تقييم محيط بالغدد التناسلية حساسية والبروستات ماست تنشيط خلية في نموذج الفأر من فصل الأمهات حديثي الولادة

Summary

نحن قياس حساسية وتنشيط الخلايا البدينة الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية في البروستاتا من الذكور C57BL / 6 الفئران التي خضعت في وقت مبكر نموذج ضغوط الحياة - فصل الأمهات حديثي الولادة، وذلك للحث على نموذج ما قبل السريرية لمتلازمة آلام الحوض / المزمنة المزمنة التهاب البروستات.

Abstract

التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / CPPS) يحتوي على انتشار عمر 14٪ و هو التشخيص المسالك البولية الأكثر شيوعا للرجال الذين تقل أعمارهم عن 50 عاما، ومع ذلك هو اضطراب مزمن آلام الحوض لا يقل عن فهمها ودراستها. مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض التقرير بعد أن شهدت ضغوط الحياة في وقت مبكر أو إساءة المعاملة، التي يمكن أن تؤثر بشكل ملحوظ على أداء وتنظيم الغدة النخامية، الغدة الكظرية (HPA) المحور. تنشيط الخلايا البدينة، وهو ما ثبت على أن تزاد في كل من البول وإفرازات البروستاتا أعرب من المرضى CP / الهادئ، وينظم جزئيا تفعيل المصب من محور HPA. وقد استخدم الأطفال حديثي الولادة فصل الأمهات (NMS) لأكثر من عقدين من الزمن لدراسة نتائج ضغوط الحياة في وقت مبكر من نماذج القوارض، بما في ذلك التغيرات في المحور HPA والحساسية الحشوية. نحن هنا نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام NMS كنموذج قبل السريرية لCP / CPPS في الذكور C57BL / 6 الفئران. وصفنا منهجيةلأداء NMS، وتقييم آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية، والأدلة النسيجي للتنشيط الخلايا البدينة. ونحن نقدم أيضا أدلة على أن الإجهاد النفسي المبكر يمكن أن يكون لها تأثيرات طويلة الأمد على الجهاز البولي التناسلي الذكور في الفئران.

Introduction

آلام الحوض المزمنة ليست في حد ذاتها مرضا، بل هو مصطلح يرتبط مع الألم المستمر عفوية و / أو استحضر التي يعاني منها المرضى الذين شخصت مع متلازمة القولون العصبي (IBS)، والتهاب المثانة الخلالي / متلازمة المثانة المؤلمة (IC / PBS)، التهاب الأعضاء الأنثوية، أو التهاب البروستاتا المزمن / متلازمة آلام الحوض المزمنة (CP / الهادئ). وغالبا ما المرضية هذه المتلازمات ومشاركة العديد من الخصائص في أنه ليس لديهم علم الأمراض المرتبطة بها أو تحديد المسببات الكامنة، وإن كان قد أظهرت ضعف في جهاز المناعة والجهاز العصبي المركزي، والجهاز العصبي المحيطي للمساهمة في صيانة وتطور هذه الاضطرابات ^{1 -3.} المرضى الذين يعانون من ألم مزمن في الحوض أكثر عرضة للتقديم مع أعراض إضافية، واضطرابات الألم الوظيفية واضطرابات المزاج، بما في ذلك القلق، والاكتئاب، واضطراب الهلع ^{4-6 والذي} ارتبط مع سير تغير من hypothalamic- غير ذات صلة الحوض- pituitary-الغدة الكظرية (HPA) المحور ^10/07. التعرض لضغوط الحياة في وقت مبكر أو الصدمة هو عامل خطر كبير لتطوير تشوهات HPA وما يرتبط بها من متلازمات الألم المزمن ^10،11 وعلى هذا النحو، مجموعة فرعية كبيرة من المرضى الذين يعانون من اضطرابات آلام الحوض وظيفية بأنهن شهدت أحداث الطفولة السلبية مثل سوء المعاملة أو الإهمال ^12-14.

نماذج القوارض الفصل حديثي الولادة الأمهات (NMS)، والتي تنطوي على إزالة الجراء من السد لفترة معينة من الوقت خلال فترة preweaning، وقد استخدمت على مدى العقدين الماضيين لدراسة نتائج ضغوط الحياة في وقت مبكر. بشكل عام، وقد تبين NMS لزيادة HPA محور التنشيط، والسلوكيات مثل القلق الناتجة، التي تؤثر بشكل مباشر على التعبير الجيني داخل منطقة ما تحت المهاد، فضلا عن عرقلة تنظيم المصب من الهياكل الحوفي ^15-18. وقد تبين أن تعطل سير السليم محور HPA للمساهمة في زيادة القولون والمستقيم ^19-22 والمهبل ¹⁶ حساسية المعروضة من قبل القوارض NMS النماذج، ولكن على الرغم من توصيف واسعة من تأثير على المدى الطويل بعد الولادة التهاب المثانة ^23-25، وتأثير ضغوط الحياة في وقت مبكر قد ذهب إلى حد كبير غير مدروسة في الأجهزة التناسلية. ولذلك، فإن الدراسة التالية تصف كيفية أداء NMS في الفئران وبعد ذلك تقييم حساسية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية وتسلل الخلايا البدينة / التنشيط في البروستاتا للتحقق من استخدام الفئران الذكور للمرفق كنموذج قبل السريرية لCP / الهادئ.

لجميع المزمنة اضطرابات ألم الحوض تشخيص، CP / CPPS ربما تكون متلازمة الأقل المعترف بها جيدا، وتميزت، على الرغم من وجود انتشار عمر ما يقرب من 14٪ ²⁶ و تكاليف المريض سنوية تقدر ب 4400 $ (مرتين أن آلام أسفل الظهر أو المفاصل التهاب المفاصل ^27). المرضى الذين يعانون من CP / CPPS الألم تقرير في العجان والمستقيم والبروستاتا والقضيب والخصيتين، و / أو البطن ^28، تجربة مرحبايتم تشخيص درجة gher من الضغط النفسي من المرضى التحكم ^29، والحاضر عادة مع أعراض أو مع الحوض المزمنة الألم أو الإضطرابات المزاجية المرضية ^5،29-31. العدوى المتكررة، ظهارة تتسرب منها المياه، والتهاب الأنسجة العصبية، وأمراض المناعة الذاتية كلها قد يظن كأسباب محتملة الكامنة وراء CP / CPPS ^2،32،33، فضلا عن تنشيط الخلايا البدينة وتحبب ^34. وإفرازات البروستاتا وأعرب عن الرجال مع CP / CPPS زادت تريبتاز الخلايا البدينة وعامل نمو الأعصاب (NGF) مستويات ^34، وأكدت دراسة لاحقة أن تريبتاز وكربوكسي ببتيداز A (CPA3)، علامة على تنشيط الخلايا البدينة، وزادت أيضا في البول للمرضى CP / CPPS ^35. لقد كان دور محتمل للالخلايا البدينة في بداية وصيانة CP / الهادئ محورا رئيسيا من البحوث الحيوانية على هذه المتلازمة حتى الآن. نموذج القوارض الأكثر استخداما تستخدم لدراسة CP / الهادئ هو التهاب البروستات الذاتية التجريبية (EAP) نموذج جنرالerated عن طريق الحقن تحت الجلد من مستضد البروستاتا في مساعد كاملة فرويند، الذي ينتج في درجات مختلفة من التهاب البروستاتا حسب الأنواع والسلالة المستخدمة ^34،36-39. وقد تبين تسلل الخلايا البدينة وتفعيل / تحبب لزيادة الحث التالية من EAP ^34،35،40. الفئران المعدلة وراثيا نقص في أي من الخلايا البدينة ³⁴ أو مستقبلات تريبتاز PAR2 ³⁵ لا تتطور حساسية تكتيك البروستاتا التالية EAP، على عكس الفئران wildtype EAP. في حين أن هذا النموذج قبل السريرية يعيد العديد من خصائص CP البشرية / الهادئ، وبروتوكول الاستقراء هو لا يدل على حالة الإنسان، والتي لديها مسببات متنوعة، وغالبا ما لا تنطوي على التهاب المباشر، والعدوى، او الاصابة البروستات.

تأثير ضغوط الحياة في وقت مبكر على تطوير CP / CPPS في البشر إلى حد كبير ذهب بدون تحقيق. ومع ذلك، فإن الدراسة التي هو جين تاو، وآخرون. ^41، أثبتت أن لين الذين أفادوا تاريخ الجسدية في مرحلة الطفولة، والعاطفية، و / أو كان الاعتداء الجنسي بشكل ملحوظ أكثر احتمالا للتعرض لأعراض توحي CP / الهادئ. علاوة على ذلك، أظهرت أن كلا من الألم وعشرات البولية وزيادة في المرضى الذين لديهم تاريخ من الإساءة الجسدية والعاطفية. لقد أثبتنا سابقا أن نفس النموذج NMS في الإناث C57BL / 6 الفئران تنتج الحساسية عن طريق المهبل والشاذ التعبير الجيني في كل من المهبل والمثانة توحي HPA مختلة الناتج محور ^16. هذه الأدلة جنبا إلى جنب مع ارتفاع معدل انتشار CP / المرضى الهادئ مع تقديم التواكب المرضي أخرى ^42، بما في ذلك IC / PBS واضطرابات المزاج، والتي أكثر وضوحا ثبت أن تكون مرتبطة مع الحياة في وقت مبكر التعرض الإجهاد ^12-14، ويوفر الأساس المنطقي لاستخدام نموذج NMS للتحقيق CP / CPPS في الفئران.

Protocol

جميع التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول تتفق مع المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة من قبل مركز جامعة كانساس الطبية المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. حديثي الولادة الأم الفصل (NMS)

1. مراقبة السدود الحوامل يوميا لولادة القمامة.
   ملاحظة: اليوم يعتبر القمامة ولدت P0.
2. على P1، إزالة السد من قفص المنزل ووضع في وعاء الثانوية نظيفة.
3. فرك حفنة من الفراش بين الأيدي النظيفة-القفاز للحفاظ على رائحة قفص المنزل.
4. إضافة عمق 1-2 سم من الفراش قفص المنزل في نظيفة، وصفت بشكل مناسب 2 L زجاج الدورق. إضافة ما يقرب من نصف أي تخصيب المواد الفراش الإضافية التي هي موجودة في قفص المنزل، على سبيل المثال، nestlet، ورقة تغضن، إلى كوب زجاجي.
5. بلطف وضع كافة الجراء من القمامة واحدة، كل على حدة، في نفس الكأس.
6. المكان على الفورالكأس في حاضنة عقد في 33 ^درجة مئوية و 50٪ الرطوبة لمدة 180 دقيقة.
7. إزالة السد من الحاوية الثانوية وعودتها إلى قفص المنزل. العودة قفص المنزل لموقعه سكن مناسب داخل الحظيرة.
8. كرر هذا الإجراء لكل القمامة تمر NMS، وذلك باستخدام قفازات نظيفة والحاويات الثانوية لكل القمامة / السد.
9. في نهاية فترة الفصل 180 دقيقة، وعودة الفضلات إلى أقفاص وطنهم في نفس الترتيب كما تم إزالتها.
10. استرداد قفص المنزل من القمامة الأولى التي تم فصلها في وقت سابق اليوم. إزالة السد من قفص المنزل ووضع في وعاء الثانوية نظيفة.
11. إزالة الكأس الأول من الحاضنة وفرك حفنة من الفراش بين أيدي القفاز نظيفة للحفاظ على رائحة قفص المنزل أثناء التعامل مع الجراء.
12. بلطف نقل الجراء، بشكل فردي، من الدورق إلى قفص المنزل.
13. عودة أي التخصيب والفراش المتبقية في الكأس لقفص المنزل.
14. العودة السد من الحاوية الثانوية إلى قفص المنزل وإعادته إلى موقعه سكن مناسب داخل الحظيرة.
15. شطف الكأس مع الماء وإعادته إلى الحاضنة. استخدام نفس الكأس لكل القمامة في جميع أنحاء الداخلي الانفصال.
16. كرر هذا الإجراء لكل القمامة تمر NMS في نفس الترتيب كما تم وضعها في الحاضنة.
17. كرر هذا الإجراء بأكمله لكل خضوعه القمامة NMS كل يوم من خلال P21.
18. فطم الجراء للمرفق وساذجة على P22 عن طريق وضع تتزاحم من نفس الجنس معا في أقفاص نظيفة كاملة مع الغذاء والماء. يجب أن تكون ولدت الجراء ساذجة ويضم تحت نفس الشروط الفئران للمرفق، ولكن يخضع أي معالجة إضافية خارج العادية المهام تربية الحيوانات.

2. محيط بالغدد التناسلية الميكانيكية الحساسية

1. إعداد جهاز فون فراي
   1. جعل الفئران إلى قاعة الاختبار، والسماح لهم للتأقلم لمدة 30دقيقة في حين تبقى في أقفاص وطنهم.
   2. إعداد منطقة الاختبار عن طريق وضع underpad ماصة تحت سلك شبكة قمة الجدول ارتفاع (79 سم × 28 سم) التي توفر مساحة كافية للسماح للمحقق بالاقتراب من الجانب السفلي دون مذهلة الفئران، ما يقرب من 55 سم في الطول.
   3. وضع ما يصل إلى 12 الفئران، بشكل فردي، في ظل واضحة، غرف بلاستيكية مثقبة (11 سم × 5 سم × 3.5 سم) على رأس جدول سلكية. وضع جسم ثقيل على رأس الدوائر لمنع الفئران من الهرب.
   4. تأقلم الفئران لمدة 30 دقيقة إضافية على الشاشة قبل تقييم الحد الأدنى للسحب.
2. تقييم محيط بالغدد التناسلية الميكانيكية الحساسية
   1. تنفيذ الأسلوب من أعلى إلى أسفل باستخدام مجموعة قياسية من متدرج المجذوذه فون فراي ^43. استخدام المجذوذه التالية: 1.65 جم، 2.36 جم، 2.83 جم، 3.22 جم، 3.61 جم، 4.08 جم، 4.31 جم، و4.74 غرام.
      1. عقد قاعدة ز حيدة 3.22 وفضح أحادية تراجعخيوط.
         ملاحظة: قد لا يكون بعض النماذج لتراجع حيدة.
      2. وضعه التحقيق بحيث يتم توجيه حيدة عموديا وعند الفأر هو في حالة تأهب، قادرة على الحركة، ويتم توزيع وزن الجسم بالتساوي بين الكفوف الخلفيتين تطبيقه إما إلى الجانب الأيسر أو الأيمن من كيس الصفن، وتجنب خط الوسط، حتى طفيف لوحظ منعطف في خيوط.
      3. عقد حيدة في مكان لمدة 10 ثانية أو حتى يظهر الحيوان ردا ايجابيا.
         ملاحظة: يعتبر استجابة إيجابية لتكون رعشة السريع أو القفز استجابة لطلب حيدة أو لعق أو سلوك العض الموجهة نحو حيدة. إذا تحرك الماوس أثناء تطبيق حيدة 10 ثانية دون عرض هذه السلوكيات، لا بد من إعادة اختبار حيدة بعد مدة لا تقل عن بقية 1 دقيقة طويلة. إذا كان الماوس لا يتحرك ولا يسلك أي من فوق السلوكيات المدرجة خلال تطبيق حيدة 10 ثانية، ويعتبر ردا سلبيا.
      4. تسجيل ردا على ذلك، إما سلبية أو إيجابية، في دفتر المختبر أو الكمبيوتر المحمول، وتكرار هذا الإجراء على كل من الفئران المتبقية باستخدام 3.22 ز حيدة.
      5. اختبار كل من الفئران مرة أخرى باستخدام حيدة المناسبة القادمة. ملاحظة: إذا عرضت الماوس ردا سلبيا على 3.22 غرام حيدة، تطبيق 3.61 ز حيدة بنفس الطريقة وتسجيل استجابة. إذا عرضت الماوس ردا إيجابيا على 3.22 غرام حيدة، تطبيق 2.83 ز حيدة وتسجيل استجابة.
   2. تواصل اختبار كل فأر باستخدام القادمة حيدة أكبر أو أصغر، حسب الاقتضاء، ل4 تطبيقات إضافية بعد لوحظ أول رد إيجابي.
   3. عودة الفئران لأقفاص المنزل.
   4. استخدام قيمة النهائية فون فراي حيدة تطبيقها في سلسلة محاكمة في وحدات سجل لحساب 50٪ عتبة ز الانسحاب كما هو موضح في Chaplan وآخرون. ^43.

عنوان "> 3. المحمضة طولويدين الأزرق ماست تلوين الخلية

1. تجهيز الأنسجة
   1. تشريح الأنسجة البروستاتا ⁴⁴ من الفئران التي تم perfused لintracardially مع الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ ^45. بوستفيكس الأنسجة في 4٪ امتصاص العرق لمدة 1 ساعة على RT ثم cryoprotect في 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني 1X في 4 درجات CO / N.
   2. إعداد (30 مل) حمام صغير من هيبتان ووضعه على الثلج الجاف.
   3. شطف أنسجة البروستاتا في برنامج تلفزيوني 1X والجافة باستخدام واجب ضوء مسح.
   4. إدراج أنسجة البروستاتا في هيبتان الباردة حتى يتم تجميده.
   5. المكان على الفور أنسجة البروستاتا المجمدة في cryomold تحتوي على تركيب وسائل الاعلام ومكان على الثلج الجاف حتى تجمد.
   6. متجر cryomolds في -20 ° C.
   7. قطع مستعرض أنسجة البروستاتا في 7 cryosections ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد.
   8. مكان 8-12 cryosections غير التسلسلي التي تمتد على طول الأنسجة، وعلى شرائح المجهر موجبة الشحنة.
   9. متجر الانتهاء الشرائح في -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
2. إعداد المحمضة طولويدين الأزرق
   1. إضافة 1 غرام من طولويدين الأزرق O إلى 100 مل 70٪ من الإيثانول ودوامة حتى في محلول لإعداد محلول المخزون 1٪. ويمكن تخزين الحل السهم عند RT لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.
   2. إضافة 1 جم كلوريد الصوديوم إلى 100 مل من الماء في كوب وضعت على رأس لوحة ضجة.
   3. ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول كلوريد الصوديوم باستخدام 12 M حمض الهيدروكلوريك حتى مجموعة من درجة الحموضة 0.5 - 1.0 يتحقق.
   4. إعداد 0.25٪ طولويدين الأزرق الحل العمل من خلال الجمع بين 8 مل من محلول المخزون طولويدين الأزرق و 32 مل من 1٪ كلوريد الصوديوم الحل. ماصة صعودا وهبوطا لضمان الدمج الكلي للمحلول المخزون طولويدين الأزرق ومزيج باستخدام الدوامة. يجب أن يتم حل العمل الطازجة والتخلص منها بعد استخدام.
3. تلطيخ Cryosections البروستاتا
   1. إزالة الشرائح التي سيتم تجهيزها من الفريزر والسماح لتتوازن لRT لحوالي 30 مفي.
   2. غسل أقسام الأنسجة عن طريق غمس بشكل فردي الشرائح لمدة حوالي 1 ثانية إلى 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي على كمية كافية من 1X PBS للتأكد من أن أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة سيتم مغمورة تماما. تسمح الشرائح للهواء الجاف على منشفة ورقية.
   3. مكان الشرائح في وعاء زجاجي تلطيخ تحتوي على ما يكفي 0.25٪ تعمل الحل طولويدين الأزرق للتأكد من أن أقسام الأنسجة محمولة على الشريحة سوف تكون مغمورة تماما واحتضان لمدة 10 - 15 دقيقة في حين على الكرسي الهزاز منصة وضعت في 15 دورة في الدقيقة.
   4. تراجع الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لحوالي 1 ثانية لتغسل الزائدة طولويدين الأزرق.
   5. وضع الشرائح في مربع الشريحة أو رف في مثل هذه الطريقة أن الشرائح على الجانبين للسماح لتصريف المياه.
   6. تجفيف الشرائح في الفرن عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة أو O / N في RT.
   7. يذوى الشرائح بسرعة باستخدام الكحول، والسماح للشرائح حتى يجف تماما بين التعرض للكحول. الشرائح الجافة من خلال تجفيف على منشفة ورقية لالثاني محو ظهورهم وحواف مع واجب ضوء مسح.
      1. تزج الشرائح في 95٪ ETOH لحوالي 1 ثانية، والسماح ليجف تماما. كرر هذا الإجراء 1-10 مرات حتى يجف الأنسجة أكثر الزرقاء من الأرجواني.
      2. تزج الشرائح في 100٪ ETOH لحوالي 1 ثانية، والسماح ليجف تماما. كرر هذا الإجراء 1-10 مرات حتى الأنسجة مظلمة إلى اللون الأزرق المتوسط، ولكن ليس الأرجواني.
   8. إصلاح وصمة عار التي يحتضنها الشرائح في 100٪ الزيلين لمدة 3 دقائق. السماح ليجف.
   9. ساترة الشرائح مع الجلسرين، PBS، أو وسائل الإعلام تصاعد دائم قائم على زيلين. استنزاف وسائل الإعلام الزائدة وتخزينها في RT.
4. خلايا ماست تحديد مقدار
   1. تصور طولويدين أقسام الأنسجة الأزرق الملون في 20X التكبير باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 2).
   2. عد عدد من الخلايا البدينة الحالية داخل منطقة تصور والتفريق بين الخلايا البدينة غير degranulated وdegranulated. 40X تعظمايون قد يكون من الضروري لتأكيد الوضع التحبيب في بعض الخلايا البدينة.
      ملاحظة: الخلايا البدينة غير degranulated يحمل metachromasia كثيفة مع عدم وجود أو خافت مخطط النووي و / أو أي قذف الحبيبية حول الخلية. الخلايا البدينة Degranulated يحمل metachromasia أقل كثافة ولديها مخطط واضح واضح للنواة و / أو حبيبات الحرة داخل السيتوبلازم وخارج الحدود الخلية.
   3. تواصل تقييم عدد من الخلايا البدينة غير degranulated وdegranulated في مجملها من قسم الأنسجة الحالي. كرر هذا الإجراء على لا يقل عن 7 أقسام منفصلة إضافية، والتي تمتد على طول كل الأنسجة.
   4. حساب النسبة المئوية للdegranulated (DG) إلى إجمالي الخلايا البدينة لكل الأنسجة / الماوس وفقا للمعادلة التالية: (DG الخلايا البدينة / مجموع الخلايا البدينة) × 100.

النتائج

وأظهرت الفئران التي خضعت NMS الأدلة السلوكية يدل على CP / الهادئ. عند اختباره مع سلسلة متدرجة من المجذوذه فون فراي، الفئران للمرفق القديمة أسابيع 8 (ن = 4) ظهور آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية بالمقارنة مع نظرائهم ساذجة (ن = 5، الشكل 2). ويتضح هذا الأمر ...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول منهجية لاستخدام الضغط حديثي الولادة، في شكل NMS، للحث على symptomology يدل على CP / CPPS في الفئران الذكور البالغين. كما الكبار، وتعرض الفئران للمرفق آلام جلدية الميكانيكية محيط بالغدد التناسلية كبير، وكذلك دليل على تحبب الخلايا البدينة في أنسجة البروستات?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.