طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

Summary

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Abstract

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H₂O₂ into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H₂O₂ compared to a no H₂O₂ control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H₂O₂. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress^1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics^5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway^4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)^1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway¹⁰. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin¹¹. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)¹², which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway¹³. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin¹¹.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa¹². Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent¹². Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions¹⁴. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time¹, or oxidative stress disc diffusion assays¹⁵. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H₂O₂ and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد الثقافة وسائل الإعلام، والمضادات الحيوية، و2- [2-نيترو-4- (ترايفلوروميثيل) بيروكسايد] -1،3-cyclohexanedione (NTBC)

1. جعل LB مرق (1٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.25٪ كلوريد الصوديوم في H ₂ O) وقسامة في أحجام مناسبة. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
2. جعل 100 مل LB أجار (1٪ تريبتون، و 0.5٪ مستخلص الخميرة، 0.25٪ كلوريد الصوديوم، 1.5٪ أجار في H ₂ O) في 250 مل القوارير. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. ضمان آغار ذاب قبل صب في لوحات.
   ملاحظة: قوارير تحتوي على 100 مل من LB أجار سوف تسفر عن 4 لوحات. كمية LB أجار يمكن تغييرها لتتوافق مع عدد من لوحات اللازمة للفحص.
3. جعل PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي _نا 2 هبو _4، 2 مم KH ₂ PO ₄₎ ^16. تعقيم بواسطة الأوتوكلاف أو الترشيح وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
4. إعداد الحلول الأسهم المضادات الحيوية للجنتاميسين، الكاناميسين، وهود التوبراميسين.
   1. إعداد تركيزات الأسهم المضادات الحيوية المناسبة لP. سلالات الزنجارية تحتوي على 100 ​​ملغ / مل جنتاميسين، 30 ملغ / مل الكانامايسين، و 10 ملغ / مل التوبراميسين. حل المضادات الحيوية في المياه، تعقيم فلتر (0.2 ميكرون)، وتخزينها في 4 درجات مئوية. تغيير المضادات الحيوية وتركيزات اعتمادا على البكتيريا التي شملتها الدراسة.
5. إعداد الحلول الأسهم NTBC. حل 10 ملغ من NTBC في 400 ميكرولتر من DMSO. هذه تعطي تركيز 75.9 ملي NTBC. مخزن الحلول الأسهم NTBC في -20 ° C. حلول ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة حسب الحاجة.
   ملاحظة: مصادر مختلفة NTBC خلافات في الذوبان. تحديد الوسيلة المناسبة التي بحل NTBC بناء على توصيات الشركة الصانعة وضبط الخطوة 1.5 وفقا لذلك.

2. NTBC المعايرة من السلالات البكتيرية

1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات لفحصها. إضافة 2 مل مرق LB إلى 16 × 150 مم أنبوب اختبارالصورة (واحد لكل سلالة) وتطعيم مع 1 مستعمرة معزولة من كل سلالة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع تهوية على محور دوار زراعة الأنسجة في حاضنة الهواء.
2. في اليوم التالي، وإعداد المعايرة من NTBC في LB مرق. استخدام مجموعة الأولي 0-900 ميكرون NTBC منذ السلالات المختلفة لديها اختلافات في الحساسية للNTBC.
   1. إضافة 1 مل مرق LB إلى 4-5 أنابيب الاختبار (16 × 150 ملم) في سلالة.
   2. إضافة محلول المخزون NTBC (75.9 ملم) للأنابيب الاختبار (16 × 150 ملم) في مجموعة من تركيزات. انظر الجدول رقم 1 لتركيزات NTBC وكميات الأسهم المقابلة لإضافة إلى 1 مل من مرق LB.
3. قياس OD _{600 من} الثقافات بين عشية وضحاها. غسل الثقافات قبل اتخاذ OD ₆₀₀ قراءات للقضاء على pyomelanin الحاضر في وسائل الإعلام.
   1. غسل الثقافات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف وأي خلايا مكعبات فضفاضة معوmicropipettor و resuspend بيليه خلية الصلبة في 1 مل LB.
4. تطعيم أنابيب المعايرة في OD ₆₀₀ 0.05. حساب كمية ثقافة غسلها اللازمة لتطعيم الأنابيب.
   ملاحظة: استخدم الثقافات غسلها عن التطعيمات منذ pyomelanin يجب أن لا تكون موجودة.
5. احتضان أنابيب المعايرة لنحو 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع تهوية باستخدام ثقافة المدورة الأنسجة في حاضنة الهواء.
6. تصوير أنابيب المعايرة ومقارنة إنتاج الصباغ داخل وبين سلالات لتحديد مقدار NTBC لاستخدامها في هيئة التصنيع العسكري والاكسدة المقايسات. استخدام OD ₆₀₀ قراءات لتحديد مقدار pyomelanin في خلية ثقافة خالية طاف وتحديد كثافة الخلية.
   ملاحظة: نسبة OD _{600 من} pyomelanin في ثقافة طاف للخلايا يمكن أن تحسب لتحديد الاختلافات في إنتاج pyomelanin بعد العلاج مع NTBC.

3. المضادات الحيوية الدنيا Inhibiحزب المحافظين تركيز (MIC) الفحص في لوحات 96-جيدا

1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات التي سيتم اختبارها في LB مع وبدون NTBC.
   ملاحظة: يتم وصف هذا البروتوكول باستخدام مستوى تمثيلي من 300 ميكرومتر NTBC. يتم تحديد المستوى المناسب من NTBC لاستخدامها في الخطوة 2.6.
   1. إضافة 300 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل LB. إضافة ما يعادل حجم سيارة (DMSO) إلى 2 مل LB للشرط لا NTBC.
   2. استخدام المسواك العقيمة، تلقيح الأنابيب مع واحد مستعمرة معزولة من البكتيريا. سوف تكون هناك ثقافة واحدة مع NTBC وثقافة واحدة دون NTBC لكل سلالة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية مع تهوية باستخدام ثقافة المدورة الأنسجة في حاضنة الهواء.
2. في اليوم التالي، وجعل LB + NTBC والحلول سيد LB + DMSO لإعداد مقايسة هيئة التصنيع العسكري. إضافة NTBC بتركيز 600 ميكرومتر لأن هذا سوف تضعف اثنين أضعاف عند إضافة اللقاح، مما أسفر عن تركيز النهائي من 300 ميكرومتر.
   1. لاختبار عنتيبي واحدأمام الأذن لسلالة واحدة، إضافة 600 ميكرومتر NTBC إلى 2 مل LB وتخلط لجعل الحل الرئيسي NTBC. إضافة ما يعادل حجم سيارة (DMSO) إلى 2 مل LB وتخلط لجعل أي حل سيد NTBC. استخدام هذه الحلول لإيجاد حلول الأسهم المضادات الحيوية فضلا عن إعداد سلسلة التخفيف في لوحات 96-جيدا.
      ملاحظة: إن الصياغات حل سيد تسفر عن حل إضافي لحساب الأخطاء pipetting ل. يمكن زيادتها الحلول سيد أعلى أو لأسفل كما هو مطلوب اعتمادا على عدد من المضادات الحيوية والسلالات التي تم اختبارها.
3. إعداد الحلول للمضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
   ملاحظة: يجب أن يكون تركيز المضادات الحيوية في هذه الحلول ضعف التركيز النهائي المطلوب. ينبغي حل ما يكفي لنقل 100 ميكرولتر إلى أربع آبار في لوحة 96-جيدا.
   1. إعداد جنتاميسين +/- NTBC حل السهم عند 64 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 0.288 ميكرولتر من الأسهم الجنتاميسين (100 ملغ / مل) إلى 450ميكرولتر LB + NTBC أو حل سيد LB + DMSO.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز الجنتاميسين لP. الزنجارية PAO1 هو 32 ميكروغرام / مل.
   2. جعل كانامايسين +/- NTBC حل السهم عند 256 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 3.84 ميكرولتر من الأسهم كانامايسين (30 ملغ / مل) إلى 450 ميكرولتر LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
      ملاحظة: الحد الأقصى لتركيز كانامايسين لP. الزنجارية PAO1 هو 128 ميكروغرام / مل.
   3. إعداد التوبراميسين +/- NTBC حل الأوراق المالية في 8 ميكروغرام / مل. لجعل هذا الحل، إضافة 0.36 ميكرولتر من الأسهم التوبراميسين (10 ملغ / مل) إلى 450 ميكرولتر LB + NTBC أو LB + DMSO حلول الرئيسي.
      ملاحظة: للحصول على P. الزنجارية PAO1، وأقصى تركيز التوبراميسين هو 4 ميكروغرام / مل.
      ملاحظة: المضادات الحيوية وتركيزات يمكن تعديلها للبكتيريا لفحصها.
4. إضافة 100 ميكرولتر من كل حل مضاد حيوي 2X إلى أربع آبار في لوحة 96-جيدا. وضع هذه الحلول في الصف A. لالامثلهه، ينبغي أن توضع الجنتاميسين في A1 من خلال A4، ينبغي أن توضع كانامايسين في A5 من خلال A8، وينبغي أن توضع التوبراميسين في A9 من خلال A12. انظر الشكل 1A لرسم تخطيطي لوحة 96-جيدا اقامة.
   ملاحظة: يمكن اختبار مضادات حيوية متعددة في لوحة واحدة، ولكن يجب اختبار سلالة واحدة فقط لكل لوحة للقضاء على احتمال انتقال التلوث من سلالات أخرى.
5. إضافة 50 ميكرولتر من الحل الرئيسي LB + NTBC أو LB + DMSO إلى صفوف B خلال H من لوحة 96-جيدا. تأكد من أن لوحة واحد هو LB + NTBC ولوح واحد هو LB + DMSO. انظر الشكل 1A.
   1. استخدام LB + NTBC للمضادات الحيوية في LB + NTBC. استخدام LB + DMSO للمضادات الحيوية في LB + DMSO.
6. باستخدام micropipettor إجراء عمليتين التخفيفات المسلسل أضعاف من المضادات الحيوية عن طريق نقل 50 ميكرولتر من الحل من صف إلى صف A B. مزيج الحل، تغيير نصائح الماصة، ونقل 50 ميكرولتر من الحل من صف إلى صف B C. كرر ل وremainiالصفوف نانوغرام. بعد إضعاف الصف G، وإزالة 50 ميكرولتر من الحل من هذا الصف ونبذ. استخدام الصف H باعتباره لا سيطرة للمضادات الحيوية لنمو البكتيريا. انظر الشكل 1B.
   ملاحظة: كل بئر في الصفوف من A إلى G يحتوي الآن على 50 ميكرولتر من المضادات الحيوية في LB + NTBC أو LB + DMSO في 2X تركيز النهائي المطلوب. الصف H يحتوي LB + NTBC أو LB + DMSO مع عدم وجود المضادات الحيوية.
7. قياس OD _{600 من} الثقافات بين عشية وضحاها. غسل جميع الثقافات قبل اتخاذ OD ₆₀₀ قراءات للقضاء على pyomelanin الحاضر في وسائل الإعلام.
   1. غسل الثقافات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من الثقافة في microcentrifuge في 16000 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف مع micropipettor و resuspend بيليه خلية في 1 مل LB.
8. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها إلى 2.75x10 ⁵ كفو / مل في LB.
   ملاحظة: افترض أن OD ₆₀₀ وحدة واحدة هي ما يعادل 1X10 ⁹ كفو / مل لP. الزنجارية. OD إلى كفو / مل التحويلات يمكن دifferent في البكتيريا الأخرى.
9. إضافة 50 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف إلى البئر المناسب.
   ملاحظة: الثقافات التي تزرع في NTBC ينبغي أن يضاف إلى الآبار التي تحتوي ينبغي أن يضاف NTBC والثقافات التي تزرع في DMSO إلى الآبار التي تحتوي على DMSO. انظر الشكل 1B.
   1. إضافة البكتيريا إلى ثلاثة آبار لكل سلالة وتركيز المضادات الحيوية. إضافة 50 ميكرولتر من LB إلى البئر الرابع ليكون بمثابة الرقابة على التلوث الجرثومي. انظر الشكل 1B.
   2. استخدام micropipettor متعدد القنوات لتطعيم الآبار. ضمان الماصة النصائح بالقرب من قاع الآبار عند إضافة اللقاح لمنع تلوث الآبار المجاورة.
      ملاحظة: سيتم إضافة ثقافة البكتيرية إلى الآبار تمييع تركيزات المضادات الحيوية وNTBC اثنين أضعاف.
10. تغطية لوحات 96-جيدا مع parafilm واحتضان ما يقرب من 24 ساعة على 37 درجة مئوية. احتضان لوحات 96-جيدا بشكل ثابت، في حاضنة الهواء.
11. بحثلوحات لنمو البكتيريا في الآبار. هيئة التصنيع العسكري هو أدنى تركيز المضادات الحيوية التي لا ترى نمو البكتيريا لجميع مكررات ثلاثة من كل سلالة.
    1. بصريا فحص لوحة للنمو أو قراءة باستخدام قارئ مجموعة لوحة لOD _​​600.

4. بقعة لوحة الفحص لمؤكسد الاستجابة للضغط النفسي

1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات التي سيتم اختبارها في LB مع وبدون NTBC كما هو موضح في الخطوة 3.1.
2. في اليوم التالي، وإعداد لوحات أجار LB التي تحتوي على H _{2 O 2} هو من الضغوطات الأكسدة. وهناك مجموعة من H _{2 O 2} تركيزات 0-1 مم هي نقطة انطلاق جيدة.
   1. إذابة قوارير أجار LB. وسائل الإعلام باردة إلى حوالي 50 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة.
   2. إضافة H _{2 O 2} مباشرة إلى وسائل الإعلام تبريد في تركيزات المطلوب. قوارير دوامة لخلط. انظر الجدول رقم 2 لتركيزات H _{2 O 2}ومجلدات من H _{2 O 2} المركزة لإضافة. وتستند هذه القيم على 100 مل من LB أجار.
   3. صب لوحات على الفور بعد إضافة H _{2 O 2} واللهب السطح لإزالة الفقاعات. العائد هو 4 لوحات لكل 100 مل من LB أجار. احتفال لوحات مع تركيز H _{2 O 2.}
   4. وضع لوحات في كشف غطاء تدفق البيولوجي مع مروحة تعمل لمدة 30 دقيقة لإزالة الرطوبة الزائدة من لوحات.
      ملاحظة: استخدام لوحات في اليوم نفسه انهم مستعدون. قد يؤدي عدم القيام بذلك سيؤدي في البيانات غير متناسقة.
      ملاحظة: الضغوطات الأكسدة مثل الباراكوات يمكن أن تكون بديلا عن H _{2 O 2} في هذا الاختبار. التركيزات المستخدمة لالضغوطات المؤكسدة أخرى قد تختلف عن تلك المستخدمة لH _{2 O 2.}
3. غسل وقياس OD _{600 من} الثقافات بين عشية وضحاها كما هو موضح في الخطوة 3.7.
4. تطبيع OD _{600 من} كل متر مكعب بين عشية وضحاهاltures إلى أدنى قيمة لمجموعة من السلالات التي يجري اختبارها. P. الزنجارية ديه عموما OD _{600 من} حوالي 2.5 عندما نمت بين عشية وضحاها في LB + NTBC أو LB + DMSO.
   1. تحديد حجم الثقافة اللازمة لتمييع الثقافة إلى أدنى OD ₆₀₀ في إجمالي حجم 1 مل. على سبيل المثال، إذا كان لديه ثقافة OD _{600 من} 3 وأدنى OD ₆₀₀ لمجموعة من سلالات 2.5، إجراء العملية الحسابية التالية: (2.5) (1 مل) = (3) (خ). س = 0.833 مل. سيتم وضعها 0.833 مل من ثقافة في أنبوب microfuge.
   2. حساب كمية LB + NTBC (300 ميكرومتر) أو LB + DMSO اللازمة لتبرزي حجم الثقافة إلى 1 مل. على سبيل المثال في خطوة 4.4.1، ومقدار LB + NTBC أو LB + DMSO تضاف إلى ثقافة سيكون 0.167 مل (1 مل السعة الإجمالية - 0.833 مل الثقافة). جعل الحلول الأسهم من LB + NTBC وLB + DMSO لاستخدام هذه التخفيفات على أساس حجم اللازمة لتمييع كل السلالات.
   3. مزيج من الثقافة وLB + Nالدرن أو LB + DMSO قبل vortexing.
5. للحفاظ على الثقافات في تركيز ثابت من NTBC أو DMSO، نفذ عشرة أضعاف التخفيفات المسلسل من الثقافات بين عشية وضحاها تطبيع في برنامج تلفزيوني + NTBC أو برنامج تلفزيوني + DMSO.
   1. جعل الحلول الأسهم من برنامج تلفزيوني + NTBC وPBS + DMSO. لمجموعة واحدة من التخفيفات لسلالة واحدة، ومزيج 300 NTBC ميكرومتر أو ما يعادل حجم DMSO مع برنامج تلفزيوني أن تسفر عن إجمالي حجم 720 ميكرولتر. توسيع نطاق هذه الأسهم صعودا أو هبوطا حسب عدد سلالات يتم اختبارها.
   2. أنابيب التسمية microfuge لمدة 10 ^-1 من خلال التخفيفات 10 ^-7 التسلسلية. إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + NTBC أو برنامج تلفزيوني + DMSO للأنابيب المناسبة. استخدام PBS + NTBC للسلالات التي تزرع في LB + NTBC واستخدام PBS + DMSO للسلالات التي تزرع في LB + DMSO.
   3. إضافة 10 ميكرولتر من ثقافة إلى مناسبة 10 ^-1 أنبوب التخفيف. مزيج من قبل vortexing ونقل 10 ميكرولتر من التخفيف 10 ^-1 إلى أنبوب التخفيف 10 ^-2. كرر حتى يكون كل التخفيفات PERFOrmed. تغيير نصائح الماصة بين التخفيفات.
6. بقعة 5 ميكرولتر من 10 ^-3 خلال 10 ^-7 التخفيفات على LB + H _{2 O 2} لوحات من نسختين لكل سلالة. استخدم إحدى طرف الماصة إذا مطلي البقع من معظم تمييع لأقل مخفف (10 ^-7 إلى 10 ^-3). لا تلميح أو إمالة لوحة حتى يجف السائل في لوحة.
7. احتضان لوحات لمدة 24-48 ساعة عند 37 ° C (حاضنة الهواء)، اعتمادا على سلالة.
   ملاحظة: P. سوف الزنجارية PAO1 ديك المستعمرات جيدة الحجم على LB بعد 24 ساعة من الحضانة. احتضان سلالات حتى لديهم مستعمرات تقريبا نفس حجم PAO1.
8. تصوير لوحات باستخدام كاميرا CCD فوق transluminator. اختياريا، تحرير الصور لوعلى النقيض من المحاصيل لنفس الحجم. حساب عدد المستعمرات في كل بقعة لتحديد التغيرات في حساسية لالاكسدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

معايرات NTBC

استخدمت المعايرة NTBC لتحديد ما إذا كان NTBC قادرة على خفض الانتاج pyomelanin في P. الزنجارية، وأيضا تحديد تركيز NTBC أن يلغي أو يقلل pyomelanin إنتاج للاستخدام في فحوصات إضافية. قد تكون هناك اختلافات في مستويات pyomelanin المنتجة في م?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates¹² (Figure 2). The...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Also called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O.  Stabilized.
Gentamicin	Gold Bio	G-400-100	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906-5	Soluble in H2O.  Filter sterilize.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Soluble in H2O.  Filter sterilize.