طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب في أجهزة ميكروفلويديك لMicrotissue لتحقيق الاستقرار

Summary

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Abstract

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Introduction

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

Protocol

1. إعداد الحل الأصلية القابلة للذوبان الكولاجين

1. إعداد أو شراء 200 ملغ من حمض، القابلة للذوبان، النوع الأول الكولاجين من ذيول الفئران في 1-3 ملغ / ^{15 مل} باستخدام بروتوكولات العزلة القياسية، مثل ذكرت من قبل Piez وآخرون.
2. تسلق كمية من المواد ابتداء على أساس حجم الغاية المرجوة من الحلول الكولاجين تعديلها. حوالي جعل 25-30 مل من مميثل و25-30 مل من الحلول الكولاجين succinylated، كل في 3 ملغ / مل، من 200 ملغ من الكولاجين الأصلي للذوبان.

2. الكولاجين مثلأيشن

1. تمييع 100 ملغ من، المحمضة (درجة الحموضة 2-3) حل الكولاجين الأصلي إلى تركيز 0.5 ملغ / مل مع الماء المعقم الجليد البارد والحفاظ على حل على الجليد لمنع دبق.
2. ضبط درجة الحموضة من الحل الكولاجين ل10/09 مع بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ويقلب في RT لمدة 30 دقيقة. مراقبة راسب الكولاجين، مما تسبب في حل ليصبح غائما.
3. تدور باستمرار الحل الكولاجين عجلت في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة. وينبغي أن يكون واضحا، مثل هلام يعجل مرئية في الجزء السفلي من الأنابيب. نضح والتخلص السليم من السوائل طاف.
4. Resuspend والكولاجين عجلت في 200 مل من الميثانول بنسبة 0.1 N حمض الهيدروكلوريك والسماح للرد فعل مثيلة لتحدث مع التحريك في RT لمدة 4 أيام. والكولاجين لا يحل، ولكن يجب أن تتفكك إلى قطع صغيرة جدا واضحة من شأنها أن تجعل الحل غائم.
5. بعد مثيلة، الطرد المركزي الحل في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة لتكوير الكولاجين الميثيلي. نضح والتخلص من طاف الميثانول المحمض.
6. حل الكولاجين ميثليته في 25 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، وإعطاء تركيز حوالي 3 ملغ / مل، مع pipetting لالمتكررة، وتصفية حل من خلال مصفاة الخلية 60 ميكرومتر. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7،3-7،4 باستخدام 20 ميكرولتر الزيادات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
7. تقييم concentratioن من الحل باستخدام الكولاجين الفئران التجاري ELISA عدة أو هيدروكسي عدة الفحص. تمييع الحل إلى 3 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
8. تعقيم الحل الكولاجين ميثليته من قبل نقلها إلى زجاجة مع غطاء المسمار، طبقات بعناية 3 مل من الكلوروفورم في الجزء السفلي من القمقم، والسماح للزجاجة لضبط O / N عند 4 درجات مئوية، ثم جو معقم و مطهر إزالة وتخزين الطبقة العليا، وهو الكولاجين الميثيلي.
9. تخزين الحل في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1.

3. الكولاجين Succinylation

1. تمييع الآخر 100 ملغ من، المحمضة (درجة الحموضة 2-3) حل الكولاجين الأصلي إلى تركيز 0.5 ملغ / مل مع الماء المعقم الجليد البارد والحفاظ على حل على الجليد لمنع دبق.
2. ضبط درجة الحموضة من الحل الكولاجين ل10/09 مع بضع قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ويقلب في RT لمدة 30 دقيقة. الكولاجين يجب أن يعجل، مما تسبب في حل ليصبح غائما.
3. حل 40 ملغ من يمثcinic أنهيدريد (0.4 ملغ لكل ملغ من الكولاجين) في 10 مل من الأسيتون (1/20 ^عشر حجم الحل الكولاجين). ببطء (في ما يقرب من 0.5 مل الزيادات) إضافة هذا الخليط إلى حل الكولاجين مع التحريك في حين رصد مستمر لدرجة الحموضة. الحفاظ على درجة الحموضة فوق 9.0 عن طريق إضافة 1 أو 2 قطرات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم مع اقتراب الرقم الهيدروجيني 9.0.
4. تواصل اثارة في RT لمدة 120 دقيقة بعد إضافة كل من السكسينك في الأسيتون. مراقبة الحل لتصبح واضحة كما يذوب الكولاجين succinylated. فحص دوري الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنها لا تزال فوق 9.0.
5. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 4.0 مع 20 الزيادات ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك. مراقبة الحل غائم مرة أخرى، كما يترسب الكولاجين succinylated.
6. بعد succinylation، الطرد المركزي الحل في 3000 × ز لمدة 25 دقيقة لتكوير الكولاجين succinylated. نضح والتخلص من طاف المحمضة مع السكسينك غير المتفاعل.
7. حل الكولاجين succinylatedفي 25 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، وإعطاء تركيز حوالي 3 ملغ / مل، مع pipetting لالمتكررة، وتصفية حل من خلال مصفاة الخلية 60 ميكرومتر. ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7،3-7،4 باستخدام 20 ميكرولتر الزيادات من 1 N هيدروكسيد الصوديوم.
8. تقييم تركيز المحلول باستخدام الفئران الكولاجين التجاري ELISA عدة أو هيدروكسي عدة الفحص. تمييع الحل إلى 3 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
9. تعقيم الحل الكولاجين succinylated من قبل نقلها إلى زجاجة مع غطاء المسمار، طبقات بعناية 3 مل من الكلوروفورم في الجزء السفلي من القمقم، والسماح للزجاجة لضبط O / N عند 4 درجات مئوية، ثم جو معقم و مطهر إزالة وتخزين الطبقة العليا، وهو الكولاجين succinylated.
10. تخزين الحل في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1.

4. التحقق من الكولاجين التعديلات

1. إعداد 1 مل عينات من كل الحلول الكولاجين الأم، مثيلة، وsuccinylated وتمييع إلى اضربentration من 0.1 ملغ / مل مع الماء النقي المعقم لأيون الهيدروجين المعايرة. وعلاوة على ذلك تمييع عازلة على الأقل 1000 أضعاف خلال غسيل الكلى ضد المياه من خلال 10 كيلو دالتون قطع membraneusing 3 تغييرات حل للا يقل عن 4 ساعة لكل منهما.
2. ضبط درجة الحموضة من الحلول إلى 7.3 مع كميات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. باستخدام الرقم الهيدروجيني 7.3 باعتبارها مرجعية التعسفي، نفذ الهيدروجين أيون المعايرة على كل من العينات كما وصفها Tanford ¹⁶ لإنشاء منحنيات المعايرة للحلول الكولاجين الأم، مثيلة، وsuccinylated.
3. رسم التغير في الرقم الهيدروجيني في حجم حمض أضاف مقابل عدد من H ملزمة ⁺ الأيونات في الجزيء. درجة الحموضة العالية "الأمينية" مجموعة يجب أن تظهر تحولا في الكولاجين succinylated نحو نقطة محايدة (فقدان مجموعات أمين)، وانخفاض الرقم الهيدروجيني "الكربوكسيل" مجموعة يجب أن تظهر تحولا نحو اليسار في الكولاجين الميثيلي (خسارة مجموعات الكربوكسيل ) والتحول نحو اليمين في الكولاجين succinylated (مكاسب في مجموعة الكربوكسيلالصورة)، بالمقارنة مع الكولاجين الأصلي.
4. تقييم فعالية رد الفعل succinylation من خلال تحديد٪ من المجموعات الأمينية في الكولاجين الأصلي استبداله succinylation باستخدام حامض 2،4،6-trinitrobenzenesulfonic (TNBA) الطريقة اللونية، بعد بروتوكولات موحدة ^17،18.

5. تصنيع أجهزة ميكروفلويديك والبذر الخلية

1. صنع أجهزة ميكروفلويديك باستخدام الأساليب القياسية ^9. استخدام صب متماثلة PDMS من SU-8 سادة على السيليكون تعريفها باستخدام ضوئيه لخلق ميكروفلويديك غرف زراعة الخلايا مع 100 ميكرون طويل القامة، 0،4-1،5 مم، و1-10 ملم قنوات طويلة لنمو الخلايا.
2. استخدام منظف البلازما لأكسدة أسطح الجهاز وشريحة زجاجية، ثم اضغط معا لالسندات. بعد تعقيم الجهاز عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وملء غرفة مع 50 ميكروغرام / مل فبرونيكتين في برنامج تلفزيوني العقيمة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
3. البذور الجهاز مع الخلايا، مثل الفئران الأساسي أو خلايا الكبد البشرية، والتي تتطلب جل الكولاجين لتحقيق الاستقرار في النمط الظاهري أو دولة التمايز. نحن نستخدم 20 ميكرولتر من طازجة معزولة خلايا الكبد في الفئران الابتدائي ^7،19 أو المتاحة تجاريا cryopreserved خلايا الكبد البشرية الأساسية المصنف في 14 × 10 ⁶ خلية / مل لكل جهاز.
4. السماح للخلايا لنعلق لمدة 4-6 ساعة، ثم تغسل الخلايا غير مرتبط واستبدال وسائل الإعلام الطلاء مع وسائل الاعلام النمو. احتضان O / N لضمان خلية كاملة الانتشار وإنشاء أحادي الطبقة متموجة من الخلايا.

6. طبقة تلو طبقة الكولاجين ترسب

1. في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة، وإعداد كميات كافية من الكولاجين حلول مثيلة وsuccinylated لمدة 10 تطبيقات كل حل لكل جهاز، فضلا عن عدد قليل من ملل من وسائل الاعلام. الحفاظ على الحلول على الجليد. نحن نستخدم 20 ميكرولتر (10-15 أضعاف حجم الجهاز الإجمالي) الكولاجين في طبقة لكل جهاز.
2. يكونحلج مع ميثليته (polycationic) الحل البديل بيغ الأجهزة مع 20 ميكرولتر من مميثل ثم succinylated حلول الكولاجين، في انتظار 1 دقيقة بين كل تطبيق. مسح الجهاز ما مجموعه 10 مرات في الحل الذي ينبغي أن تأخذ حوالي 20 دقيقة. العمل بسرعة لتقليل مقدار الوقت الخلايا دون وسائل الاعلام.
3. مراقبة الكولاجين تتراكم ببطء في مدخل / مخرج تبعا لحجمها. إذا كانت المقاومة ليزيد من تدفق السوائل، وطرد الجهاز مرة واحدة أو مرتين مع وسائل الإعلام، ومن ثم الاستمرار طبقات.
4. بعد تطبيق جميع الطبقات، وشطف الجهاز مرتين مع وسائل الإعلام الجديدة والعودة إلى الحاضنة. اعتمادا على نوع من الخلايا، والتغيرات التي يسببها المصفوفة خارج الخلية الشكلية، مثل تعزيز الاستقطاب في خلايا الكبد، يجب أن تكون مرئية في غضون ساعات قليلة.
5. إعداد التمثيلية الأجهزة للانتقال المجهر الإلكتروني باستخدام الأساليب القياسية ^{9 إلى} التحقق من وجود مصفوفة الكولاجينالتجمع على الجزء العلوي من الخلايا المستزرعة.

7. لتحقيق الاستقرار من النمط الظاهري خلية وظيفة

1. صورة مورفولوجيا الخلايا، والسلامة، والاستقطاب باستخدام أساليب موحدة لنوع من الخلايا. لخلايا الكبد، وجمع الصور أكثر من 14 أيام باستخدام المجهر المرحلة، ويعيش / تلطيخ الميت للبقاء، وCMFDA صبغ لاستقطاب القمي لإثبات آثار ترسب الكولاجين.
2. لمورفولوجيا الخلايا، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام النقيض من المرحلة المجهري.
3. لايف / تلطيخ الميت، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من حي / حل تلطيخ الميت مع دابي أعد باتباع إرشادات الشركة المصنعة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، وشطف الجهاز مرة أخرى مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام المجهر مضان.
4. لالصفراء كاناليتلطيخ culi، مسح الجهاز من خلال مدخل بواسطة ماصة مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لشطف، وضخ 20 ميكرولتر من 2 ميكرومتر CMFDA حل تلطيخ مع دابي أعد باتباع إرشادات الشركة المصنعة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، شطف الجهاز مرة أخرى مع 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وصورة الجهاز باستخدام المجهر مضان.
5. جمع وسائل الإعلام المستهلك وقياس منتجات الأيض الخلوية في نقطة زمنية مناسبة خلال مدة الثقافة لتحديد وظيفة الخلية. لخلايا الكبد، وقياس كمية الزلال واليوريا في وسائل الإعلام المستهلك.
6. إجراء تحليلات وظيفية نقطة النهاية على الخلايا نفسها، مثل تقييم مستويات انزيم النشاط، تلوين الأجسام المضادة، أو تحليل الحمض النووي الريبي. لخلايا الكبد، وحمل وقياس إنزيم السيتوكروم P450 الأنشطة أو المرحلة الثانية الاقتران أنزيم الجلوتاثيون S-ترانسفيراز.

النتائج

يمكن تعديل الكولاجين الأصلي باستخدام مثيلة وsuccinylation لإيجاد حلول الكولاجين polycationic وpolyanionic لاستخدامها في طبقة تلو طبقة ترسب. Succinylation يعدل مجموعات ε الأمينية الكولاجين الأصلي مع مجموعات succinyl، ومثيلة تعديل مجموعة الكربوكسيل الكولاجين الأصلي مع مجموعة الميثيل (الش?...

Discussion

يمكن إيداع سامسونج المجالس الكولاجين النقي على الخلايا مشحونة أو أسطح المواد باستخدام طبقة تلو طبقة ترسب الكولاجين تعديلها. وتظهر نتائج هذه الدراسة أن مثيلة وsuccinylation الكولاجين الأصلي إيجاد حلول الكولاجين polycationic وpolyanionic (الشكل 1) التي يمكن استخدامها مع تقني?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content