توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

Summary

والهدف من هذا الفيديو هو إظهار كيفية تنفيذ استخراج الحمض النووي الآلي من (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية وقطرة الرقمية PCR (ddPCR) تحليل للكشف عن الطفرات النادرة في عملية إعداد سريرية. الكشف عن الطفرات في عينات FFPE يوضح فائدة سريرية من ddPCR في عينات FFPE.

Abstract

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Introduction

تراكم الطفرات الوراثية في الجينات التنظيمية الرئيسية يغير برمجة الخلية الطبيعية مثل تكاثر الخلايا، والتمايز، والبقاء على قيد الحياة، مما يؤدي إلى السرطان ^1. كيناز مسار RAS-RAF-MAP يتوسط الاستجابات الخلوية إلى إشارات النمو. يمكن أن الطفرات أنكجنيك BRAF تنجم عن طفرات في الجين سائق BRAF، والتي قد تتسبب في BRAF oncoprotein لتصبح مفرط ^2. الطفرات في جين BRAF يؤدي أيضا إلى إشارات المصب فرط نشاط عن طريق منظمة مجاهدي خلق وERK ^3، الذي، بدوره، يؤدي إلى نمو الخلايا المفرط والانتشار بشكل مستقل عن النمو بوساطة عامل التنظيم ^4-6.

تتوفر لالتنميط تحور الحمض النووي، مثل الكمية في الوقت الحقيقي الطفرات BRAF V600E في، (FFPE) إشارة خطوط الخلايا الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين القياسية التي ddPCR العديد من الأدوات. ddPCR هو الأسلوب القائم على PCR لتقدير المطلقتقدم دقة أعلى بالمقارنة مع التقليدية الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) ^7،8. يوفر ddPCR أيضا أعلى حل السلطة ودقة للكشف عن الطفرات النادرة في قوالب DNA، مما أبحاث السرطان أكثر إفادة والتشخيص ^9. وتشمل مزايا إضافية من ddPCR على QPCR التقليدية حساسيتها تعزيز والدقة عند دراسة الأرقام نسخة قالب منخفض ^10-12. هنا، يتجلى بروتوكول لاستخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية، تليها تحديد وجود أو عدم وجود الطفرات BRAF V600E التي كتبها ddPCR تلقائيا. وكما وصفت استخدام البرمجيات لتحليل البيانات وتمثيل رسومي للنتائج. الإجراء بأكمله هو بسيط نسبيا وتماما يعتمد على عدد من العينات المراد محة وعدد PCR وddPCR الآلات التقليدية المتاحة.

يصف بروتوكول فقا للإجراءات العادية لBR إشارة FFPE خطوط الخلايا القياسية AF V600E إيجابية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) يتم تنفيذ في صك مؤتمتة بالكامل باستخدام بروتوكول الأنسجة نظام إعداد (TPS). وفي وقت لاحق، ويتم تحليل عينات من الحمض النووي معزولة عن وجود طفرات BRAF V600E باستخدام نظام ddPCR. يتم إجراء تحليل الطفرة المستهدفة بعد أن تم محة عن العينات وتم تحميل البيانات إلى برنامج تحليل البيانات. اعتمادا على عدد العينات / درس المجموعات، وتحليل البيانات قد تتطلب من واحد إلى عدة ساعات. العنصر التجريبي للمنهجية تتطلب دقة في التعامل مع DNA وrological الماصات وPipettors، شريط فيديو إن الرب علوم التربية شرح المزيد عن عن سياق pipetting ل"> pipetting لفي 96 لوحات جيدة، في حين أن تحليل البيانات تتم باستخدام البرمجيات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. استخراج الحمض النووي من خطوط الخلايا FFPE المعيار المرجعي

ملاحظة: للحصول على هذا الإجراء، تم إجراء استخراج الحمض النووي من الخطوط المرجعية FFPE الخلية القياسية (HD598، HD593، HD617، HD273 وwildtype (WT)) باستخدام FFPE DNA الأنسجة العزلة عدة كما هو موضح في البروتوكول أدناه. وقد تحقق استخراج الحمض النووي الآلي باتباع إرشادات الشركة المصنعة لمجموع عزل الحمض النووي.

1. باستخدام مشراح وكتلة FFPE الأصلي، وإعداد يدويا أقسام جديدة قبل استخراج الحمض النووي وتحليل، وفقا للإجراءات المعمول بها. تأكد من أن عينة مدخلا للقسم الأنسجة (ق) تحليل لا يتجاوز سمك مجموعه 10 ميكرون وأن مساحة لا تتجاوز 600 مم ² للمقطع واحد.

1.2 بروتوكول TPS

ملاحظة: وحدات التخزين هو مبين في الجدول رقم 1 تتوافق مع الحد الأدنى اللازم لتجهيز 48 العينات، وإجراءالمعروضة في فقا للمبادئ التوجيهية TPS. قبل بدء التجربة يستقر العينات FFPE في أنبوب الإلكترونية عن طريق الطرد المركزي في 600 x ج، لتجنب فقدان العينات خلال برنامج الآلية.

1. بدوره على صك عزل الحمض النووي الآلي والكمبيوتر. فتح برنامج حاسوبي لمراقبة تشغيل وإدراج صينية حمولة السيارات في منطقة سطح التحميل TPS.
2. الاستغناء الكواشف إلى أحواض يناظرها كما هو مبين في الشكل 1.
   1. ضع 4 عينات (BRAF WT، BRAF V600E 50٪ و 5٪ و 1٪) في رفوف الناقل العينة.
   2. وضع صناديق طرف في أحواض في الأعمدة 2 و 3 والتحقق من النصائح لوجود أكثر من مرشح واحد لكل طرف، والتي سيتم إحباط المدى.
   3. ضمان خلط الصحيح للتحلل العازلة وغسل العازلة التي كتبها قلب لهم 3-5 مرات، وتحميلها في أحواض ذات الصلة في العمود 4 (الشكل 1).
   4. بعد قلب لعدة مرات أو vort خفيفةexing، تحميل شطف العازلة، حبات مغناطيسية، وعازلة FFPE في أحواض صغيرة في العمود 5، وترك 1 فتحة فارغة حيث أشار (الشكل 1، الجدول 1).
   5. تحميل 2 مل لوحة الآبار العميقة (برنامج عمل الدوحة) على الناقل لوحة (الشكل 1).
3. تنفيذ الخطوات النهائية التالية قبل البدء في المدى:
   1. إرفع قبعة جميع الأنابيب وأحواض كاشف. التأكد من أن قدرة كافية متاحة في زجاجة النفايات السائلة. تأكد من أن زجاجة النفايات الصلبة فارغة واصطف مع حقيبة واقية. تأكد من أن لوحة طرف إخراج تتركز في تجميع النفايات.
   2. إغلاق الغطاء الأمامي.
4. بدء البرنامج. فتح ملف NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
5. انقر على زر "ابدأ". وحالة أداة التحول من الخمول إلى تشغيل.
6. أدخل عدد من العينات لهذا المدى. اختر الطريقة المطلوبة لهذا المدى (DNA = 0). أدخل موقف الأول المجلد عاليةأوميا طرف، واختيار "1" إذا كان كل صواني مليئة. أدخل موقف المجلد الأول غيض القياسية، واختيار "1" إذا كان كل صواني مليئة.
   ملاحظة: والصك ثم تشغيل من خلال خطوات الآلي دون تدخل المستخدم. ويرد سير العمل التفصيلي في الشكل 2. بمجرد الانتهاء من التجربة، يتم حقن النفايات كاشف ونصائح في تجميع النفايات.
7. تحديد الحمض النووي الجيني النقي باستخدام طريقة فلوروميتريك.
   تخضع عينات من الحمض النووي التي تحتوي على الحد الأدنى من تركيز 3.3 نانوغرام / ميكرولتر لتحليل ddPCR (القسم 2): مذكرة.

2. DNA الطفرة التنميط: بروتوكول ddPCR

ملاحظة: بروتوكول لتحديد ملامح الطفرة DNA يتكون من 3 خطوات رئيسية: 1) الجيل الحبرية، 2) التضخيم PCR التقليدية، 3) القطرة القراءة و4) التنميط تحور الحمض النووي.

2.1. الجيل القطيرات

ملاحظة: ddPCR supermix هوأوصت لddPCR، وهذا المزيج يحتوي على الكواشف اللازمة لتوليد الحبرية.

1. لتجنب التلوث، اتبع الاحتياطات القياسية، مثل ارتداء قفازات، وذلك باستخدام PCR غطاء محرك السيارة نظيفة، pipets نظيفة، وأنابيب الربط منخفض البروتين.
2. تأمين حد أدنى للتركيز عينة DNA الجينومية الإنسان هو 3.3 نانوغرام / ميكرولتر. ملاحظة: مقدار تنقية DNA تركيز العينة سوف تختلف استنادا إلى تحليل٪ طفرة الكشف عن التردد.
3. تجميع مخاليط رد فعل في لوحات PCR 96-جيدا. ذوبان الجليد وتتوازن المكونات رد فعل على RT. إعداد ردود الفعل PCR من خلال الجمع بين 2X ddPCR supermix (10 ميكرولتر) و 20 الاشعال (إلى الأمام وعكس، 900 نانومتر) والتحقيق (250 نيوتن متر) مع كل عينة DNA النقاء (66ng / 2 ميكرولتر) أن تصل إلى 20 ميكرولتر مع الماء المقطر (كما في بروتوكول مولد قطرة)
4. دوامة المزيج جيدا لضمان تجانس لفترة وجيزة الطرد المركزي لجمع محتويات في الجزء السفلي من الأنبوب قبل صرفها. تحميل 20 & #181؛ ل على خرطوشة لتشكيل الحبرية.
5. تشغيل مولد الحبرية، في بروتوكول الموصى بها من المصنع
   1. أدخل الخرطوشة في حامل مع الشق في خرطوشة وضعه على الجانب الأيسر العلوي من حامل. إضافة 20 ميكرولتر من مزيج رد فعل تحتوي على عينات في الوسط و 70 ميكرولتر من النفط مولد في الآبار أسفل.
   2. إرفاق طوقا عبر الجزء العلوي من الخرطوشة. تأكد من أن طوقا هو مدمن مخدرات آمن على طرفي حامل. خلاف ذلك، لن يتحقق ما يكفي من الضغط لتوليد الحبرية.
   3. فتح مولد قطرات عن طريق الضغط على الزر الأخضر على الجزء العلوي من الجهاز وأدخل خرطوشة. عندما حامل في الموضع الصحيح، فإن كلا من السلطة (من اليسار إلى اليمين) وصاحب (يمين الوسط) أضواء مؤشر هي الخضراء.
   4. اضغط على الزر العلوي على الصك مرة أخرى لإغلاق الباب والشروع في الجيل الحبرية. ملاحظة: بعد الضغط على بutton، مواقف متعددة نفسه على الآبار مخرج، رسم النفط وعينات من خلال القنوات ميكروفلويديك، حيث يتم إنشاء قطرات. تدفق قطرات في قطرة جيدا، حيث تتراكم. وعلى ضوء مؤشر الحبرية (الى اليمين) ومضات الأخضر بعد 10 ثانية تشير إلى أن الجيل القطيرات في التقدم.
   5. عندما الجيل الحبرية كاملة، تغير كل أضواء مؤشر 3 إلى صلب الأخضر. فتح الباب عن طريق الضغط على زر، وإزالة حامل من وحدة. إزالة طوقا المتاح من صاحب وتخلص منه. ملاحظة: هذه الآبار العليا للخرطوشة تحتوي على قطرات، والآبار الوسطى والدنيا فارغة تقريبا، مع كمية صغيرة من النفط المتبقي.

2.2. استعدادا لPCR

1. لكل عينة، الماصة من 40 ميكرولتر من محتويات قطرة من أعلى بكثير من خراطيش في بئر واحد من الموصى به لوحة 96-جيدا PCR كما هو مبين في بروتوكول أداة الشركة المصنعة. لاالشركة المصرية للاتصالات: استخدام ماصة متعدد القنوات مثالية لنقل المستحلبات قطرات. يوصى الطموح بطيئة ورقيقة من قطرات للحد من القص قطرة أثناء النقل.
2. ختم لوحة PCR مع احباط مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. استخدام pierceable الأختام لوحة احباط التي تتوافق مع لوحة PCR سداده والإبر في القارئ الحبرية. اتبع الإرشادات في PCR لوحة دليل التعليمات سداده.
3. ضبط درجة الحرارة لوحة سداده إلى 180 درجة مئوية، والوقت ل5 ثانية.
4. المس السهم لفتح باب الدرج. وضع كتلة الدعم على صينية مع الجانب 96-جيدا مواجهة. وضع لوحة 96-جيدا على كتلة الدعم والتأكد من أن جميع الآبار لوحة تتماشى مع كتلة الدعم.
5. تغطية لوحة 96-جيدا مع 1 ورقة من pierceable ختم احباط. مرة واحدة يتم تأمين لوحة 96-جيدا على الكتلة دعم ومغطاة ختم احباط pierceable، المس الزر الختم. سوف علبة إغلاقوختم الحرارة سيبدأ.
6. عندما الحرارة الختم كاملة، يفتح الباب تلقائيا؛ إزالة لوحة من كتلة الحرارة لركوب الدراجات الحرارية ومن ثم إزالة كتلة الحرارة.
7. التأكد من أن جميع الآبار في لوحة ومختومة من قبل التحقق من أن المنخفضات في احباط واضحة للعيان على كل بئر. مرة واحدة مختومة، لوحة مستعدة لركوب الدراجات الحرارية.
8. حالما تتم إزالة قطرات، اضغط على المزالج على حامل خرطوشة لفتحه. إزالة خرطوشة فارغة وتخلص منه.
9. أداء التقليدي PCR التضخيم باتباع المعايير المفصلة في الجدول 2.

2.3 القراءة الحبرية (حسب بروتوكول الموصى بها من المصنع)

ملاحظة: بعد PCR التضخيم من الهدف الحمض النووي في قطرات، وأداة قارئ قطرة يحلل كل قطرة فردي باستخدام نظام كشف 2 لون ^13. وضعناها عادة للكشف عن FAM لد VIC fluorophores المراسل.

1. انقر على "نظام تدفق" لرئيس القارئ قطرة وجعلها جاهزة للتحليل ddPCR.
2. تحميل لوحة في القارئ قطرة وانقر على زر "البدء". القارئ قطرة شفاطات كل عينة، singulates قطرات، وتيارات لهم في ملف واحد الماضي كاشف 2-اللون. كاشف يقرأ قطرات تعداد العينات الإيجابية والسلبية.
3. عندما القراءة الحبرية كاملة، وفتح الباب وإزالة حامل لوحة من الوحدة. إزالة 96-جيدا PCR لوحة من صاحب وتخلص منه.
4. للصيانة المناسبة، تحل محل النفط القارئ قطرة وتفريغ وعاء النفايات حسب الحاجة. إضافة 50 مل من المبيض بنسبة 10٪ إلى زجاجة النفايات لمنع نمو الجراثيم.

2.4 DNA الطفرة التنميط (حسب بروتوكول الموصى بها من المصنع)

ملاحظة: يتم حساب قطرات PCR إيجابية وسلبية PCR لتوفير quantific المطلقأوجه الهدف الطفرات BRAF V600E DNA في شكل رقمي، وذلك باستخدام برمجيات تحليل البيانات.

1. انقر فوق إعداد لإدخال المعلومات حول العينات، المقايسات، والتجارب.
2. في إطار الإعداد تحميل لوحة (filename.qlp)، ثم انقر فوق تحليل لفتح وتحليل البيانات. يتم فصل واجهة تحليل البيانات إلى ثلاث نوافذ: جدول النتائج، حسنا محدد ومعالجة البيانات / الرسومية العرض.
3. في إطار البيانات المعالجة، تظهر البيانات تركيز لكل هدف في الآبار في الخريطة وحة والواردة فى الجدول في جدول النتائج. انقر تركيز لتصور البيانات في مؤامرات التركيز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لتحليل ddPCR لدينا، درسنا BRAF V600E إشارة طفرة FFPE خطوط الخلايا القياسية. القارئ قطرة يتصل برنامج كمبيوتر محمول تحليل بيانات الكمبيوتر على التوالي. ويعرف كل قطرة الفردية على أساس السعة الفلورسنت على أنها إما إيجابية أو سلبية. البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة يسمح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، نسلط الضوء على تطبيق ddPCR وعزل الحمض النووي من الإشارة FFPE القياسية عينات خط الخلية لتقييم محدد تحور الجين. في هذه الدراسة، تم استخدام TPS الآلي DNA طريقة العزلة التي يمكن تكييفها بسهولة، الآلي، ويمكن أن تستوعب ما يصل إلى 48 عينات مختلفة في وقت واحد، مما يتيح للتجارب ع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument	Siemens	10701001	Automated DNA isolation instrument
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	772BR1119
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	771BR1497
Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment		621BR17718
PX1 PCR plate sealer	Bio-Rad	770BR1575
QuantaSoft software	Bio-Rad
DNA isolation kit
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632398
VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1	Siemens	10632399
CO-RE tips	Siemens
ddPCR mutation analysis
ddPCR Supermix	Bio-Rad	BR186-3010	2X concentration
DG8 cartridge	Bio-Rad	BR186-4008
Droplet Generator oil	Bio-Rad	BR-186-3005
Gasket	Bio-Rad	BR186-3006
Droplet reader oil	Bio-Rad	BR-186-3004