JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abstract

استجابة مناعية فعالة تعتمد على التعبئة السريعة من الكريات البيض في الدم إلى موقع العدوى أو الإصابة. التحقيق هجرة الكريات البيض في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية لفهم الأساس الجزيئي للهجرة الكريات البيض transendothelial والتفاعل مع بطانة الأوعية الدموية. واحد طريقة فعالة ينطوي intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.

هنا نقدم بروتوكول للحيدات التصوير والعدلات في 3 CX CR1 GFP / وزن الرابع الماوس حقن العدلات البرتقال المسمى صبغ مع مجهر متحد البؤر مقلوب. تجمع الأفلام مرور الزمن من 30 دقيقة إلى عدة ساعات من التصوير السماح للتحليل سلوك الكريات البيض في الأوردة المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة على حد سواء. نحن أيضا وصف الخطوات للحث محليا الأوعية الدموية التهاب مع TLR2 / TLR1 ناهض Pam3SK4 ورصد subsequeالتوظيف الإقليم الشمالي العدلات وحيدات.

ويمكن أيضا أن تقنية قدم استخدامها لرصد الشعوب الأخرى من الكريات البيض والتحقيق جزيئات المتورطين في تجنيد الكريات البيض أو الاتجار باستخدام المنبهات الأخرى أو الفئران المعدلة وراثيا.

Introduction

العدلات وحيدات هي خلايا الجهاز المناعي الفطري التي تنتشر باستمرار في الدم. على الإصابة أو العدوى، وإشارات التهابات تحفز الكرية البيضاء انسلال إلى الأنسجة التالفة والمصابة، وبدء في هذه الوثيقة استجابة مناعية خلوية 1-3. سرعة تعبئة الكريات البيض تحدد نتيجة إيجابية من الاستجابات المناعية. هذه العمليات معقدة تعتمد على جزيئات محددة (على سبيل المثال، selectins، كيموكينات محددة البطانة) موجودة على البطانة الملتهبة التي تساعد على إقامة اتصالات بين لاصقة تعميم الكريات البيض والبطانة 1-3. لحصول على رؤى على جزيئات المتورطين في الكريات البيض سلسلة التوظيف، من المهم أن تصور حركية تجنيد خلية وتتبع سلوك كل خلية / السكان. ويشمل وسيلة فعالة intravital المجهري على الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية في خلايا الفائدة.

محتوى "> وحتى الآن، وقد وضعت عدة نهج باستخدام intravital المجهري لصورة الأوعية الدموية 4،5. فعلى سبيل المثال، تم استخدام التصوير من الأدمة الأذن الأوعية الدموية أو الأوردة المساريقي بواسطة المجهر متحد البؤر حيوي داخلي لتحديد السلوك الدوريات من Ly6C الفئران حيدات منخفضة والإنسان CD14 CD16 + حيدات قاتمة على الجانب اللمعية الأوعية الدموية في ظل ظروف مستقرة 6-8. وغالبا ما يستخدم نموذج الأوعية الدموية الماوس المشمرة لرصد سلوك العدلات أو Ly6C التهابات حيدات عالية في ظل الظروف الملتهبة أو الدماغية لدى الفئران المعدلة وراثيا. وفي هذا الحالة، يتم تحفيز المشمرة عن طريق الحقن داخل الصفن من IL1β، CCL2، TNFβ أو fMLP بعد 4/2 ساعة، ثم يتم exteriorized جراحيا الأنسجة وتحليلها من قبل متحد البؤر حيوي داخلي المجهري 11/09.

يصف بروتوكول التالية طريقة لمراقبة وحيدات والعدلات في نفس الوقت مع أيمضان مقلوب المجهر متحد البؤر. وعلاوة على ذلك، تفاصيل أسلوبنا كيفية صورة السفينة نفسها قبل (حالة حالة مستقرة) وبعد الالتهاب وكيفية متابعة حركية التوظيف الكريات البيض. لهذا الغرض، ونحن نستخدم CX 3 CR1 GFP / وزن الفأر، الذي أعرب عن EGFP حيدات، والرابع حقن مع المسمى الصبغة البرتقالية العدلات الفئران. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب، فمن الممكن (1) لمتابعة وتحليل الدوريات Ly6C حيدات منخفضة في ظل ظروف مستقرة و(2) لمتابعة توظيف كل من وحيدات والعدلات في السفينة نفسها بعد التهاب المحلي. نحن هنا تهيئة الظروف التهابات باستخدام ناهض TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. وعلاوة على ذلك، يمكن لمثل هؤلاء التصوير يساعد على تحديد دور جزيئات محددة من الفائدة في مختلف مراحل سلسلة التوظيف الكريات البيض إذا أجريت على الفئران محددة الضربة القاضية، أو في وجود منع الأجسام المضادة 6،9،13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الأخلاقية المؤسسية رعاية الحيوان في جنيف، سويسرا والمكتب البيطري كانتون: ملاحظة. إذن عدد GE / 63/14.

1. إعداد تعليق خلية واحدة من نخاع العظام

  1. الماوس التضحية (8-12 اسبوع) خلع عنق الرحم. تعقيم رجليه الخلفيتين مع 70٪ من الإيثانول. إزالة الجلد من رجليه الخلفيتين.
  2. تشريح خارج عظام الفخذ الماوس وtibias وإزالة الأنسجة من الساقين مع مشرط. شطف الساقين مع 90٪ من الإيثانول ومكان في صحن الثقافة مليئة PBS.
  3. تحت غطاء محرك السيارة والثقافة، ومنديل نظيف من عظام الفخذ وtibias مع مشرط ومنفصلة في مفصل الركبة. قطع كل نهاية العظام.
  4. نخاع العظم دافق من كل العظام باستخدام إبرة 23G وحقنة 1 مل مليئة إعداد المتوسطة (الفينول الحمراء الخالية DMEM / F12، 1٪ مصل الفئران)، إلى 50 مل المسمار الأنبوب. تعطيل المجاميع الخلية عن طريق الركض بدقة من خلال شمال شرق 23Gedle وحقنة 1 مل. يصل إجمالي حجم إلى 25 مل مع إعداد المتوسطة.
  5. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل خلايا الدم الحمراء تحلل RBLC العازلة (8.3 ز NH 4 الكلورين، 1 غرام NaHCO 3، 1 مل EDTA (100 ملم)، الكامل إلى 1 L مع الماء المقطر، تصفية 0.22 ميكرون) في 15 مل المسمار الأنبوب. احتضان 30 ثانية على الجليد.
  6. إضافة 10 مل من إعداد المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C. تجاهل وطاف resuspend في 2 مل إعداد المتوسطة.

2. العدلات إثراء حسب التحديد السلبي

  1. إضافة 150 ميكرولتر من الفأر كوكتيل تخصيب العدلات (العزلة خلية منصة عدة مثل EasySep). خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  2. إضافة 10 مل من الفينول DMEM مجانا الأحمر. عكس مرة واحدة وأجهزة الطرد المركزي 250 x ج، 3 دقائق، 4 ° C.
  3. طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1.75 مل إعداد المتوسطة في البوليسترين 5 مل جولة أنابيب أسفل. إضافة 250 ميكرولتر بيوفي اختيار كوكتيل. خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  4. دوامة الجزيئات المغناطيسية (من العزلة خلية منصة طقم) لمدة 30 ثانية ل resuspend الجسيمات. إضافة 500 الجزيئات المغناطيسية ميكرولتر لتعليق الخلية. خلط واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  5. وضع أنبوب إلى المغناطيس. الانتظار لمدة 3 دقائق.
  6. عكس المغناطيس على جديد البوليسترين 5 مل جولة أنابيب أسفل لجمع الخلايا غير المسماة المطلوب. لا تأخذ آخر قطرة شنقا في الأنبوب. ستبقى الخلايا غير المرغوبة في أنبوب داخل المغناطيس. تجاهل هذا الأنبوب إلى نفايات بيولوجية.
  7. وضع أنبوب جديد في المغناطيس. الانتظار لمدة 3 دقائق.
  8. عكس المغناطيس على جديد 15 مل المسمار أنبوب لجمع الخلايا غير المسماة المطلوب. لا تأخذ آخر قطرة شنقا في الأنبوب.
  9. مجلد كامل إلى 5 مل مع الفينول الأحمر DMEM مجانا.

3. صفها من العدلات

  1. إضافة 0.5 ميكرولتر من صبغ برتقالي مثل تعقب خلية البرتقال (تركيز العمل1 ميكرومتر، CMRA - كلورو-RODOL خلات، والأوراق المالية 10 ملم في DMSO). احتضان 2 دقيقة عند 37 ° C.
  2. إضافة 2.5 مل من إعداد المتوسطة. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C.
  3. طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل إعداد المتوسطة في أنبوب 1.5 مل.
  4. اتخاذ قسامة الاعتماد مع الكريات.
  5. احتضان 5 دقائق عند 37 ° C. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C.
  6. طاف تجاهل. بيليه resuspend في 1 مل PBS. الطرد المركزي 250 x ج، 5 دقائق، 4 ° C لغسل.
  7. طاف تجاهل. بيليه resuspend كما 10X10 6 خلايا لكل 100 ميكرولتر PBS. الحفاظ على الجليد حتى حقن الرابع. ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا الرابع حقن في أسرع وقت ممكن. عادة ما يتم الحصول عليها 6-12x10 6 العدلات / الماوس.

4. إعداد ماوس لحيوي داخلي المجهر

ملاحظة: الخطوة 4.1) و 4.2) يجب أن يتم تنفيذ في بداية التجربة لتجنب وقت الانتظار الممتد من العدلات المسمى على جيمه.

  1. تزن 3 CX CR1 GFP الماوس (8-12 أسبوع من العمر).
  2. إعداد 800 ميكرولتر من التخدير (الكيتامين 60 ملغ / كغ، زيلازين 4.5 مغ / كغ، acepromazone 1.75 مغ / كغ في PBS).
  3. تخدير الماوس. حقن الملكية الفكرية مع 200 ميكرولتر / 20 غرام من الماوس. التخدير سيطرة أخمص القدمين معسر وعن طريق التحقق من معدل التنفس.
  4. حقن العدلات (10X10 6 الخلايا في 100 ميكرولتر PBS) عن طريق الوريد باستخدام أوردة الذيل الأفقي أو الجيوب الأنفية الرجعية المدارية، في راحة المجرب.
  5. ضع الماوس على وسادة التدفئة وحماية العينين مع هلام العين.
  6. يتم وضع ساترة الزجاج (35 مم) في طبق نسيج الثقافة 10 سم، والتي لديها ثقب قطره 30 ملم. استخدام النفط للحفاظ على طبق زراعة الأنسجة في اتصال مع ساترة.
  7. شق جلد البطن مع مقص لفضح الصفاق. شق الصفاق مع مقص لفضح الأمعاء.
  8. إضافة 200 ميكرولتر PBS (تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية) في صتجويف eritoneal. خذ الماوس في يدك وتحويل وجهه لأسفل، بحيث يحصل على الأمعاء من التجويف البريتوني مع ضغط لطيف. ضع الماوس في طبق زراعة الأنسجة.
  9. deroll بلطف الأمعاء مع براعم القطن المعقم على ساترة من أجل فضح الأوعية المساريقي.
  10. قطع المناديل الورقية في نطاقات والرطب لهم 37 درجة مئوية PBS ساخنة. لشل حركة الأمعاء مع قطعة من المناديل الورقية لتقليل الحركات الناتجة عن التمعج.
  11. وضع صحن زراعة الأنسجة والماوس داخل غرفة thermostated 37 ° C على حسب الطلب المرحلة علبة من مجهر مقلوب. إدخال حقنة تحتوي على مواد التخدير الشوري في الساق الخلفية. ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، يمكن للماوس تلقي الأكسجين (0.5 لتر / دقيقة) مع قناع.
  12. الماوس السيطرة للتخدير بواسطة إصبع معسر والتحقق من معدل التنفس كل 30 دقيقة. إذا لزم الأمر، وتقديم دفعة من مواد التخدير (20 ميكرولتر) للحفاظ على التخدير بشكل صحيح. ليسE: يجب تجنب تجفيف الأوعية الدموية. لذلك، يتم الحفاظ على الرطوبة عن طريق التبول بانتظام المناديل الورقية المستخدمة لشل حركة الأمعاء مع 37 ° C درجة حرارة PBS.

5. قياس العدلات والوحيدات السلوك في سفن الملتهبة في فيفو باستخدام الميكروسكوب حيوي داخلي

  1. تعيين الليزر ل488- 561- وبأقل القوة اللازمة لتجنب الضيائية التي يسببها الليزر. في تجاربنا، فمن أقل من 0.5٪. كثافة GFP في حيدات وصبغ برتقالي في العدلات هو مشرق بحيث عادة 0.3٪ بما فيه الكفاية. ملاحظة: هذا يمثل قوة الليزر من 0،15-0،25 ميغاواط مع نظامنا.
  2. الحصول على صور من 512 X 512 بكسل (أي 635 ميكرون) في 2.2 ثانية مع الثقب المفتوح باستخدام الهدف 20X الجاف للمجهر مقلوب. استخدام متعمقة ض بين 10-20 ميكرون، التي تضمن إشارة كافية مع القوى الليزر منخفضة.
    ملاحظة: نحن عادة إجراء تجارب مع متعمقة ض بين 12-1656؛ م. في حالة الأرقام والأفلام المقدمة، ض عمق 20 ميكرون. الطوري يسمح بتحديد الجدران البطانية ويتم تنفيذ التصوير في عروق المساريقي. منذ خلايا تقوم بدوريات تتحرك ببطء شديد مع سرعة 10/05 ميكرون / دقيقة 6، مسجلا مجال اهتمام كل 20 ثانية مرضية. مع الإعدادات وصفها، في مرحلة الآلية تسمح للتسجيل ما يصل إلى 7 مجالات الاهتمام في نفس الوقت.
  3. ضع الماوس والأوعية المساريقي في غرفة ترموستات المجهر يتم السماح لهم للتعافي من إعداد لمدة 30 دقيقة قبل الحصول على أول فيلم. خلال هذا الوقت، واختيار العديد من المجالات ذات الاهتمام. التركيز على سطح اللمعية السفينة الأقرب إلى الهدف. إذا لزم الأمر، والاستفادة من طفيف لصناعة السيارات في مضان من البطانة لتعيين التركيز.
    ملاحظة: جراحة خلال إعداد الماوس يؤكد قليلا البطانة. ونتيجة لذلك، المتداول العدلات وويمكن ملاحظة / أو وحيدات في أول 15 دقيقة بعد إعداد الماوس.
  4. تسجيل أول فيلم لمدة 30 دقيقة في ظل ظروف مستقرة وصورة واحدة كل 20 ثانية.
    ملاحظة: البرنامج يكتسب كل مجال من مجالات الاهتمام في 2.2 ثانية ومرحلة الآلية تنتقل تلقائيا من حقل واحد إلى آخر. انه يعود الى المركز الأول في غضون 20 ثانية خلال 30 دقيقة من الفيلم تسجيل.
  5. لبدء الأوعية الدموية التهاب، إضافة قطرة من 20 ميكرولتر من PBS تحتوي على 100 ​​ميكروغرام من TLR2 / TLR1 ناهض Pam3CSK4 12 مباشرة على الأوعية تصويرها.
  6. السيطرة على التركيز في كل مجال الفائدة.
    ملاحظة: خلال الاكتساب، هناك دائما تغييرات طفيفة في التركيز على محور ض. وعلى الرغم من 10-20 ميكرون ض متعمقة، وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض في كثافة مضان. وبالتالي، إعادة تركيز يدويا في كل مجال الفائدة في نهاية كل فيلم، إذا لزم الأمر. تسجيل الأفلام لمدة 30 دقيقة الفترات وتصل إلى 3 ساعات لالتل بعد بدء الالتهاب.
  7. في نهاية التجربة، التضحية الماوس تخدير قبل خلع عنق الرحم.

6. الجيل من ملفات الأفلام وتتبع من الكريات البيضاء

ملاحظة: برنامج الحصول على نيكون يولد .nd2 الملفات ولكن سيكون الإجراء التالي تكون مشابهة مع البرامج وغيرها من العلامات التجارية.

  1. ملفات التصدير، سلسلة شجار.
  2. الذهاب إلى يماغيج البرمجيات (http://rsb.info.nih.gov/ij/). استيراد سلسلة شجار. كل قناة كملف مختلفة.
  3. تطبيق عامل تصفية المتوسط ​​مع دائرة نصف قطرها 2.0 بيكسل للقنوات خضراء وحمراء للحد من الضوضاء الخلفية (عملية> مرشحات> الوسيط ...).
  4. تحويل الملفات إلى ثنائي (عملية> ثنائي> تقديم ثنائي). تمكين البرنامج لحساب عتبة لكل صورة.
  5. دمج القنوات في سلسلة صورة واحدة (صورة> اللون> القنوات دمج ...). حدد حيدات في الجشعن القناة، والعدلات في القناة الحمراء والضوء النافذ في قناة الرمادية.
  6. تحويل الصور مكدسة إلى ألوان RGB (صورة> اللون> كومة إلى RGB).
  7. حفظ الملف كما افي
  8. يتم استيراد البيانات وتجميعها في Imaris البرمجيات (Bitplane). ثم يتم تعقب تحركات حيدات والعدلات باستخدام معالج تتبع بقعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يصف المخطوطة بروتوكول الأمثل لمراقبة بسهولة سلوك حيدات والعدلات في عروق المساريقي الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي. استخدام الغرفة 37 درجة مئوية thermostated هو إلزامي للحفاظ على درجة حرارة الماوس، وكذلك نتيجة لحركة تعتمد درجة حرارة من الكريات البيض. يتم عرض إعداد الماوس في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المنهجيات وصفها في هذه المخطوطة توفر نهجا ثابتا لدراسة الوحيدات والسلوك العدلة بكفاءة في عروق المساريقي في ظل ظروف الدولة والتهابات ثابتة.

الخطوة الحاسمة لإعداد هو الشلل في الأمعاء مع الأنسجة PBS المبللة. إذا أجريت بشكل صحيح، تتع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 ml polystyrene round bottom tubes Beckton Dickinson352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm Nikon
Cell Tracker Orange CMRA DyeLife TechnologiesC34551
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kitStem Cell Technologies19762
EDTASigma AldrichE6758
FCSPAAA15-042
Immersion Oil Type ANikonany viscous oil 
Life Box Temperature Control SystemLife Imaging
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NH4ClSigma AldrichA9434
Nikon A1R confocal microscopeNikonA1Rinverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBSLife TechnologiesD8537
phenol red free DMEM/F12Life Technologies21041-025any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsreconstitute in PBS
Rat serumStem Cell Technologiesincluded in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100TPP93100

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105 intravital

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved