفية الفرق الإشارة. قيم الناتج في مؤامرة Z المحور تشير القيم الرمادية متوسط ​​الموافق كثافة الظل الماوس تتحرك داخل ROI من "غرفة المياه" أثناء التنقيب عن 2 دقيقة. نسخ النتائج في ورقة عمل اسمه وفقا لROI في ملف جدول (الشكل 2 الخطوة 3).
   4. استخدام الماكرو الخطوة 4 لاستخراج القيم رمادي متوسط ​​من الماوس في ROI "غرفة رائحة". نسخ النتائج في ورقة عمل اسمه وفقا لROI في ملف جدول نفسه كما في 4.3.3 (الشكل 2، الخطوة 4).
   5. من أجل مزيد من القيود على تحليل حركة الماوس في ROI "محيط المياه" استخدام الماكرو الخطوة 5. نسخ النتيجة إلى ورقة العمل اسمه وفقا لROI في ملف جدول نفسه كما في 4.3.3 (الشكل 2، الخطوة 5).
   6. لتقييد تحليل حركة الماوس في ROI "محيط رائحة" استخدام الماكرو الخطوة 6. نسخ النتيجة إلى ورقة العمل اسمه وفقا لملف ROI جدول كما في 4.3.3 (الشكل 2، الخطوة 6).
   7. معالجة كافة ملفات الفيديو والتحقق من وجود تناسق في عدد من الإطارات في الحيوانات. هنا، تسجيل جميع الحيوانات لإطارات 1810 الموافق جلسة التنقيب عن 2 دقيقة.
   8. لكل حيوان ولكل ROI نوع الإطارات مع متوسط ​​زارة شؤون المحاربين القدامى الرماديزهري أكبر من 0. تقسيم عدد الإطارات التي كتبها القيم الموافق 1 ثانية والحصول الثواني قضى في كل ROI.

5. التحليل الإحصائي

1. لكل اختبار التحقق من تجانس التباين داخل المجموعات / المورثات بواسطة اختبار بارتليت باستخدام الصيغة المتاحة على http://www.real-statistics.com/one-way-analysis-of-variance-anova/homogeneity-variances/.
2. في جذب وتجنب الاختبار، إجراء مقارنات بين الأوقات التي عشتها مع الماء مقابل رائحة ضمن مجموعة واحدة باستخدام اختبار (ت) لطالب غير اتجاهي لافتراض الفروق متساوية أو غير متساوية اعتمادا على نتائج اختبار بارتليت. مقارنة العصر الذي يقضيه مع الروائح تطرح بحلول الوقت الذي يقضيه مع المياه بين الأنماط الجينية التي كتبها في اتجاه واحد ANOVA مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل.
3. في اختبار حساسية تحليل المقارنات من الوقت الذي يقضيه مع رائحة تطرح من الوقت الذي يقضيه مع توفير المياهص بين المجموعات في التخفيفات محددة من البول في اتجاه واحد ANOVA مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل. مقارنة حساسية بين مجموعة من تركيزات رائحة نموا بنسبة 2 في اتجاه ANOVA مع التكرار مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل.
4. يتم التحقيق في التفاعل بين الأنماط الجينية والعلاجات في جذب وتجنب اختبار بنسبة 2 في اتجاه ANOVA مع الاختبار اللاحق-Bonferroni ل.

النتائج

يقيس اختبار التصور جذب لزبدة الفول السوداني وتجنب لحمض 2-MB. يتم اختبار ثلاث مجموعات من الفئران والوقت الذي يقضيه في "محيط رائحة" وكميا مقارنة بالمياه. في اختبار تفضيل، تعرض المجموعة الضابطة تفضيل كبير لرائحة مقارنة بالمياه (ر ₈ = 2.52، p <0.05). من ناحية أخرى، مج?...

Discussion

الاختبارات المقترحة في هذا البروتوكول تسمح لتقييم جوانب مختلفة من السلوك الفطري حاسة الشم في الفئران: إدراك الروائح والتمييز بين الروائح مقابل المياه والحساسية للروائح. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي رائحة وفقا لتفضيل وعلى نطاق وتجنب أظهرت في وقت سابق ^15. م?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Italplast (Italy)	1144B	36 cm length x 20.5 cm width x 13.5 cm height
Chipped wood bedding	Abedd (Austria)	LTE E-001	3 cm high
Peanut butter	Migros (Switzerland)	NA	1:10
2-Methylbutyric	Sigma Aldrich (Switzerland)	W269514	Pure
Female urine from fertile females of same mouse strain	NA	NA	Dilution series
Camera	Olympus (US)	Camedia C-8080	MOV files
Quicktime for Java (Windows)	Apple (USA)	NA	video plugin for visualizing MOV files
ImageJ for Windows	NIH (USA)	NA	Video Processing/Analysis