تقييم التوعية السلوكية التي يسببها الكوكايين ومشروطة مكان الأفضلية في الفئران

Summary

This protocol is intended to enable researchers to conduct experiments designed to test these aspects of addiction using the conditioned place preference and locomotor behavioral sensitization assays.

Abstract

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to drugs of abuse make lasting alterations in the brain function of vulnerable individuals, and these persistent alterations likely serve to maintain the maladaptive drug seeking and taking behaviors characteristic of addiction/dependence². In rodents, reward experience and contextual associations are frequently measured using the conditioned place preference assay, or CPP, wherein preference for a previously drug-paired context is measured. Behavioral sensitization, on the other hand, is an increase in a drug-induced behavior that develops progressively over repeated exposures. Since sensitized behaviors can often be measured after several months of drug abstinence, depending on the dose and length of initial exposure, they are considered observable correlates of lasting drug-induced plasticity. Researchers have found these assays useful in determining the neurobiological substrates mediating aspects of addiction as well as assessing the potential of different interventions in disrupting these behaviors. This manuscript describes basic, effective protocols for mouse CPP and locomotor behavioral sensitization to cocaine.

Introduction

Research aimed at understanding drug addiction using animal models must take a variety of approaches to address each of the assorted components that obstruct treatment success, including reward/reinforcement/motivation and withdrawal and relapse, as well as the general persistence that further complicates these issues in addiction. Since rewarding experiences associated with taking a drug of abuse are thought to motivate subsequent use, studies focusing on drug-context associations may be particularly useful for understanding brain mechanisms that contribute to drug taking and seeking. One such assay, conditioned place preference (CPP) is a high-throughput method for comparing group differences in reward sensitivity. The traditional interpretation of the task involves classical, or Pavlovian, conditioning, where a conditioned stimulus (CS) is paired with an unconditioned stimulus (UCS), and after multiple pairings, the CS elicits the same behavior as the UCS (however, see^39,40). Theoretically, animals learn to associate an interoceptive state (reward or aversion) with contextual cues. The relative aversive or appetitive intensity of the interoceptive state is then assessed by then determining the animal's preference for the contextual cues. The use of place conditioning to measure drug-reward associations dates back to at least 1957, to a study using morphine on rats in a Y-maze^3,4. Over the past several decades, variations on this method have been widely used to study place preference and aversion in rodents to various stimuli, and it remains particularly useful in the study of associations induced by drugs of abuse. In drug-addiction research, the assay has been used to assess the rewarding properties of a number of drugs and the contribution of different brain systems and proteins to drug reward (for reviews, see^5-7,44). While there are superior methods of assessing factors that contribute to drug addiction, namely drug self-administration, CPP is a simple and much more accessible approach to measuring reward function.

Most current protocols for conditioned place preference and aversion (CPA) use an apparatus that allows rodents to have access to two distinct chambers, either via a doorway or smaller connecting chamber. Distinctions between the two chambers are often based, at a minimum, on visual and tactile cues, including wall color and floor texture, but sometimes include other elements, such as olfactory cues. "Biased" designs typically attempt to reverse a pre-existing, innate preference for one chamber over the other, such as the one that rodents generally show for a black chamber over white. "Unbiased" designs aim to create a preference to one of two chambers that were initially equally appealing by randomly counterbalancing assignment to either chamber within a group. A "balanced" design is used when animals show small preferences, but do not, as a group, favor the same chamber. Goals of this latter design are to produce 1) pre-test preference scores for the (eventual) cocaine-paired chamber that are not significantly different between experimental groups and 2) negligible preference for the cocaine-paired chamber at pre-test, either positive or negative⁸. The balanced design is ideal for use with the described chambers, which utilize contradicting biases for wall color (black over white) and flooring (wire over bar), resulting in a roughly equal distribution of small preferences for both the black and white sides in different animals. Balancing calculations are described in further detail below.

During conditioning, animals are exposed to a drug and quickly placed into one of these two environments for a limited time period. Exposure is typically via intraperitoneal (i.p.) or sometimes subcutaneous (s.c.) injection, although paradigms for intravenous (i.v.) self-administration⁹, and intracranial infusions³⁸ in a place preference apparatus have also been developed. These pairings are complemented by non-drug (vehicle) pairings of the same length conducted in the opposite chamber, which can take place on the same day as drug pairings or on separate days. In general, when allowed to explore the apparatus after conditioning, animals will spend more time where they received a rewarding drug (i.e., one that humans and animals will voluntarily self-administer), while they will avoid a place where they were given a drug that induced illness (e.g., lithium chloride). Several studies have been dedicated to optimizing the conditions for place preference to different drugs of abuse (for review, see⁷). Cocaine doses (i.p.) for mice generally range from 1 to 20 mg/kg, with doses less than 5 mg/kg often used to parse high sensitivity in one group. Two or more drug pairings are typically required for adult mice¹⁰, and the length of these pairings is an important consideration. Very low doses of cocaine require an immediate and brief conditioning, likely because this method captures the most rewarding period of the exposure. Delayed or very long conditioning periods can result in no preference, or may even induce aversion^11,12. Here is presented a basic method for obtaining conditioned place preference to cocaine in adult mice.

While the CPP assay is an ideal method for assessing reward-related learning and memory of drug-context associations, behavioral sensitization is arguably easier to perform and allows the assessment of changes that develop over repeated treatment. Also known as reverse-tolerance, behaviors undergoing sensitization are incrementally enhanced over repeated exposures to a particular drug of abuse, especially psychostimulants, and cross-sensitization is known to occur between some, but not all, of these drugs. One of the first assessments of cocaine-induced locomotor sensitization, in particular, in rodents was published in 1976¹³. A number of labs have shown that sensitized locomotion is detectable long after drug cessation, depending on the original length, location and dose of exposure^14-17, and the current protocol has been used to detect sensitization as long as 10 months following seven days (30 mg/kg) of cocaine treatment in mice¹⁸. The test can be performed using either photobeam or video-tracking technologies, in apparatuses of differing sizes and shapes, making it simple for many labs to perform. The robust nature, simplicity and persistence of locomotor sensitization makes its assessment an ideal part of examining basic mechanisms of long-lasting changes in drug-induced behavior.

As is expanded upon in the discussion, an important consideration when performing the locomotor sensitization assay is whether drug is given in the home- or test-cage environment. To take advantage of the robust sensitization that occurs when drug administration occurs outside of the home cage, this protocol employs this method. However, it has been observed that when animals are not adequately habituated to a new environment before drug exposure, a novelty-induced ceiling effect occurs on Day 1, which can partially or fully mask the progressive nature of sensitization. It is likely that this represents synergistic locomotor-activating effects of the drug together with novelty, and while the mechanisms underlying such effects may be interesting, the method described is designed to reduce the role of novelty and allow the effects of the drug to be measured more independently. While it is expected this method will be useful in the assessment of other locomotor-sensitizing drugs, it has primarily evaluated its effectiveness with cocaine in C57BL/6 mice.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم مستشفى ماكلين. ملاحظة: يصف بروتوكول اتباع نهج واحد لحزب الشعب الكمبودي والتوعية الحركي، الكثير من التفاصيل التي تختلف عن غيرها من البروتوكولات ناجحة (على سبيل المثال، ضوئية مقابل في المرحلة المظلمة الاختبار، على التوالي مقابل جرعات متقطعة، وما إلى ذلك). قد ترغب المبتدئين لتبدأ هذه البروتوكولات، أو ببساطة استخدامها كأدلة، والتكيف مع التغيرات من الأدب على أساس تجريبي السؤال (ق) في متناول اليد. ووصف طرق القياس الآلي. ومع ذلك، فإنه من الممكن استخدام وسائل غير مؤتمتة لكل فحص (أي، تسجيل الفيديو، ومن ناحية التهديف).

1. مشروطة مكان الأفضلية

1. المعدات وغرفة تعيين الهاتفي:
   1. التعامل مع فئران التجارب لمدة 1-3 دقيقة كل يوم، لمدة 3-5 أيام على الأقل قبل الاختبار.
      ملاحظة: التعامل معها أبدا الفئران قد تجد إزالة من تعزيز بنية الشع الغرفةssful، التي يمكن أن تتداخل مع أو تغيير تكييف.
   2. الحصول على أربعة أو أكثر من أجهزة حزب الشعب الكمبودي ثلاث غرف، مجهزة يفضل مع photobeams لجمع البيانات آليا ^(18). تأكد من أن كل غرفة واثنين من أكبر وغرف visually- وكثير اللمس، متميزة تربط ل، غرفة محايدة الصغيرة عبر الأبواب التي يمكن أن تثار / خفض للتحكم في الوصول. يجب الأغطية على كل من المجلسين فتح لإدراج / إزالة الفئران وأن يتم تنظيمها مع، يمكن السيطرة عليها بشكل فردي أضواء صغيرة (عكس الضوء) (واحدة لكل غرفة).
      ملاحظة: حزب الشعب الكمبودي تصاميم غرفة تختلف ويمكن شراؤها تجاريا أو التي شيدت من قبل الباحثين. لتصميم "متوازن"، وهي خطة الموصى بها هي واحدة أكبر غرفة مع الجدران البيضاء والأرضيات سلك الشبكة والآخر مع الجدران السوداء والأرضيات العارضة. يجب أن يكون غرفة الوسطى الجدران الرمادية والأرضيات شبكي الرمادية الصلبة. لأغراض التفسير، هذه الدوائر وسوف يشار إليها باسم "أبيض"، "الأسود" و "المتوسطة".يجب أن تكون الأغطية واضح زجاج شبكي. تكوينات حجرة بديلة (واحد أو اثنين من غرفة) هي أيضا ممكنة وناقشت مكان آخر (انظر مناقشة).
   3. إعداد غرفة كما سيتم خلال الاختبار: إيقاف أو مجموعة أضواء علوية لالأكثر خفوت الإعداد وإغلاق الباب. استخدام ضوء متر داخل كل غرفة وتعيين أضواء الغطاء بحيث الدوائر المتوسطة هي أكثر إشراقا قليلا (15-20 لوكس) من الدوائر السوداء والبيضاء (6-10 لوكس) وذلك للحد من الفئران من قضاء بعض الوقت هناك.
      ملاحظة: إذا كان متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في منتصف هو بقدر أو أكثر مما كانت عليه في غرف سوداء أو بيضاء، زيادة على النقيض الإضاءة هو موضح في الخطوة 1.1.3. بدلا من ذلك، استخدام الأرضيات أقل جاذبية للوسط. (على سبيل المثال، ~ 220 0.5 سم ثقوب قطرها، متباعدة بشكل متساو في 6 × 3.5 × ¼ "زجاج شبكي)، ولكن تجنب الوقوع في هذه القاعة مكره. التجريبية أي تعديلات لضمان أن يقلل في الوقت المتوسط ​​ليست بسبب انخفاض في إجمالي الاستكشافات (المعابر) .
   4. Program جمع البيانات آليا ( "الإجراء" الشكل 1A) أو يدويا جمع البيانات وفقا للمعايير التالية. تعيين تجارب تبدأ بناء أول كسر شعاع في أي من المجلسين تكييف. تعيين جلسات "اختبار" ليكون 20 دقيقة في طول وتتبع الوقت الذي يقضيه والحزم فواصل في كل غرفة. تعيين جلسات "تكييف" ليكون 30 دقيقة طويلة و(اختياريا) لقياس فواصل شعاع في كل غرفة. تعيين كافة أضواء غرفة لإلقاء الضوء أثناء المحاكمة.
   5. إعداد حجم الكامل من حل الكوكايين المطلوبة للتجربة في متناول اليد. حل الكوكايين حمض الهيدروكلوريك في 0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة)، مستندة على التركيز النهائي على وحدة ضخ 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم (على سبيل المثال، لجرعة من 5 ملغ / كغ، وتركيز الحل هو 0.5 ملغ / مل). خليط دوامة لمدة 30-45 ثانية، وتصفية العقيمة (0.2 ميكرون مرشحات حقنة) وتخزينها في RT.
2. الاختبار:
   ملاحظة: الجدول الزمني العام لحزب الشعب الكمبودي هو PRE-TEST، تكييف، وثم بعد الاختبار. يجوز فصل الاختبار القبلي من تكييف من 1-3 أيام. ومع ذلك، ينبغي تكييف واليوم بعد الاختبار تتم في أيام متتالية (الشكل 2A). يجب أن تبقى هذا التوقيت نفسه بالنسبة لجميع الأفواج في التجربة نفسها.
   1. اختبار خلال المرحلة الخفيفة الحيوانات باستخدام نفس الجهاز لكل حيوان مدار الأيام.
   2. كل يوم المحاكمة (أي، التجارب والأيام تكييف)، ونقل الفئران إلى حجرة الانتظار السلوكية والسماح لهم الجلوس دون عائق في أقفاص وطنهم لقبل المحاكمة 1-1.5 ساعة. اختيار الموقع حيث الفئران يمكن نقلها بسرعة من القفص لجهاز، مع أقل قدر من الاضطراب، عند بدء المحاكمة. تشغيل جميع المعدات بحيث أن أي ضوضاء المرتبطة الاختبار (على سبيل المثال، والمراوح المعدات) موجودة.
   3. تنظيف شامل كل جهاز (الجدران الداخلية والأرضيات وصواني) مع خفيفة، الكحول، وجلايكول-ether- أو القائمة على الأمونيا تعقيم مناديل قبل وبعد كل فأر (استخدام سامنوع البريد الأنظف في كافة مراحل التجربة). لا تهمل الأرضيات السفلى.
   4. تحقق من المقرر أن أضواء غرفة بشكل مناسب (خارج أو خافتة) في بداية كل يوم.
   5. المضي قدما في ما يلي وفقا لما إذا كان "اختبار" أو "تكييف" اليوم:
      1. على أيام المحاكمة 1 و 6 (أي قبل وبعد الاختبارات)، ووضع الأبواب بين غرفة في موقف فتح (الشكل 2B).
      2. تحميل "اختبار" برنامج الكمبيوتر وأدخل معرفات الحيوانية (الشكل 1A)، ثم إصدار أمر بدء (الشكل 1B)، إن وجدت.
      3. انخفاض بلطف كل فأر في غرفة الوسطى من جهاز المسندة إليه، ووجهه إلى الحائط الخلفي، وبهدوء إغلاق الغطاء. مرة واحدة يتم تحميل جميع الدوائر، ومغادرة قاعة الاختبار وتقليل الضوضاء.
      4. ترك الفئران داخل كل جهاز حتى أغلقت المحاكمات لجميع الفئران / انتهى (الشكل 1C). معطيات التجارب التصدير.
   <لى> فقط قبل أو بعد إجراء الاختبار القبلي لل، وزن الحيوانات. استخدام هذه الأوزان لحساب جرعة خلال تكييف.
   6. من أجل التحضير للمحاكمات تكييف، وحساب كل فأر في مرحلة ما قبل الاختبار "تفضيل" للدوائر السوداء والبيضاء عن طريق طرح الوقت الذي يقضيه في كل من هذه من الآخر (أي "الأسود ناقص الأبيض" و "الأبيض ناقص الأسود"، وانظر الشكل (3)، الأعمدة 9 و 10).
   7. منذ الفئران مع تفضيلات الأولية قوية تجعل التوازن الصعب، ووضع حدا مقبولا لعشرات تفضيل (على سبيل المثال، <33٪ من إجمالي وقت المحاكمة) واستبعاد الفئران التي تتجاوز ذلك من العمليات الحسابية. استخدام الحد الليبرالي (<66٪ من إجمالي وقت المحاكمة) لتعظيم إدراج عندما يكون من المحتمل الاستنزاف بعد اكتمال الاختبار (على سبيل المثال، بسبب بعيدا عن الهدف التلاعب الجراحية).
      ملاحظة: لا يزال الفئران تجاوز الحد يتم اختبارها، مع محاولة للحفاظ على تفضيلات قبل الاختبار متوازنة. وفي وقت لاحق، رالفئران ذات المناظر يمكن استبعادها من التحليل، وإذا لزم الأمر، لتحقيق التوازن عشرات قبل الاختبار. إذا المتطرفة التحيزات قبل الاختبار (أي،> 800 ثانية) تؤثر بشكل غير متناسب مجموعة واحدة، والنظر في تغيير البيئات تكييف و / أو استخدام فحوصات أخرى.
   8. اختيار غرفة سوداء أو بيضاء مثل غرفة الاقتران المخدرات لكل الماوس، ملخصا وفي الوقت نفسه عشرات تفضيل ما قبل اختبار المقابلة داخل كل مجموعة مع الأولويات التالية في الاعتبار:
      ملاحظة: احرص على تحقيق التوازن بين العشرات بين الجماعات داخل كل جماعة وكذلك عبر أي الأفواج السابقة.
      1. جعل المبالغ لجميع الفئات كما تعادل ممكن.
      2. جعل مبالغ أقرب إلى الصفر قدر الإمكان (أي اختيار الجانب المفضل لبعض الفئران والجانب غير المفضل للآخرين). إذا كان قريب من الصفر المبلغ هو المستحيل على أي مجموعة معينة، وإعادة ضبط جميع الآخرين إلى المباراة عن كثب على أفضل نتيجة يمكن الحصول عليها لمجموعة الحد، لصالح مجموعة السلبية قليلا تلخص مدىإيجابي.
      3. وبقدر الإمكان، والحفاظ على الواجبات السوداء مقابل أبيض ويفضل مقابل غرف غير المفضلة بالنسبة لأزواج المخدرات حتى داخل كل مجموعة.
      4. كما أنه ليس من الممكن دائما لتحقيق الأهداف المذكورة أعلاه، تصحيح أي انحرافات بجعل معارضة اعتبارات التوازن في الأفواج في وقت لاحق. ومع ذلك، في محاولة لتجنب إنتاج الأفواج مع متوسط ​​مختلفة بعنف تفضيلات قبل الاختبار.
   9. على تكييف يوم 2-5، ووضع الأبواب بين غرفة مغلقة في الموقف (الشكل 2C).
   10. إعداد الحقن الفردية مع الكوكايين (أيام 2 و 4) أو المالحة (أيام 3 و 5) حل، كما هو موضح في الخطوة 1.1.5 وبناء على وزن الجسم تقاس في مرحلة ما قبل الاختبار.
       وينبغي اختيار الجرعة فيما يتعلق التوقعات التجريبية، الاعتبارات المذكورة في المقدمة، والأرضية والسقف الآثار المحتملة: ملاحظة. غالبا ما يكون من الأفضل لإجراء تجارب مستقلة باستخدام اثنين على الأقل جرعات مختلفة.
   11. تحميل "جمعرفات الحيوان onditioning "برنامج الكمبيوتر وأدخل (الشكل 1A)، ثم إصدار أمر بدء (الشكل 1B)، إن وجدت.
   12. القفا وحقن كل فأر (الملكية الفكرية)، وتخفيض على الفور الى غرفة سوداء أو بيضاء المناسبة من جهاز المسندة إليها في مواجهة الحائط الخلفي، ثم بهدوء إغلاق الغطاء. مرة واحدة يتم تحميل جميع الدوائر، ومغادرة قاعة الاختبار وتقليل الضوضاء.
   13. إزالة الفئران من الغرفة الخاصة بهم أقرب إلى بالضبط 30 دقيقة ممكنا حتى (أي، تتم إزالة الفئران أول من الدوائر، بينما الفئران الأخرى لا تزال تكييف). إزالة الحيوانات كما بهدوء ممكن، دون إدخال الضوضاء.
3. التحليل الإحصائي:
   1. اختيار طريقة التحليل. إما وقت طرح قضى على الجانب يقترن المالحة خلال مرحلة ما بعد اختبار من الوقت الذي يقضيه على الجانب يقترن الكوكايين خلال الاختبار البعدي (الكوكايين - المالحة، ثانية) أو استخدام الوقت الذي يقضيه في غرفة-يقترن المخدرات في مرحلة ما بعد اختبارناقص الوقت قبل الاختبار قضى على غرفة-يقترن المخدرات.
      ملاحظة: في حالة استخدام الأسلوب الأول، أيضا الرسوم البيانية خط المؤامرة متوسط ​​الوقت الذي يقضيه في الوسط، غرف saline- ويقترن المخدرات خلال اختبارات بعد قبل ولكل مجموعة. بالمقارنة مع ما قبل الاختبار، ويجب أن مرحلة ما بعد اختبار تظهر زيادة الوقت في الجانب يقترن المخدرات وانخفض الوقت الذي يقضيه في الجانب يقترن المالحة (انظر الشكل 6، أسفل، ومناقشة لشرح).
   2. وهذا يتوقف على طبيعة وعدد من الجماعات يجري مقارنة، استخدام اختبار (ت)، واحدة أو اتجاهين أنوفا، حسب الاقتضاء، وربما مع تحليل ما بعد مخصصة، لتحليل أي من عشرات الطرح قدمت المذكورة.
      ملاحظة: عشرات تفضيل الكوكايين تميل إلى أن تكون متغيرة، وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون سلبية (أي، تشير إلى النفور من الجانب يقترن المخدرات). الفئران التي تظهر النفور لا يجب إزالة (ما لم تكن القيم المتطرفة الإحصائية)، حيث أن هذه نتيجة طبيعية ويرجح هامة لتحديد الاختلافات بين غرامoups. نتوقع أن يحتاج حجم العينة من 12 إلى 30 حيوانات في كل مجموعة، وهذا يتوقف على حجم تأثير العلاج.

2. الحركي للتوعية

1. المعدات وغرفة تعيين الهاتفي
   1. الحصول على 4 × 8 (X X Y) photobeam مجموعة (أبعاد خارجية 11.5 "× 20"). بناء على الغرفة ذات السقف المفتوح مصنوعة من زجاجي أسود (الأبعاد الداخلية 22 1/6 "× 13 ¾" × 9 3/8 ") لإيواء مجموعة الشكل (4A).
   2. إعداد غرفة الاختبار بحيث الضوء الأحمر (ceiling- أو الحائط) يمكن استخدامها أثناء الاختبار.
   3. إعداد دورات برنامج منفصلة عن التعود وحقن التجارب اليومية.
      1. تعيين المحاكمات التعود أن يكون بين 30-60 دقيقة، وحقن التجارب ما بين 60-120 دقيقة (الشكل 5B). طول الموصى بها لكل 60 دقيقة. حافظ على طول المحاكمة متناسقة عبر الأفواج متعددة داخل نفس التجربة.
      2. تعيين تجارب تبدأ ريكوrding على كسر شعاع الأولى التي يحدث بعد بدء إشارة البدء (الشكل 5B). للمحاكمة الحقن، وتعيين إشارة البداية حتى أن صناديق يمكن بدء فردي (وليس في انسجام تام)، إذا كان ذلك ممكنا.
      3. فواصل شعاع من المقرر أن يتم تسجيلها في المعرفة "صناديق"، ويفضل 5 دقائق لكل منهما (الشكل 5B).
   4. إعداد حجم الكامل من حل الكوكايين المطلوبة للتجربة في متناول اليد. حل الكوكايين حمض الهيدروكلوريك في 0.9٪ كلوريد الصوديوم (المالحة)، مستندة على التركيز النهائي على وحدة ضخ 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم (على سبيل المثال، لجرعة من 5 ملغ / كغ، وتركيز الحل هو 0.5 ملغ / مل). خليط دوامة لمدة 30-45 ثانية، وتصفية العقيمة (0.2 ميكرون مرشحات حقنة) وتخزينها في RT.
2. تجريب
   ملاحظة: إن المرحلة الأولى من اختبار تمتد ل10-11 أيام متتالية. الفئران تتلقى تجربتين اليومية: التعود (خالية من حقن)، والحقن. إدارة المالحة لأول ثلاثة إلى fأيامنا (انظر مناقشة لأهمية التعود المالحة)، والكوكايين لسبعة المقبل باستخدام نفس الجرعة (على سبيل المثال، 15 ملغ / كغ / يوم).
   1. كل يوم، يتأقلم الفئران في أقفاص وطنهم إلى غرفة المدخل السلوكي لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
   2. إعداد نظيفة القياسية واضحة أقفاص السكن الاكريليك الماوس الحجم مع طبقة رقيقة جدا من الفراش الطازجة (مثل رقائق الصنوبر)، وذلك لعدم photobeams غامضة، إن أمكن (الشكل 4C & D).
   3. أقفاص مكان ضد العمودي للمجموعة photobeam قرب نهاية واحدة، بحيث يتباعد خمس عوارض بالتساوي على طوله. لا يتم استخدام أشعة X-axis في هذا الاختبار (الشكل 4C & D).
   4. خذ الفئران من القفص وطنهم، وبترتيب عشوائي، القفا ووزن لهم. إزالة كل فأر من وزن القارب قاعدة الذيل (مع الدعم) ومكان مباشرة إلى من قفص الحركي المعين. تغطية كل قفص مع معيار تصفية أعلى الغطاء.
   5. إعداد الحقن الفردية ثالمالحة إيث أو حل الكوكايين، كما هو موضح في الخطوة 2.1.7، على أساس وزن الجسم في اليوم الحالي. تبدأ مع جرعة من 15 أو 20 مغ / كغ، والنظر في التجربة الثانية باستخدام جرعة أعلى أو أدنى (انظر مناقشة للعوامل ذات الصلة).
   6. مرة واحدة قد انتهت المحاكمات التعود لجميع الأقفاص، تحميل برنامج الحقن.
   7. في وقت واحد، وإزالة الفئران من لهم اختبار القفص، القفا وإعطاء الحقن الخاصة (IP). قبل أن تعود الماوس لقفص تجربتها، بسرعة البدء في إشارة البدء لهذا القفص (الشكل 5C، أسفل).
   8. بعد كل التجارب الحقن قد انتهت، والعودة الفئران لأقفاص وطنهم وغرفة مساكنهم.
   9. إذا رغبت في ذلك، والسماح الفئران إلى الخضوع لسلسلة من فترات الانسحاب وتحديات المخدرات، مثل ما يلي: نفس الجرعة من الأصلي، نصف جرعة، جرعة مضاعفة، ثم المالحة، والسماح قبل سبعة أيام من التحدي جرعة واحدة و06:57 أيام قبل كل تحديا إضافيا. ومهما كان خيار التحديات، maintaiن فترات انسحاب مماثلة في أنحاء الأفواج داخل التجربة.
      ملاحظة: إذا كانت الجرعة الأصلية عالية (على سبيل المثال، 30 ملغ / كغ أو أكثر)، يجب تخطي جرعة مزدوجة أو استبدالها مع جرعة أقل. التحدي المالحة يكشف أي تفعيل الحركي مشروطة بيئة يقترن الكوكايين وحده، وفي هذه العملية، وكمية الحركة توعيتهم التي هي تعتمد على الكوكايين (انظر مناقشة).
3. التحليل الإحصائي
   1. اختيار جزء (ق) من كل محاكمة التي سيتم استخدامها لتحليلها. معظم الحركة التي يسببها الكوكايين في القوارض يحدث في أول ~ 15-30 دقيقة بعد حقن المخدرات. اعتمادا على متغيرات المعنية، والنظر في تحليل الحركة التراكمي للنوافذ زمنية متعددة (على سبيل المثال، فإن أول 15، 30، 60 و / أو 120 دقيقة) أو التركيز على قطاعات مستقلة للمحاكمة.
   2. باستخدام الإطار الزمني المختار، خلاصة القول فواصل الحزم لكل حيوان يوميا لمدة التعود وحقن التجارب على حدة وبعد ذلكverage المبالغ لكل مجموعة. مؤامرة والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) في الرسم البياني الخط أكثر من كل الأيام. كما العلاجات قد يغير كيفية استجابة الفئران للدواء في وقت مبكر و / أو في وقت متأخر في كل محاكمة اليومية، كما رسم متوسط ​​فواصل شعاع مجموعة من 5 دقائق بن على مدى كل محاكمة اليومية.
      ملاحظة: التآمر المتوسطات النشاط اليومي للالتعود وحقن التجارب (على سبيل المثال، أول دقيقة 15) يجعل الأمر يبدو بشكل مصطنع وقلل التي تنقل عن طريق الحقن بالمحلول الملحي، ولكن تذكر أن النشاط له (على الأرجح) رفض هذا المستوى قبل نهاية التعود كل يوم .
   3. تحليل المياه المالحة والعلاج من تعاطي المخدرات أيام متتالية بشكل منفصل باستخدام تدابير المتكرر (RM) ANOVAs وجود عامل داخل موضوعات اليوم / الساعة وبما في ذلك أي عوامل بين-المواضيع في التصميم، حسب الاقتضاء. استخدام اختبار (ت) أو في اتجاه واحد أنوفا للتحقيق في الخلافات جماعة في يوم 1 من الكوكايين (التعرض الحاد)، وأنوفا متعدد المتغيرات لمواجهة التحديات. عند الاقتضاء، اتبع significancه مع الاختبارات بعد خاصة أو أحادي المتغير ANOVAs.

النتائج

وتظهر نتائج ممثلة من الفحص حزب الشعب الكمبودي في الشكل (6) باستخدام البرية من نوع الفئران C57BL / 6N في حوالي تسعة أسابيع من العمر. كان تصميم الدراسة مضروب 2 × 3 مختلطة، مع متغير داخل تخضع للاختبار (قبل وبعد) وتخضع بين-المتغير في المعاملة (المالحة والكوكايين 5 و 10 ملغ...

Discussion

يوضح هذا البروتوكول طرق مشروط مكان تفضيل والتوعية الحركي، كل منها يمكن أن يتم استخدامها من قبل مختبر متوسط ​​لتقييم جوانب المرونة السلوكية الناجمة عن المخدرات. كما هو الحال مع معظم التجارب السلوكية، هناك اعتبارات جديرة إضافية تتجاوز البروتوكول الأساسي. أولا، يمكن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cocaine Hydrochloride USP	Mallinckrodt Pharmaceuticals	0406-1520	Purchase and use (Schedule II controlled substance) for research purposes requires compliance and licensure according to state and federal law.
Conditioned Place Preference,  Three Compartment Apparatus with Manual Doors and Lights for Mouse	Med-Associates Inc.	MED-CPP-MS & MED-CPP-3013	Our laboratory has used these boxes; however, many alternative boxes are available & acceptable.
PAS-Home Cage Activity Monitoring Photobeam Arrays	San Diego Instruments	2325-0223 & 7500-0221	Our lab houses these arrays inside of custom built chambers, as described in the text.  There are alternatives available.
Disposable Sani-Cloth disenfecting wipes	PDI	13872