JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Abstract

التحقيق توالد في الرحم هي عملية صعبة من الناحية التقنية في الثدييات المشيمية نظرا لعدم إمكانية الوصول إلى الكواشف إلى الأجنة التي تتطور داخل الرحم. يوفر خارج الحي تستقيم طريقة الثقافة قطرة وضعت حديثا بديلا جذابا لالدراسات التي أجريت في الرحم. تقدم الثقافة فيفو السابقين قطرة القدرة على دراسة ومعالجة التفاعلات الخلوية ومسارات الإشارات المختلفة من خلال استخدام مختلف الحجب ومركبات تفعيل. بالإضافة إلى ذلك، فإن آثار مختلف الكواشف الدوائية على تطوير أجهزة معينة يمكن دراستها من دون آثار جانبية غير مرغوب فيها من إيصال الدواء النظامية في الرحم. بالمقارنة مع غيرها من نظم المختبر، وثقافة قطرة يسمح ليس فقط من أجل القدرة على دراسة ثلاثي الأبعاد التشكل وخلية خلية التفاعلات، التي لا يمكن استنساخها في خطوط خلايا الثدييات، ولكن يتطلب أيضا أقل بكثير صeagents من الآخر خارج الحي والبروتوكولات المختبر. توضح هذه الورقة السليم الماوس الجنين تشريح الجهاز وتقنيات زراعة قطرة تستقيم، تليها كله المناعي الجهاز لإثبات فعالية هذه الطريقة. فيفو السابقين قطرة طريقة ثقافة يسمح بتشكيل بنية الجهاز قابلة للمقارنة إلى ما لوحظ في الجسم الحي، ويمكن استخدامها لدراسة عمليات خلاف ذلك يصعب الدراسة بسبب الفتك الجنينية في النماذج في الجسم الحي. كنظام تطبيق النموذج، سيتم استخدام مثبط جزيء صغير للتحقيق في دور الأوعية الدموية في التشكل الخصية. هذا خارج الحي قطرة طريقة ثقافة غير قابلة للتوسيع إلى أجهزة الجسم الجنين أخرى، مثل الرئة وربما غيرها، على الرغم من أن كل جهاز يجب أن يكون على نطاق واسع درس لتحديد أي تعديلات الجهاز محددة لبروتوكول. ويوفر هذا النظام الثقافة الجهاز المرونة في التجريب مع أجهزة الجنين، والنتائج obtaineد باستخدام هذه التقنية ستساعد الباحثين اكتساب نظرة ثاقبة نمو الجنين.

Introduction

تجديد جهاز في الجسم الحي في البشر محدود للغاية؛ لذلك، هندسة الأنسجة، وتطوير الأنسجة والأعضاء من الخلايا الفردية التي تبرعت بها مجموعة، أصبح علاجا جذابا المحتملين لاستبدال الجهاز. ومع ذلك، لهذه الاستراتيجية العلاجية لتكون ناجحة، والعوامل والتفاعلات الخلوية العاملة في التشكل من الجهاز يجب دراستها بدقة وفهمها جيدا. نظرا لعدم القدرة على دراسة تطوير أجهزة معينة مع الأساليب التقليدية، تحولت الباحثون إلى الجنين كله بديل أو الثقافات الجهاز كله. Kalaskar وآخرون. 1 أظهرت أن ثقافة مرحلة التطور الجنيني كلها خارج الحي تعطي نتائج مماثلة (في 58٪ من الأجنة مثقف) لفي التنمية الرحم، مما يشير إلى أن وسائل الثقافة فيفو السابقين هي بديل ممكن للدراسات توالد.

نظام الجهاز ثقافة فردية، مثل هذا خارج الحي دروPLET نظام الثقافة، ويسمح لتحليل الجهاز كله مستقلة عن التأثيرات الجهازية، مع السماح التلاعب في مسار الإشارات معين أو التفاعلات الخلوية عن طريق إضافة الكواشف الدوائية أو الأجسام المضادة. تقليديا، ودراسة تطوير الجهاز الجنين قد اقتصر على التقنيات المعدلة وراثيا والماوس خروج المغلوب، بالإضافة إلى الكواشف الدوائية تسليمها للأمهات. ومع ذلك، هناك مسائل فنية تشمل هذه التقنيات والعلاجات في الجسم الحي. معظم المخاوف تدور حول آثار التأثير على مختلف الأجهزة في وقت واحد والذي غالبا ما يؤدي إلى الفتك الجنينية. مصدر قلق إضافي من الدراسات التلاعب نمو الجنين هو دواء تأثير الأمهات من المخدرات على التطور الجنيني داخل الرحم (على سبيل المثال، والتمثيل الغذائي الأمهات من الدواء قبل أن تصل إلى الجنين) وإذا كانت هذه الكواشف يمكن أن تمر من خلال حاجز المشيمة.

تقنية ثقافة الجهاز كلها وصفتهنا تم تكييفها من بروتوكول وصف لأول مرة من قبل معتوق وآخرون. 2، والتي يتم تحضين الغدد التناسلية الجنينية كلها في خارج الحي الثقافات قطرة تستقيم. واحدة ميزة كبيرة لزراعة الغدد التناسلية الجنينية هي أن مثبطات جزيء صغير يمكن الوصول بسهولة الجهاز كله عن طريق الانتشار البسيط. وقد أظهرت DeFalco آخرون أن استخدام هذا فيفو السابقين قطرة طريقة الثقافة بالتزامن مع مثبطات جزيء صغير يمكن أن تستخدم لدراسة العمليات والتفاعلات التي تحدث أثناء نمو الغدد التناسلية 3 إشارات؛ أن هذه العمليات سيكون من الصعب دراسة في الجسم الحي بسبب التحديات التقنية (على سبيل المثال، مرور المخدرات عبر المشيمة أو الفتك يصيب أعضاء متعددة باستخدام النهج وراثية أو الدوائية).

ثقافة الحبرية ليست فقط تحسنا في بعض الجوانب أكثر في الرحم التجريب، ولكن أيضا أن ذلك يعد تحسنا خلال في المختبر، وبحكم السادسنظم فو كذلك. استخدام خطوط الخلايا لدراسة التشكل من الصعب للغاية لأنها تفتقر إلى أنواع الخلايا المتنوعة، تفتقر إلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) العناصر الأساسية التي تسمح تشكيل بنية الجهاز، ويمكن أن تظهر التحف في الإشارة شلالات. على الرغم من أن هندسة الأنسجة وإجراء تحسينات كبيرة في خلق السقالات محاكاة ECM، والافتقار إلى المعرفة فيما يتعلق وهي مطلوبة إشارات من قبل كل نوع من الخلايا خلال توالد يجعل صعوبة في بناء نظام جهاز في المختبر. وقد أنظمة أخرى خارج الحي أنشئت سابقا لدراسة توالد، أو بشكل أكثر تحديدا التشكل، وكانت ناجحة جدا للتصوير المباشر لأجهزة الجنين في أجار 4، transwells 5، 6 مرشحات، ومصفوفات سقالة أخرى 7،8. الاستفادة من نظام الثقافة الحبرية هو أنه يتيح دراسة التشكل من خلال توفير القدرة على الاستفادة من أقل الكواشف، والتي هي سften تكلفة، ولكن أيضا إعطاء التوتر السطحي الجهاز، وهو أمر مهم للنمو ويشير قدرات 9.

في الماوس، التشكل الخصية الأولي يحدث بين الجنينية (E) مراحل E11.5 وE13.5. وتشمل هذه المراحل نافذة الوقت الأمثل لدراسة العوامل التي تؤثر على التفرقة بين جنس معين. ومن بين العمليات الحيوية التي تحدث أثناء تشكيل الخصية هي الجيل العمارة الحبل الخصية وتشكيل شبكة الأوعية الدموية الخصية محددة. استخدام هذا الجهاز خارج الحي كله نظام الثقافة الحبرية، واحد قادر على تغيير الأوعية الدموية الخاص بالذكور وتمنع الخصية التشكل من خلال استخدام مثبط جزيء صغير الذي يمنع نشاط مستقبلات عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)؛ بوساطة VEGF إعادة الأوعية الدموية هو أمر حاسم لتنمية الخصية 10-12. يمكن أن تطبق بنجاح هذه التقنية إلى الأجهزة الأخرى، ويمكن أن تستهدف وقت محددنوافذ التنمية. جبل لالجامع التصوير جهاز يسمح التصور من الهياكل الحيوية فضلا عن التغييرات الهيكلية والخلوية الناتجة عن إدارة مثبطات المختلفة. الأهم من ذلك، هذا النظام هو مفيد في هذا الباحث يمكن تجاوز آثار الخلط المحتملة من الدواء الأمهات أو التعطيل المنهجي في الجسم الحي خلال استراتيجيات الجينات المستهدفة. وهكذا، هذا الجهاز كله خارج الحي النظام الثقافة قطرات يمكن أن تحسن بشكل كبير من القدرة على فهم التفاعلات والإشارات التي تحدث بشكل خاص ضمن أجهزة خاصة أثناء التطور الجنيني.

Protocol

وكانت جميع الفئران المستخدمة في هذه الدراسات CD-1 الفئران التي تم الحصول عليها من مختبرات نهر تشارلز. كما تم إجراء تجارب زراعة السابقة على السلالات الأخرى، مثل C57BL / 6J (لا تظهر البيانات)، ولكن يمكن استخدام أي سلالة. وكانت الإناث البالغات الحوامل حوالي 2-3 أشهر من العمر والموت الرحيم كانت عبر CO 2 الاستنشاق تليها خلع عنق الرحم وبضع الصدر الثنائي قبل إزالة الجنين. تم إيواء الفئران فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة، وتمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي مركز سينسيناتي للأطفال الطبية مستشفى.

1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

  1. إعداد محلول الإيثانول 70٪. الماء منزوع الأيونات الأوتوكلاف (لصنع الدوائر ترطيب وجعل / حلول تمييع). تعقيم أدوات تشريح (ملقط، مقص، و 27 G الحقن إبرة) عن طريق الرش أسفل مع الايثانول 70٪.
  2. إعداد10X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم (80 جم كلوريد الصوديوم، 2 ز بوكل، 14.4 ز نا 2 هبو 4، 2.4 غرام KH 2 PO 4، 6.75 مل من 1 M CaCl 2، 3.75 مل من 1 M MgCl 2 ). يحرك المزيج حتى يذوب في 1 لتر ماء معقم وتعقيمها ثم تصفية مع ورق الترشيح. تمييع 10 أضعاف مع الماء لجعل 1X PBS.
  3. حرارة تعطيل مصل بقري جنيني (FBS) عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتصفية تعقيم مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
  4. إعداد 38 مل 1X مستنبت كاملة (تسمى DMEM كاملة، cDMEM)، ويتألف من Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)، و 10٪ تصفيتها FBS الحرارة المعطل و1/100 التخفيف من الأسهم للبنسلين الستربتومايسين. هذا عادة ما ينبغي أن تستخدم طازجة، ولكن يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
  5. إعادة تشكيل VEGFR كيناز التيروزين II (TKI II) في DMSO لتركيز الأسهم من 5 ملغ / مل، وتمييع الأسهم مع cDMEM لجعل حل العاملة. يخدع النهائيوحدانية التركيز لهذه الدراسة هو 1.875 ميكروغرام / مل في cDMEM. وفقا لتوصيات الشركة، حلول الأسهم مستقرة لمدة تصل إلى 6 أشهر في -20 ° C. أما بالنسبة للحلول العمل، وجعل جديدة واستخدامها في نفس اليوم.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز هذا الدواء في حل العاملة شقين أعلى من تركيز النهائي المطلوب (لأنها سوف تضعف شقين في الحبرية). في نفس الوقت، وإعداد نفس الحجم من cDMEM تحتوي على نفس الحجم من DMSO لعلاج "السيطرة".
  6. إعداد الكواشف ذيل الهضم (50 ملي هيدروكسيد الصوديوم و 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك [درجة الحموضة 8.0]) بشكل منفصل في الماء المقطر.
  7. جعل 25 ميكرومتر الأسهم من الاشعال XY PCR (XY إلى الأمام 5'-TGA AGC TTT TGG CTT TGA G-3 "و XY عكس 5'-CCG CTG CCA AAT TCT TTG G-3 ') معا في nuclease خالية من المياه.
  8. إعداد 50X TAE العازلة (242 غرام Trizma قاعدة، 57.1 مل الجليدية حمض الخليك، 100 مل 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8.5، وإضافة الماء إلى 1 L فايحجم نال). إعداد 1X TAE العازلة تشغيل (المخفف 20 مل 50X TAE بالماء ل1 L الحجم الكلي).
  9. لإيجاد حل 2.5٪ الاغاروز (0.625 ز الاغاروز، 0.5 مل 50X TAE العازلة، 24.5 مل من الماء)، والحل الاغاروز الحرارة في الميكروويف حتى الغليان، ثم السماح لتبرد حتى حوالي 55-65 ° C (قادرة على لمس). مرة واحدة باردة، إضافة 2 ميكرولتر من 1٪ محلول بروميد إيثيديوم، وتصب جل.
    الحذر! بروميد إيثيديوم هو المغير ومشوه. يرجى استخدام قفازات النتريل وبروتوكول السلامة المناسبة عند التعامل مع. بدلا من ذلك، وغيرها من هلام حل كلاء يحتمل أن تكون أقل سمية أو الأصباغ يمكن استخدامها.
  10. إعداد عرقلة الحل (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100، و 10٪ مصل بقري جنيني [FBS]، و 3٪ ألبومين المصل البقري [BSA]) لمدة المناعي.
  11. إعداد غسل الحل (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100، 1٪ FBS، و 3٪ BSA) لالمناعي.
  12. إعداد PBTx (PBS مع 0.1٪ تريتون X-100) لالمناعي.
  13. إعداد غرف الحضانة الإعlture. ملء كبيرة الاطباق (100 مم) بتري مع 35 مل تعقيمها الماء. مكان قرب حيث سيتم إجراء تشريح والثقافات.

2. عزل الجنين الخصية من المصحف العضلة

  1. تحقق الماوس الإناث المقابس المهبلية كل صباح. يعتبر ظهر اليوم الذي تم الكشف عن المكونات المهبلية E0.5. الموت ببطء الماوس الإناث الحوامل في E11.5، بطريقة تتفق مع بروتوكولات الحيوانية المعتمدة.
  2. رش أسفل البطن الماوس مع 70٪ من الإيثانول.
  3. فتح الجلد أو الغشاء البريتوني في البطن مع شق على شكل حرف V باستخدام مقص غرامة وسحب رفرف من الأنسجة لفضح الأجهزة الداخلية.
  4. تحديد المبايض عند كلا الطرفين من قرن الرحم. باستخدام مقص، وقطع في المبيض والنسيج الضام لفصل الرحم التي تحتوي على أجنة من جسم الأم.
  5. فتح جدار الرحم عن طريق خفض بلطف الجانب المقابل من المشيمة، وفضح كيس المح. يجب الحرص على عدم بوncture الكيس المحي لتجنب الأجنة تلف أو فقدان.
  6. قطع بالقرب من المشيمة لإزالة كيس المح التي تحتوي على جنين ووضعها في صحن يحتوي PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. فإن وجود أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم يساعد جزيئات الالتصاق خلية دعم للحفاظ على بنية الأنسجة ويمنع النسيج من الالتصاق على أدوات تشريح.
  7. بالملقط، قم بإزالة الكيس المحي والسلى من الجنين عن طريق ثقب بعناية الكيس المحي لخلق ثقب فيها الجنين يمكن أن تنزلق. وبمجرد أن الجنين هو خارج الكيس المحي، وقطع الحبل السري.
  8. من هذه النقطة إلى الأمام، واستخدام المجهر الموجود في غطاء نسيج الثقافة العقيمة. إزالة رأس الجنين وتجاهل من قبل معسر مع ملقط على جانبي الرقبة.
  9. إزالة الذيل ومكان في أنبوب microcentrifuge جديد لتحليل XY PCR لتحديد جنس الجنين.
    ملاحظة: في حين أنه هو الأمثل لالغدد التناسلية الثقافة في أقرب وقت ممكن بعد الحصاد، بل هو أيضا نقاط البيعsible لإزالة DNA الذيل وأداء XX / XY التنميط الجيني قبل الثقافة، بحيث يعرف جنس الجنين كل وفقط من الجنس المطلوب يجب أن يكون مثقف. في حين يجري القيام به في التنميط الجيني والأجنة يمكن أن تظل فصل (بحيث يمكن تتبع) في 4 درجات مئوية أو على الجليد لتصبح جاهزة للثقافة. واحد التحذير هو أن هذه الفترة خارج الرحم أو في الثقافة الظروف قد يؤثر على قابلية للثقافة أو تطور لاحق خلال الثقافة.
  10. تأمين الجنين في موقف ضعيف ضد قاع الطبق الثقافة التي تعلق الإبطين الجنين مع زوج واحد من ملقط (عادة الملقط الذي عقد في اليد ضعيفة). الحفاظ على هذه ملقط في المكان المناسب لعقد الجنين لا يزال أثناء عملية تشريح كامل.
  11. مع زوج آخر من الملقط، وإزالة الجلد الذي يغطي البطن وإزالة بلطف الكبد، والأمعاء، وغيرها من الأجهزة للكشف عن الجدار الخلفي الجسم.
  12. كما سيتم تقع الغدد التناسلية على جدار الجسم الخلفي على جانبي الأبهر الظهري،أحد الأوعية الدموية الكبيرة على طول خط الوسط من الجسم، مغرفة تحت التلال البولي التناسلي مع ملقط المغلقة وإزالة التلال البولي التناسلي عن طريق فتح ملقط ورافعين. كما سيتم إرفاق الغدد التناسلية فضفاضة للجدار، يجب الحرص على عدم سحب ما يصل بسرعة كبيرة دون إزالة هذه الاتصالات أو الغدد التناسلية تمتد، مما تسبب في أضرار لأجهزة.
  13. نقل ريدج البولي التناسلي في cDMEM في طبق للتأقلم الأنسجة إلى وسائل الإعلام.
  14. فصل مجمع الغدد التناسلية-mesonephros عن بقية التلال البولي التناسلي باستخدام الإبر 27 G. استخدام إبرة واحدة لقطع طريق الضغط على أسفل، واستخدام البعض لتوجيه الأنسجة بشكل صحيح للسماح للفصل الأمثل. تجنب استخدام حركة النشر ضد قاع الطبق، والإبر الحادة سيخلق شظايا من البلاستيك التي يمكن التمسك الأنسجة. تأكد للحفاظ على mesonephros تعلق تماما على الغدد التناسلية.

3. التثقيف من مناسل مع المانع الصغيرة جزيء

  1. تعيين اثنين 20 μماصات لتر إلى 15 ميكرولتر لكل منهما. قطع حوالي 1-2 ملم مرة واحدة من النصائح حاجز ماصة باستخدام نظيفة، معقمة شفرة حلاقة لنقل الغدد التناسلية وإضافة للسيطرة cDMEM، في حين سيتم استخدام ماصة أخرى فقط لcDMEM المعالجة المخدرات.
  2. يصطف مع الغدد التناسلية الطويل محور مواز لطرف ماصة بحيث يمكن بسهولة أن pipetted باستخدام غيض قطع. كن حذرا من الغدد التناسلية الالتصاق إلى الداخل من طرف ماصة.
  3. تسمية جانب واحد كما الحبرية التحكم والبعض كما الحبرية التي تحتوي على المخدرات. اثنين فقط قطرات يمكن أن يصلح على 35 مم طبق الغطاء. تأكد من أن العلامات على الجفن تطابق العلامات على أنابيب microcentrifuge تحتوي ذيل الأنسجة.
  4. ماصة 15 ميكرولتر من cDMEM تحتوي على الغدد التناسلية واحد إلى قطرة في غطاء من (35 ملم) صحن الثقافة صغيرة (فقط استخدام الأغطية، وقيعان طويل القامة جدا لاحتوائه داخل غرفة طبق بتري مرطب). وضع اثنين من قطرات تحتوي على الغدد التناسلية منفصلة على جانبي الطبق، الاب فصل جيداOM بعضها البعض. الاختيار تحت المجهر للتأكد من أن الغدد التناسلية تم نقلها إلى قطرات.
  5. لالحبرية اعتبرت بمثابة السيطرة، إضافة 15 ميكرولتر إضافية من cDMEM تحتوي على DMSO (صنع في الخطوة 1.5) لجعل قطيرة مع إجمالي حجم 30 ميكرولتر. استخدم فقط "السيطرة" ماصة التي لن الاتصال المخدرات.
  6. لالحبرية أخرى (عينة المعالجة المخدرات)، إضافة 15 ميكرولتر من TKI-II-تحتوي على cDMEM لجعل قطيرة مع إجمالي حجم 30 ميكرولتر. استخدم فقط ماصة المخصصة للعينات المعالجة المخدرات.
  7. باستخدام ماصة، وانتشرت قطرات في نمط دائري توسيع حتى ما يقرب من 15-18 ملم في القطر وتقع الغدد التناسلية تقريبا في الوسط. توجيه الغدد التناسلية بحيث انها تقع على جانبها والغدد التناسلية وmesonephros يمكن تمييزها بسهولة. توجيه الرئة بحيث فصين اثنين وضع شقة.
    1. على الرغم من أن قطر القطيرات قد تختلف قليلا، وضمان أن الغدد التناسلية ليست floatinتقام ز وضعتها التوتر السطحي. تأكد من أن قطرات لا تلمس بعضها البعض، أو على جانب الغطاء. دون التوتر السطحي، فإن أجهزة تنمو على الغطاء خلال الثقافة وتتسطح، وبالتالي تشويه مورفولوجيا الجهاز.
  8. وضع بعناية غطاء صحن الثقافة التي تحتوي على قطرات تستقيم على سطح الماء في كبير (100 ملم) طبق المرطب. ضمان عدم وجود فقاعات محاصرين تحت الجزء السفلي من غطاء وأنها الاستلقاء على سطح الماء. لا عكس الغطاء ويجب الحرص على عدم ترك أي ماء تلمس الجزء العلوي من الغطاء حيث تقع قطرات.
  9. لخلق، غرفة ترطيب صغيرة، تغطية مباشرة مع غطاء الطبق المرطب أكبر لإحاطة الثقافات الغدد التناسلية. العمل في أسرع وقت ممكن للحد من أي تبخر سائل الإعلام. تأكد من أن طبق أصغر لديه غرفة بينه وبين غطاء الطبق أكبر على التحرك بحرية. خلاف ذلك، والتكثيف قد جعل ختم وبتبادل الهواء القفل إلى الأنسجة.
  10. مرة واحدة يتم وضع اثنين من الأغطية صغيرة في الغرفة، وضع على الفور غرفة في الحاضنة. احتضان الثقافات قطرة لمدة 48 ساعة في ترطيب CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية.

4. البلمرة المتسلسل لتحديد جنس الأجنة

  1. إضافة ذيول الجنينية إلى أسفل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. إضافة إلى كل أنبوب 200 ميكرولتر من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم.
  3. ضع في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو حتى يذوب الأنسجة تماما.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من 1M تريس، حمض الهيدروكلوريك ودوامة برفق لفترة وجيزة.
  5. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وجعل مزيج الرئيسي PCR الطازجة بضرب كل وحدة تخزين على العدد الكلي للعينات: 0.5 ميكرولتر 25 ميكرومتر حل التمهيدي، 2.5 ميكرولتر 10X طق العازلة، 0.5 ميكرولتر 10 ملي dNTPs (النيوكليوتيدات)، 19.3 ميكرولتر nuclease- المياه مجانا، 0.2 ميكرولتر الحمض النووي بوليميريز طق. تخلط جيدا.
  6. إضافة 23ميكرولتر من PCR مزيج الرئيسي لPCR أنابيب تحتوي على 3 ميكرولتر المحللة من ذيول هضمها.
  7. أنابيب نفض الغبار إلى مزجها، ثم نفذ تدور قصيرة لجلب العينات إلى أسفل الأنبوب.
  8. تشغيل XY (شورت) PCR برنامج (الجدول 1).
  9. تحميل العينات (مع 5X صبغ) وسلم في هلام الاغاروز 2.5٪ في المخزن 1X TAE.
  10. تشغيل الكهربائي للهلام الاغاروز حتى يمكن حلها XX XY والعصابات.
  11. صورة هلام مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية والتقاط الصور.
  12. تحليل كروموسوم X-محددة مقابل العصابات كروموسوم معين Y (كروموسوم X = 331 أزواج قاعدة [بي بي] وXY = 302 بي بي) 13؛ سوف XY (الذكور) عينات يكون شريطين من 331 و 302 نقطة أساس، في حين XX سوف تظهر عينات (للإناث) باعتبارها واحدة الفرقة 331 سنة مضت.

5. الجامع جبل الجهاز المناعي

اليوم 1:

  1. إزالة الغدد التناسلية من الثقافة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف قطع. إذا رغبت في ذلك، فإنها قد تكونتوضع في طبق من برنامج تلفزيوني ليغسل وسائل الإعلام والكواشف. ضع في برنامج تلفزيوني في أنبوب 0.5 مل microcentrifuge ل. فإن حجم أنبوب أصغر الحفاظ على الكواشف وجعلها أسهل لمتابعة العينات في الأنبوب.
    1. تأكدي من الحفاظ على السيطرة والعينات المعالجة، وكذلك عينات XX XY و، في أنابيب منفصلة وإزالتها من الثقافة مع مجموعات منفصلة من الماصات لتجنب التلوث المخدرات المحتملين.
  2. غسل الغدد التناسلية مرتين مع برنامج تلفزيوني. من هذه النقطة، يمكن استخدام هذا البروتوكول 1X PBS تفتقر إلى الكالسيوم والمغنيسيوم. لغسلها، والسماح للالغدد التناسلية لتنزل الى قاع الأنبوب (عن طريق الجاذبية) ومن ثم إزالة السائل أعلاه. يجب الحرص على عدم فقدان الغدد التناسلية من قبل pipetting قريبة جدا لهم.
  3. إزالة PBS أكبر قدر ممكن من الأنبوب. إضافة 250 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100، والسماح احتضان O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز. بدلا من ذلك، يمكن أن يتم هذا التثبيت لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز. الحذر! Paraformaldehyde هو عبارة عن مادة سامة، لذلك اتبع بروتوكول السلامة عند التعامل مع.

يوم 2:

  1. شطف الغدد التناسلية مرتين في 250 ميكرولتر PBTx في RT.
  2. غسل الغدد التناسلية 3 مرات مع 250 ميكرولتر PBTx لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT على الكرسي الهزاز.
  3. منع الغدد التناسلية لا يقل عن 1 ساعة في 250 ميكرولتر عرقلة الحل في RT على الكرسي الهزاز.
  4. وصمة عار على الغدد التناسلية O / N عند 4 درجات مئوية على الكرسي الهزاز في 250 ميكرولتر الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل.

يوم 3:

  1. شطف الغدد التناسلية مرتين في 250 ميكرولتر الحل الغسل.
  2. غسل الغدد التناسلية 3 مرات مع 250 ميكرولتر غسل الحل لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT على الكرسي الهزاز.
  3. منع الغدد التناسلية 1 ساعة في 250 ميكرولتر عرقلة الحل في RT على الكرسي الهزاز.
  4. تغطية أنبوب microcentrifuge مع رقائق الألومنيوم لحماية الأجسام المضادة الثانوية فلوري من الضوء.
  5. احتضان الغدد التناسلية 4/2 ساعة على RT على عocker في 250 الضد الثانوية ميكرولتر المخفف في عرقلة الحل تحتوي على هويشت 33342. بدلا من ذلك، نفذ الضد الثانوية وهويشت 33342 حضانة O / N عند 4 درجات مئوية على الروك.
  6. شطف الغدد التناسلية مرتين في 250 ميكرولتر PBTx.
  7. غسل الغدد التناسلية 3 مرات في 250 ميكرولتر PBTx لمدة 10 دقيقة لكل منهما في RT على الكرسي الهزاز.
  8. باستخدام قطع ماصة، ونقل الغدد التناسلية على شريحة مع الحد الأدنى من السائل. إزالة السائل الزائد مع ماصة، ولكن تأكد من أن الأنسجة لا تجف.
  9. توجيه الغدد التناسلية بطريقة المطلوب بالملقط، وبسرعة إضافة قطرة من وسائل الاعلام المتزايدة لتركيب الغدد التناسلية على الشريحة. تأكد من أن المعاطف وسائل الإعلام تصاعد جميع العينات تماما. فمن الأهمية بمكان تجنب ترك عينات تجف.
  10. استخدام coverslips (رقم 1.5 نمط) ذات حجم مناسب لتغطية بلطف العينات. السماح تصاعد انتشار وسائل الإعلام في الاتصال كامل سطح ساترة. إذا لزم الأمر، اضغط برفق جدا على زوايا ساترة بحيثلا توجد فقاعات الهواء الكبيرة.
  11. ختم الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة حول حواف للحد من تبخر من وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. متجر شنت الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية.

النتائج

الثقافة فيفو السابقين قطرة واحدة تسمح للتلاعب الأجهزة كلها، مثل الغدد التناسلية، لدراسة التفاعلات الخلوية وديناميكية الشكل 1 يوضح في خطوة حكيمة الأزياء كيفية تحضير ثقافة E11.5 الغدد التناسلية الحبرية. وتشمل الخطوات الأولى في البروتوكول ثقافة إزالة الأ?...

Discussion

توضح هذه الدراسة المجراة سابقا كله الجهاز طريقة قطرة يحتوي على العديد من التطبيقات المحتملة لدراسة التطور الجنيني. هذه التقنية يمكن استخدامها لأجهزة متعددة، ويسمح الباحث لمعالجة المسائل الحيوية التي يصعب دراسة استخدام في الجسم الحي النهج بسبب عدم إم...

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Superfrost Plus Microscope SlidesFisherbrand12-550-15
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5)Fisherbrand12-541B
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, InvisibleSally Hansen
8-Strip 0.2 ml PCR Tubes & Detached Flat CapsGeneMateT3218-1
Pipetman L P1,000L, P200L, P20L, P10L, P2LGilsonFA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M
Dumont #5 ForcepsFST91150-20
Fine ScissorsFST91460-11
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubesDenvilleC2170
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubesDenvilleC2176
10 μl SHARP Precision Barrier TipsDenvilleP1096FR
20 μl SHARP Precision Barrier TipsDenvilleP1121
200 μl SHARP Precision Barrier TipsDenvilleP1122
1,000 μl SHARP Precision Barrier TipsDenvilleP1126
1 ml syringe with 27 gauge needlesBD PrecisionGlide309623
10 ml syringeBD305559
0.2 μM PES syringe filterVWR28145-501
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mmWhatman1003-185
Primaria 35 mm Easy Grip Style Cell Culture DishFalcon/Corning353801
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm)VWR25384-088
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 IncubatorEppendorfCO14S-120-0000
Biosafety CabinetNuareNU-425-400
Mini-centrifuge Fisher Scientific05-090-100
BioExpress GyroMixer Variable XLGeneMateR-3200-1XL
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panelEppendorf950040015
SMZ445 stereomicroscopeNikonSMZ445
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase SoftwareAlpha Innotech CorporationDiscontinued
Absolute 200 proof EthanolFisherBP2818-500
Triton X-100FisherBP151-100
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4FisherS374-1
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4Sigma-AldrichP5379-1KG
Sodium Chloride (NaCl)FisherS671-3
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP3911-1KG
Magnesium Chloride (MgCl2)SigmaM2393-100g
Calcium Chloride (CaCl2)SigmaC5670-100g
Ambion Nuclease-Free WaterLife TechnologiesAM9938 
XY PCR Primer IDTN/A
Glacial Acetic AcidFisherA38-500
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)FisherBP2482-1
1% Ethidium bromide solutionFisherBP1302-10Toxic
AgaroseGeneMateE-3120-500
Sodium Hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich367176-2.5KG
Trizma BaseSigmaT1503-1KG
dNTP Set, 100 mM SolutionsThermo ScientificR0182
DNA Choice Taq polymerase with 10x BufferDenvilleCB-4050-3
ParaformaldehydeFisherO4042-500Toxic
FluorMount-GSouthern Biotech0100-01
Hydrogen Chloride (HCl)FisherA144212
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolationBioexpress0332-100g
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies11965-092
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100 nm filteredFisher03-600-511Heat-inactivate before using
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122Use at 1:100
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filteredSigmaD2650
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II - CAS 269390-69-4 - CalbiochemEMD Millipore676481
Rabbit Anti-Sox9 AntibodyMilliporeAB5535Use at dilution: 1:4,000
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) AntibodyBD Pharmingen553370Use at dilution: 1:250
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) AntibodyCell Signaling9661SUse at dilution: 1:250
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2)Life Technologies13-1900Use at dilution: 1:500
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrateInvitrogen (Molecular Probes)H1399Use at 2 ug/ml
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-165-153Use at dilution: 1:500
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch712-605-153Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateLife TechnologiesA31572Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA21206Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugateLife TechnologiesA21208Use at dilution: 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugateLife TechnologiesA31573Use at dilution: 1:500

References

  1. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
  2. Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
  3. DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
  4. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
  5. Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
  6. Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
  7. Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
  8. Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
  10. Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
  11. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
  12. Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
  13. Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
  14. Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
  15. Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
  16. Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
  17. Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
  18. Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
  19. Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
  20. Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
  21. Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
  22. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
  23. Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

104

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved