JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We describe here a protocol for the generation of iCMs using retrovirus-mediated delivery of Gata4, Tbx5 and Mef2c in a polycistronic construct. This protocol yields a relatively homogeneous population of reprogrammed cells with improved efficiency and quality and is valuable for future studies of iCM reprogramming.

Abstract

التحويل المباشر من الخلايا الليفية القلب (CFS) في العضلية التي يسببها (ICMS) يحمل إمكانات كبيرة للطب التجديدي من خلال توفير استراتيجيات بديلة لعلاج أمراض القلب. وقد تم تحقيق هذا التحويل عن طريق التعبير القسري لعوامل محددة مثل Gata4 (G)، Mef2c (M) وTbx5 (T). تقليديا، يتم إنشاؤها ICMS بواسطة مزيج من الفيروسات التعبير عن هذه العوامل الفردية. ومع ذلك، إعادة برمجة كفاءة منخفضة نسبيا والأهم من ذلك في المختبر G، M، T-transduced الخلايا الليفية لا تصبح برمجتها بشكل كامل، مما يجعل من الصعب دراسة آليات إعادة برمجة. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن رياضيات الكيمياء من G، M، T هو أمر حاسم لكفاءة إعادة برمجة ICM. ورياضيات الكيمياء الأمثل للG، M، T مع مستوى عال نسبيا من M وانخفاض مستويات G و T عن طريق استخدام ناقلات MGT متعدد المقارين (يشار إليها فيما MGT) زيادة كبيرة في كفاءة إعادة برمجة تحقيقها وتحسين نوعية ICM في المختبر. هنا نقدم وصفا مفصلا للمنهجية المستخدمة لتوليد ICMS مع MGT بناء من الخلايا الليفية القلب. وشملت عزل الخلايا الليفية القلب، جيل من الفيروسات لإعادة برمجة وتقييم عملية إعادة برمجة أيضا إلى توفير منصة لتوليد فعالة وقابلة للتكرار من ICMS.

Introduction

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide, accounting for 17.3 million deaths per year1. Loss of cardiomyocytes resulting from myocardial infarction (MI) or progressive heart failure is a major cause of morbidity and mortality2. Due to limited regenerative capacity, adult mammalian hearts usually suffer from impaired pump function and heart failure following injury3-6. As such, efficient (re)generation of cardiomyocytes in vivo and in vitro for treatment of heart disease and for disease modeling is a critical issue needing to be addressed.

Recent development of direct reprogramming, which directly reprograms cells from one differentiated phenotype to another without transitioning through the pluripotent state, offers a promising alternative approach for regenerative medicine. The mammalian heart contains abundant cardiac fibroblasts (CFs), which account for approximately half of the cells in heart and massively proliferate upon injury7-9. Thus, the vast pool of CFs could serve as an endogenous source of new CMs for regenerative therapy if they could be directly reprogrammed into functional CMs. It has been shown that a combination of transcription factors, such as Gata4 (G), Mef2c (M) and Tbx5 (T), with or without microRNAs or small molecules can reprogram fibroblasts into iCMs10-26. Importantly, this conversion can also be induced in vivo, and results in an improvement in cardiac function and a reduction in scar size in an infarcted heart16,27-29. These studies indicate that direct cardiac reprogramming may be a potential avenue to heal an injured heart. However, the low efficiency of iCM reprogramming has become a major hurdle for further mechanistic studies. In addition, the reproducibility of cardiac reprogramming is another controversial issue of this technology11,30,31.

Very recently, we generated a complete set of polycistronic constructs encoding G,M,T in all possible splicing orders with identical 2A sequences in a single mRNA. These polycistronic constructs yielded varied G, M and T protein expression levels, which led to significantly different reprogramming efficiency25. The most efficient construct, named MGT, which showed a relatively high Mef2c and low Gata4 and Tbx5 expression, significantly improved reprogramming efficiency and produced large amounts of iCMs with CM markers expression, robust calcium oscillation and spontaneous beating25. Moreover, by using MGT polycistronic construct, our study avoided the use of multiple vectors and generated cells with homogenous expression ratio of G,M,T, thus providing an improved platform for cardiac reprogramming research. To increase experimental reproducibility, here we describe in detail how to isolate fibroblasts, produce retrovirus carrying MGT cassette, generate iCMs and evaluate the reprogramming efficiency.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بروتوكول المذكورة هنا يستخدم الفئران حديثي الولادة. تتم رعاية الحيوانات والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها شعبة الطب المخبري الحيوان (DLAM) في جامعة نورث كارولاينا في تشابل هيل.

1. إعداد المخازن والإعلام

  1. إعداد الخلايا الليفية (FB) المتوسطة: الملحق 500 مل سائل الإعلام IMDM مع 100 مل مصل بقري جنيني (FBS) و 6 مل البنسلين / الستربتومايسين.
  2. إعداد ICM المتوسطة: الملحق 400 مل سائل الاعلام DMEM مع 100 مل سائل الإعلام M199 و 50 مل FBS.
  3. إعداد B27 المتوسطة: الملحق 490 مل RPMI1640 وسائل الإعلام مع 10 مل B27 وسائل الإعلام.
  4. إعداد بلات-E مستنبت: الملحق 500 مل DMEM وسائل الإعلام مع 50 مل FBS، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  5. إعداد بلات-E ترنسفكأيشن المتوسطة: الملحق 500 مل DMEM وسائل الإعلام مع 50 مل FBS و 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  6. العلاقات العامةepare الجيلاتين المغلفة 24 لوحة جيدا: إضافة 0.5 مل 0.1٪ محلول الجيلاتين إلى بئر من 24 لوحة جيدا، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل، ونضح الحق قبل الاستخدام.
  7. إعداد FACS العازلة العلامات: الملحق 500 مل DPBS مع 10 مل FBS و 2 مل EDTA (0.5 M) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 مم. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  8. إعداد MACS الفرز العازلة: الملحق 500 مل DPBS مع 2.5 ز BSA و 2 مل EDTA (0.5 M) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 مم. تمر عبر مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  9. إعداد العازلة HBS 2X لترنسفكأيشن: تكملة 500 مل HEPES العازلة (50 ملم) مع 280 ملي كلوريد الصوديوم (8.1816 ز)، 10 ملي بوكل (0.37275 جم)، 1.5 ملي نا 2 هبو 4 (0.10647 جم)، 12 ملي الجلوكوز (1.08096 جم ). إضافة حوالي 650 ميكرولتر 10 N هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة إلى 7،05-7،12. مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  10. إعداد 2.5 M CaCl 2 حل لترنسفكأيشن: إضافة 18.376 ز كاالبنود 2-50 مل ده 2 O. مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرون المسام وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  11. إعداد ICC (مناعية) عازلة التثبيت: إضافة 5 مل بارافورمالدهيد (PFA، 32٪) إلى 35 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 4٪.
  12. إعداد ICC العازلة permeabilization: إضافة 0.1 مل تريتون إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 0.1٪.
  13. إعداد ICC عازلة حظر: إضافة 5 ز المصل البقري الزلال (BSA) إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 5٪.
  14. إعداد ICC عازلة تلطيخ: إضافة 1 ز BSA إلى 100 مل DPBS للوصول إلى تركيز النهائي من 1٪.

2. جيل من الأطفال حديثي الولادة ماوس القلب الليفية

  1. توليد الخلايا الليفية القلب من طريقة ثقافة يزدرع
    1. نظيف حديثي الولادة αMHC-GFP الماوس المعدلة وراثيا (P1 إلى P2) مع 75٪ من الإيثانول. قطع رأس قبالة مع مقص العقيمة. ثم إجراء شق أفقي من تحت الإبط واحدة إلى أخرى. استخدام معقمملقط حادة وعازمة على تشريح من القلب ووضعه في بئر واحدة من لوحة 24 جيدا تحتوي على الجليد الباردة PBS العازلة.
      1. بدلا من ذلك، اخراج القلب بعد شق أفقي.
    2. تحقق من التعبير GFP في القلب عن طريق المجهر الفلورسنت. منذ مدفوعة التعبير GFP التي كتبها αMHC المروج الذي هو المروج معين في القلب، وينبغي أن يكون القلب من الماوس المعدلة وراثيا في الأخضر 15، في حين أن القلب السلبي الباهت في أي مضان.
    3. يستغرق 3-4 GFP قلوب الإيجابية إلى 60 ملم مركز جيد صحن الثقافة واللحم المفروم إلى قطع صغيرة أقل من 1 مم 3 في حجم بواسطة مقص العقيمة وملقط.
    4. ضع 3-4 قلوب المفروم في واحد صحن 10 سم مع 2 مل سائل الإعلام FB. السماح للأنسجة يستقر لمدة 3 ساعة.
    5. إضافة ببطء 8 مل قبل تحسنت وسائل الإعلام FB إلى الأطباق التي تحتوي على أنسجة القلب. لا تخل الأنسجة لمدة ثلاثة أيام.
    6. استبدال وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام.
    7. في يوم 7، aspirأكل مستنبت وغسل الخلايا مع DPBS. إضافة 3 مل 0.05٪ التربسين إلى كل لوحة وهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    8. إضافة 5 مل سائل الإعلام FB لإرواء التربسين. بلطف فصل الخلايا مع مكشطة الخلية. ماصة وسائل الاعلام صعودا وهبوطا لفصل مزيد ميكانيكيا الأنسجة.
    9. جمع الخلايا وتصفية من خلال 40 ميكرومتر مصافى الخلية لتجنب التلوث من شظايا أنسجة القلب، ومن ثم بيليه الخلايا من خلال الدوران في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. غسل الخلايا مرة واحدة مع MACS العازلة والخلايا جاهزة للفرز.
  2. توليد الخلايا الليفية القلب من طريقة الهضم انزيم
    1. حصاد GFP قلوب إيجابية 2.1.1. نقل كل القلوب في صحن 10 سم مع 10 مل DPBS الجليد الباردة.
    2. ضغط البطينين مع ملقط معقم لإزالة الدم وشطف مرة واحدة مع DPBS الجليد الباردة.
    3. تقليم قلوب لتكون خالية من الأنسجة والدهون الأخرى.
    4. قطع كل القلب إلى ما يقرب من 4 قطع التي لا تزال ارتباطا فضفاضا.
    5. إذا كانت أقل من 20 القلوب، نقل نفوس الى 15 مل أنبوب مخروطي مع 8 مل دافئ 0.05٪ التربسين-EDTA، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      1. إذا كان هناك 20-30 القلوب، ونقل القلوب إلى 50 مل أنبوب مخروطي مع 10 مل دافئ 0.05٪ التربسين-EDTA، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. تجاهل التربسين وإضافة 5 مل (لأقل من 20 القلوب) أو 10 مل (لمدة 20-30 القلوب) الدافئة النوع الثاني كولاجيناز (0.5 ملغ / مل) في HBSS.
    7. دوامة أنبوب على vortexer لمدة 1 دقيقة على مستوى السرعة في جميع أنحاء 4-6 (إذا كان السائل لا تحصل على ما يصل إلى الغطاء، ثم سرعة على ما يرام).
    8. احتضان أنبوب في 37 ° C حمام الماء لمدة 3-5 دقيقة.
    9. دوامة الأنبوب لمدة 1 دقيقة.
    10. الرواسب لمدة 1 دقيقة عن طريق الجاذبية حتى قطعة نسيج يستقر، وجمع السائل في أنبوب جديد يحتوي على 5 مل FB الباردة المتوسطة.
    11. كرر الخطوات من 2.2.6-2.2.10 3-5 مرات.
    12. الجمع بين جميع المجموعات من خلال تصفية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومترلجعل تعليق خلية واحدة.
    13. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    14. خلايا resuspend في 10 مل MACS العازلة، وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    15. اختياري: إذا كان هناك الكثير من خلايا الدم، Resuspend الخلايا مع 1 مل RBC تحلل العازلة (150 ملي NH 4 الكلورين، 10 ملي KHCO 3، و 0.1 ملي EDTA)، والحفاظ على الجليد لمدة 1 دقيقة، ثم تمييع مع 10 مل MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق. غسل واحد لمزيد من الوقت مع العازلة MACS.
  3. عزل Thy1.2 + الليفية التي كتبها MACS (المغناطيسي تنشيط فرز الخلايا)
    1. تحديد عدد الخلايا قابلة للحياة من خلال تلطيخ التريبان الأزرق.
      1. يستغرق 10 ميكرولتر من خلايا من 10 مل تعليق خلية في الخطوة 2.2.14. مزجها مع 10 ميكرولتر 0.4٪ التريبان حل الأزرق.
      2. إضافة الخليط إلى عدادة الكريات. السماح لها الوقوف لمدة 3-5 دقيقة ثم فحص على الفور تحت المجهر. وملطخة في الخلايا الزرقاء وقابلة للحياة الخلايا الميتة هي غير ملوثين.
        3. عدد جميع خلايا قابلة للحياة في أربعة مربعات 1 مم ركن من أركان عدادة الكريات. تحديد عدد الخلايا قابلة للتطبيق: متوسط ​​عدد لكل متر مربع × 2 (عامل التخفيف) × 10 4 × 10 (الحجم الكلي للتعليق الخلية).
    2. أقل من 1 × 10 7 خلايا، Resuspend الخلايا مع بلي Thy1.2 10 ميكرولتر في 90 ميكرولتر برود عازلة MACS. إضافة المزيد من الخرز نسبيا إذا كان هناك أكثر من 1 × 10 7 الخلايا. تخلط جيدا واحتضان في الثلاجة (2-8 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة.
    3. إضافة 10 مل MACS العازلة وعينات تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق. يغسل مرة واحدة مع 10 مل MACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. تحقيق وحدة التخزين إلى 2 مل العازلة في MACS.
    5. إنشاء فاصل MACS في غطاء محرك السيارة. إدراج عمود LS لالفاصل. تطبيق 3 مل MACS العازلة إلى العمود لكي تتوازن فيه.
    6. تمرير تعليق الخلية من خلال العمود LS معايرتها.
    7. يغسل 3 مرات مع 2 مل MACS العازلة في كل مرة.
    8. تأخذ العمود LS قبالة ركان فاصل وأزل 3 مرات مع 2 مل MACS العازلة في أنبوب جديد 50 مل.
    9. تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    10. خلايا resuspend في 10 مل سائل الإعلام FB، عد الخلايا والبذور في لوحات في كثافة المناسبة. لالليفية الناتجة عن أسلوب ثقافة يزدرع، يمكن أن كثافة الخلايا البذر يكون حوالي 2-3 × 10 4 خلايا / جيد من 24 لوحة جيدا. لالليفية ولدت من طريقة انزيم الهضم، يمكن أن كثافة الخلايا تكون حوالي 4-5 × 10 4 خلايا / جيد من 24 لوحة جيدا.

3. توليد الارتجاعي للICM إعادة برمجة

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية في BSL2 خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة. يوصى التخلص السليم من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل، نصائح ماصة والأنابيب لتجنب خطر حدوث الأخطار البيئية والصحية.

  1. الحفاظ على خلايا بلات-E في بلات-E وسائل الإعلام تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل بوروميسين و 10 ميكروغرام / مل بlasticidin عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. في يوم 2 استبدال المتوسطة التي كتبها بلات-E مستنبت تفتقر بوروميسين وblasticidin.
  3. في اليوم 0، تقسيم الخلايا بلات-E في 10 سم أطباق اليوم قبل ترنسفكأيشن في حوالي 4-5 × 10 6 خلايا لكل لوحة. يجب أن تكون الخلايا ~ 80-90٪ متكدسة يوم ترنسفكأيشن.
  4. في يوم 1، وسائل الإعلام ثقافة التغيير إلى وسائل الإعلام ترنسفكأيشن على الخلايا داخل 1 ساعة قبل ترنسفكأيشن. إجراء ترنسفكأيشن على النحو التالي:
    1. ترنسفكأيشن باستخدام مجموعات تجارية
      1. مزيج 20 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن (على سبيل المثال Lipofectamine) و 500 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل (على سبيل المثال، غروب MEM). إضافة 10 ميكروغرام من البلازميد فيروسات إلى 500 ميكرولتر آخر خفضت وسائل الاعلام المصل. احتضان كل الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق.
      2. إضافة ببطء الخليط إلى خليط ترنسفكأيشن البلازميد. هذه الخطوة قد تستغرق 15-30 ثانية. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في RT (قد يظهر حل غائم).
      3. إضافة قطرة مزيج من الحكمة أن الخلايا.
      4. احتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. ترنسفكأيشن باستخدام فوسفات الكالسيوم.
      1. مزيج 40 ميكرولتر 2.5 M CaCl 2 و 440 ميكرولتر ده 2 O، ثم إضافة 20 ميكروغرام من البلازميد فيروسات (ضبط كمية من ده 2 O بحيث الحجم الإجمالي هو 500 ميكرولتر).
      2. إضافة 500 ميكرولتر 2X HBS إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
      3. دوامة HBS وفي الوقت نفسه إضافة خليط-DNA الكالسيوم إلى HBS قطرة من الحكمة. هذه الخطوة يستغرق حوالي 30 ثانية لكل عينة. حتى الحد الأقصى قيام 3-4 عينات في وقت واحد.
      4. في احتضان RT لمدة 3 دقائق الحضانة لوقت أطول يؤدي إلى راسب أكبر والخلايا أقل ستتناول راسب.
      5. يضاف خليط إسقاط الحكمة أن الخلايا ومراقبة تحت المجهر 20X. وينبغي أن ينظر الرواسب الدقيقة (الكثير من الشركات الصغيرة هي جيدة ولكن عدد قليل من الشركات الكبيرة ليست جيدة).
      6. احتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  5. في يوم 2، تغيير وسائل الاعلام على الخلايا مع 8 مل prewarmed سائل الإعلام والثقافة. احتضان لمدة 24 ساعة.
  6. في يوم 3 و 4 يوم، وجمع ثقافة طاف من الأطباق باستخدام الحقنة 10 مل العقيمة، وتصفية من خلال 0.45 ميكرون حجم المسام السليلوز مرشح خلات، ونقل في أنبوب 50 مل. إضافة 2 مل من الفيروس الارتجاعي هطول حل كل 8 مل تحتوي على فيروس طاف. مزيج بلطف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. في يوم 5، وتدور الخليط الفيروسي في 1500 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يجب أن تظهر الجسيمات الفيروسية في بيليه الأبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
  8. تجاهل طاف. تدور باستمرار الحل المتبقي بواسطة الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة كل آثار السائل بواسطة الشفط، مع الحرص الشديد على عدم تعكير صفو الرجعية الجسيمات المترسبة في بيليه.
  9. و resuspend الكريات فيروسات مع 100 ميكرولتر العازلة DPBS لكل 8 مل طاف الفيروسي. قاسم غير تامفيروس على الجليد. استخدامها على الفور أو تخزين في -80 ° C.

4. إعادة برمجة الخلايا الليفية القلب

  1. إضافة 4 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حل polybrene في ICM المتوسطة 10 مل، والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. التركيز النهائي من polybrene هو 4 ميكروغرام / مل.
  2. إضافة 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ICM التي تحتوي على polybrene إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا المصنف مع الخلايا الليفية.
  3. إضافة 10 ميكرولتر الارتجاعي لتحتوي كل منها على ما يرام سواء 3/2 × 10 4 الخلايا من ثقافة يزدرع أو 4-5 × 10 4 الخلايا من طريقة انزيم الهضم. وينبغي زيادة كمية الفيروس بشكل متناسب مع زيادة عدد الخلايا في لوحات ثقافة مختلفة أو الأطباق. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة للسماح للعدوى فيروسية. يظهر خط الزمن لإعادة البرمجة القلب في الشكل 1.
  4. بعد تنبيغ الفيروسية، استبدل الفيروس التي تحتوي على وسائل الاعلام مع 500 ميكرولتر وسائل الإعلام ICM منتظم.
  5. تغيير وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. لاختيار الإيجابية للخلايا transduced الفيروسية، إضافة وسائط ICM تستكمل مع بوروميسين في 2 ميكروغرام / مل لاستهداف الخلايا. يبقيه لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك، والحفاظ على بوروميسين في المتوسط ​​ICM في تركيز 1 ميكروغرام / مل.
  6. بعد ثلاثة أيام من العدوى الفيروسية، واتخاذ لوحة الخروج من الحاضنة ووضعه تحت المجهر الفلورسنت المقلوب (20X) لمراقبة GFP التعبير.
    ملاحظة: بعد عشر أيام من العدوى الفيروسية، ويمكن أن تحصد الخلايا لتحليل FACS وتحليل للمحكمة الجنائية الدولية لتحديد كفاءة إعادة برمجة (في الخطوة 5 و 6).
  7. بعد أربعة عشر يوما عدوى فيروسية، استبدال ICM وسائل الاعلام مع وسائل الإعلام B27. تغيير وسائل الاعلام كل ثلاثة أيام. قد تظهر الضرب العفوي خلية مواضع من ثلاثة (الخلايا من طريقة الهضم انزيم) أو أربعة (الخلايا من يزدرع الأسلوب الثقافة) أسابيع بعد تنبيغ الفيروسية.

5. تحليل Immunocytochemical من كفاءة إعادة برمجة

  1. الخلايا شطفمع الثلج الباردة PBS ثلاث مرات؛ إزالة حل الزائد.
  2. إضافة 0.5 مل ICC عازلة التثبيت إلى كل بئر من 24 لوحات جيدة. إصلاح الخلايا في RT لمدة 15-20 دقيقة.
  3. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  4. إضافة 0.5 مل ICC العازلة permeabilization إلى كل بئر من 24 لوحات جيدة. Permeabilize الخلايا في RT لمدة 15 دقيقة.
  5. شطف الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  6. إضافة 0.5 مل ICC عرقلة العازلة إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا، في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
  7. الأجسام المضادة الأولية مخففة مع العازلة تلطيخ المحكمة الجنائية الدولية. إضافة 200 ميكرولتر الحلول الضد إلى كل بئر واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يتم سرد العوامل الأجسام المضادة في تخفيف المواد.
  8. في اليوم التالي، وغسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات.
  9. إضافة 200 ميكرولتر الحلول الضد الثانوية إلى الخلايا واحتضان لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
  10. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث مرات.
  11. إضافة 150 ميكرولتر تركيب محلول يحتوي على دابي إلى كل بئر. السماح لوصمة عار نواة لمدة 1 دقيقة. ثمتغطية كل بئر مع جولة الغطاء الزجاجي الانزلاق واضغط بلطف زلة ضد السطح السفلي مع ملقط لإزالة فقاعات الهواء.
  12. نضح الحل الزائد والعينات جاهزة للتصوير. وتظهر الصور التمثيلية تظهر الخلايا المعاد برمجتها التي تعبر عن علامة القلب cTnT وαActinin في D14 في الشكل 2B.

6. تحليل FACS من كفاءة إعادة برمجة

  1. اغسل خلايا مرة واحدة مع DPBS. إضافة 0.3 مل التربسين (0.05٪) إلى كل بئر واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. اضغط برفق لوحة لتسهيل رفع الخلايا. تحقق من مفرزة الخلايا تحت المجهر. إضافة 1 مل FACS العازلة على كل جانب عندما يتم فصل معظم الخلايا. ماصة صعودا وهبوطا لفصل مزيد ميكانيكيا الخلايا.
  3. نقل الخلايا في لوحة جيدا 24 إلى 96 لوحة بئر عميقة جيدا جيدا جيدا. تدور في 200 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لجمع الخلايا.
  4. غسل الخلايا مرة واحدة معFACS العازلة.
  5. إضافة 100 ميكرولتر الحلول تثبيت / permeabilization ل resuspend الخلايا لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. غسل الخلايا مرتين مع حل 1X غسل، بيليه، وإزالة طاف.
  7. يعد حل الأجسام المضادة الأولية ضد GFP وcTnT في غسل العازلة 1X. تماما resuspend كل عينة مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. غسل خلايا مرة واحدة في محلول غسل 1X، بيليه، وإزالة طاف.
  9. إضافة 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على فلور اليكسا 488 حمار مترافق مفتش المضادة للأرنب وفلور اليكسا 647 حمار مترافق مكافحة الفأر مفتش لكل عينة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  10. غسل خلايا مرة واحدة في محلول غسل 1X، بيليه، وإزالة طاف.
  11. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر العازلة التثبيت (DPBS مع 1٪ PFA). نقل الخلية في أنبوب FACS مع غطاء مصفاة الخلية. عينات جاهزة للكشف FACS. تحليل FACS التمثيلي للبرمجة الكفاءهذ باستخدام pMxs-بوروميسين-MGT بناء مع أو بدون اختيار بوروميسين هو مبين في الشكل 2A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وتتولى التخطيطي لخص خطوات إعادة برمجة في الشكل 1. بعد MGT تنبيغ، يمكن الكشف عن التعبير GFP في إعادة برمجة الخلايا في وقت مبكر من يوم 3. بوروميسين اختيار الخلايا transduced تبدأ من يوم 3 وحافظت خلال الأسبوعين الأولين إذا PMX-بورو يستخدم بناء -MGT. يوم 10 إلى يوم 14، ق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لتوليد ICM الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من العوامل الهامة التي تؤثر على الكفاءة بوجه عام. خاصة في ظل الظروف الخلايا الليفية بدء ونوعية الترميز الارتجاعي MGT يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كفاءة إعادة برمجة.

من المهم ل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful for expert technical assistance from the UNC Flow Cytometry Core and UNC Microscopy Core. We thank members of the Qian lab and the Liu lab for helpful discussions and critical reviews of the manuscript. This study was supported by NIH/NHLBI R00 HL109079 grant to Dr. Liu and American Heart Association (AHA) Scientist Development Grant 13SDG17060010 and the Ellison Medical Foundation (EMF) New Scholar Grant AG-NS-1064-13 to Dr. Qian.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-cardiac troponin TThermo ScientificMS-295-PO1:200 for FACS and 1:400 for ICC
anti-GFPLife TechnologiesA111221:500 for both FACS and ICC
anti- aActininSigma-AldrichA78111:500 for both FACS and ICC
anti-Connexin43Sigma-AldrichC62191:500 for  ICC
anit-Mef2cAbcamab646441:1,000 for ICC 
anti-Gata4Santa Cruz Biotechnologysc-12371:200 for ICC
anti-Tbx5Santa Cruz Biotechnologysc-178661:200 for ICC
Alexa Fluor 488–conjugated donkey anti-rabbit IgGJackson ImmunoResearch Inc711-545-1521:500 for both FACS and ICC
Alexa Fluor 647–conjugated donkey anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch Inc715-605-1501:500 for both FACS and ICC
Cytofix/Cytoperm kit for intracellular stainingBD Biosciences554722
Rhod-3 Calcium Imaging KitLife TechnologiesR10145
Thy1.2 microbeadsMiltenyi Biotec130-049-101
Vectashield solution with DAPIVector labsH-1500
FBSSigma-AldrichF-2442
Trypsin-EDTA (0.05%)Corning25-052
PRMI1640 mediumLife Technologies11875-093
B27 supplementLife Technologies17504-044
IMDMLife Technologies12440-053
Opti-MEM Reduced Serum MediumLife Technologies31985-070
M199 mediumLife Technologies10-060
DMEM, high glucoseLife Technologies10-013
Penicillin-streptomycinCorning30-002
Non-essential amino acidsLife Technologies11130-050
Lipofectamine 2000Life Technologies11668500
blasticidinLife TechnologiesA11139-03
puromycinLife TechnologiesA11138-03
Collagenase IIWorthingtonLS004176
polybreneMilliporeTR-1003-G
Triton X-100FisherBP151-100
CaCl2Sigma-AldrichC7902
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClSigma-AldrichBP358-212
KClSigma-AldrichPX1405
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
GlucoseSigma-AldrichG6152
Bovine serum albuminFisher9048-46-8
paraformaldehydeEMS15714
Retrovirus Precipitation SolutionALSTEMVC-200
0.4% Trypan blue solutionSigma-AldrichT8154
gelatinSigma-AldrichG1393
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1x)Sigma-AldrichD8537
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)Corning21022
LS columnMiltenyi Biotec130-042-401
0.45 μm cellulose acetate filter Thermo Scientific190-2545
24-well platesCorning3524
10 cm Tissue culture dishes Thermo Scientific172958
60 mm center well culture dish  Corning3260
96 Well Clear V-Bottom 2 ml Polypropylene Deep Well PlateDenville ScientificP9639
Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap BD Biosciences352235
CentrifugeEppendorf5810R
Vortexer MINIVWR58816-121
EVOS FL Auto Cell Imaging SystemLife TechnologiesAMAFD1000
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Round glass cover slipElectron Microscopy Sciences72195-15

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2015 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2014).
  2. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, (2010).
  3. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493, 433-436 (2013).
  4. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
  5. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17169-17174 (2009).
  6. Choi, W. Y., Poss, K. D. Cardiac regeneration. Curr Top Dev Biol. 100, 319-344 (2012).
  7. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: the renaissance cell. Circ Res. 105, 1164-1176 (2009).
  8. Ieda, M., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16, 233-244 (2009).
  9. Moore-Morris, T., et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis. J Clin Invest. 124, 2921-2934 (2014).
  10. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. J Mol Cell Cardiol. 60, 97-106 (2013).
  11. Chen, J. X., et al. Inefficient reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes using Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 50-55 (2012).
  12. Christoforou, N., et al. Transcription factors MYOCD, SRF, Mesp1 and SMARCD3 enhance the cardio-inducing effect of GATA4, TBX5, and MEF2C during direct cellular reprogramming. PLoS One. 8, e63577(2013).
  13. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1, 235-247 (2013).
  14. Hirai, H., Katoku-Kikyo, N., Keirstead, S. A., Kikyo, N. Accelerated direct reprogramming of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells with the MyoD transactivation domain. Cardiovasc Res. 100, 105-113 (2013).
  15. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142, 375-386 (2010).
  16. Inagawa, K., et al. Induction of cardiomyocyte-like cells in infarct hearts by gene transfer of Gata4, Mef2c, and Tbx5. Circ Res. 111, 1147-1156 (2012).
  17. Islas, J. F., et al. Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 13016-13021 (2012).
  18. Jayawardena, T. M., et al. MicroRNA-mediated in vitro and in vivo direct reprogramming of cardiac fibroblasts to cardiomyocytes. Circ Res. 110, 1465-1473 (2012).
  19. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. Embo J. 33, 1565-1581 (2014).
  20. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141, 4267-4278 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Reprogramming of human fibroblasts toward a cardiac fate. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 5588-5593 (2013).
  22. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. J Mol Cell Cardiol. 53, 323-332 (2012).
  23. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8, 1204-1215 (2013).
  24. Wang, H., et al. Small Molecules Enable Cardiac Reprogramming of Mouse Fibroblasts with a Single Factor, Oct4. Cell Rep. , (2014).
  25. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 Influences the Efficiency and Quality of Induced Cardiac Myocyte Reprogramming. Circ Res. , (2014).
  26. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485, 599-604 (2012).
  27. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485, 593-598 (2012).
  28. Mathison, M., et al. In vivo cardiac cellular reprogramming efficacy is enhanced by angiogenic preconditioning of the infarcted myocardium with vascular endothelial growth factor. J Am Heart Assoc. 1, e005652(2012).
  29. Srivastava, D., Ieda, M., Fu, J., Qian, L. Cardiac repair with thymosin beta4 and cardiac reprogramming factors. Ann NY Acad Sci. 1270, 66-72 (2012).
  30. Muraoka, N., Ieda, M. Stoichiometry of transcription factors is critical for cardiac reprogramming. Circ Res. , 116-216 (2015).
  31. Srivastava, D., Ieda, M. Critical factors for cardiac reprogramming. Circ Res. 111, 5-8 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

105 ICM Mef2c Gata4 Tbx5 MGT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved