التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو لإظهار كيفية رصد ديناميات البروتين fluorescently الموسومة على أسطح الخلايا النباتية مع متغير الزاوية المجهر epifluorescence، والتي تبين وامض النقاط من الموسومة GFP PATROL1، وهو بروتين الاتجار الغشاء، في القشرة خلية من مجمع الثغور في نبات الأرابيدوبسيس thaliana.

Abstract

A plant’s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed ‘residence time’) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

Introduction

The plant cell surface, including the plasma membrane and its immediately adjacent cytoplasm, is the main region of a plant cell’s perception and integration of biotic and abiotic cues from the extracellular environment. In response to these cues, cell surface components including plasma membrane proteins and the cortical cytoskeleton undergo dynamic changes, on a time scale of seconds to minutes^1-4. Thus, real-time and high-resolution imaging of fluorescent proteins on the cell surface can illuminate a plant’s responses to environmental cues at the molecular level.

Confocal laser scanning microscopy is a powerful tool for determination of fluorescently-tagged protein localization³, however, it is often difficult to monitor the real-time protein dynamics because of its relatively long capturing times. An emerging technique for real-time monitoring of proteins in the plant cell is variable angle epifluorescence microscopy (VAEM), which is an adaptation of equipment usually used for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. In TIRF microscopy, the fluorescence-excitation light source is an evanescent light field that is generated when the entry angle of the laser is shallow enough to totally internally reflect light at the glass–water interface. The penetration depth of the evanescent light field is around 100 nm. TIRF microscopy is an outstanding tool for single molecule imaging, such as the detection of exocytosis in animal cells⁵. However, evanescent light cannot reach plasma membranes or the cortical cytoplasm in plant cells, because they have thick cell walls. Recently, TIRF microscopy equipment has been adapted by plant cell biologists, observing that a laser, if angled slightly more deeply than when being used to induce total internal reflection phenomena, could excite the surface of plant cell samples, resulting in high-quality plant cell imaging^6,7. The excitation illumination depth is varied by adjusting the entry angle of the laser; therefore, this technique is described as VAEM. This optical system is also called variable angle TIRF microscopy (VA-TIRFM) because there is a possibility that total reflection may take place at the cell wall-periplasm interface⁷, however, the term VAEM is used in this article, as per the first report in plants⁶.

The goal of this protocol is to demonstrate practical procedures for using VAEM to visualize fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces. Additionally, an image analysis protocol to quantify the residence time (duration of presence) of molecules is described for VAEM movie analysis. GFP-PATROL1 dot blinking on stomatal complex cells in Arabidopsis thaliana cotyledons is used as an example. PATROL1 was identified by forward genetic approaches as a causal gene of a stomatal response defect mutant in A. thaliana⁸. PATROL1 is a plant homolog of MUNC-13, which is a priming factor in synapse vesicle exocytosis⁸. In response to environmental cues, such as light or humidity, it is thought that PATROL1 reversibly regulates the delivery of a proton pump to plasma membranes in the stomatal complex. Stomatal complexes each comprise a pair of guard cells⁸ and subsidiary cells⁹, and they require a proton pump for stomatal movement. In these cells, GFP-tagged PATROL1 localizes to dot-like structures that remain on the plasma membrane for less than 1 min⁹.

Protocol

1. إعداد الشتلات

1. تعقيم البذور.
   1. تحضير محلول التعقيم عن طريق إضافة 500 ميكرولتر NaClO (الكلور المتاحة: 5.0٪) و 1 ميكرولتر 10٪ تريتون X-100-500 ميكرولتر الماء المعقم.
   2. مكان كاليفورنيا 10 المعدلة وراثيا A. thaliana البذور تحمل GFP-PATROL1 ⁸ في أنبوب 1.5 مل.
   3. إضافة 1 مل 70٪ محلول الإيثانول، ومزيج جيد من قبل قلب خمس مرات. يترك لمدة 1 دقيقة.
   4. مراقبة البذور تنزل الى قاع الأنبوب. في نظيفة مجلس الوزراء تدفق الصفحي، وإزالة بلطف الايثانول 70٪ باستخدام micropipette، وإضافة 1 مل من محلول التعقيم. مزيج جيد من قبل قلب خمس مرات ويترك لمدة 5 دقائق.
   5. تغسل البذور. لا تزال تعمل تحت ظروف معقمة على مقاعد البدلاء النظيفة، وإزالة بلطف الحل باستخدام micropipette، وإضافة 1 مل من الماء المعقم. كرر هذه خمس مرات. يمكن تخزين البذور المعقمة في الماء المعقم عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
2. هكذاث البذور المعقمة على 0.5٪ جيلان-عزز اللثة 1/2 Murashige وسكوغ لوحة المتوسطة (درجة الحموضة 5.8) ^9. الشريط غطاء على لوحة باستخدام طبقتين من الشريط الجراحية.
3. احتضان لوحة في الظلام في 4 درجة مئوية مع غرفة التخزين البارد، O / N.
4. نقل لوحة في غرفة النمو وضعت في 23.5 درجة مئوية مع / 12 ساعة دورة ضوء الظلام لمدة 12 ساعة باستخدام 100 ميكرومول م ^-2 ثانية ^-1 أضواء بيضاء، واحتضان لمدة 7 أيام. الشتلات مع النبتات من حوالي 1 مم طويل ويمكن بعد ذلك أن تحصد.

2. السماء قطرة تركيب النبتة العينات

ملاحظة: ثمة عامل مهم في إعداد العينات للمراقبة VAEM هو تجنب إدراج فقاعات الهواء بين العينة وغطاء زجاجي. فقاعات يقلل كثيرا من جودة الصورة من خلال التسبب في VAEM الاختلافات في معامل الانكسار. وهناك طريقة بسيطة، والتي طالبنا 'قطرة السماء "تصاعد مستمر، ويمكن استخدامها لتجنب الفقاعاتبين A. النبتات thaliana وغطاء زجاجي. ينبغي أن يتم ذلك مباشرة قبل المراقبة.

1. ضع 30 ميكرولتر من العازلة القاعدية [5 ملي 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic حمض تريس (MES-تريس) في درجة الحموضة 6.5، 50 ملي بوكل، 100 ميكرومتر CaCl _2] في وسط شريحة زجاجية (الحجم: 76 × 26 مم، سمك: 1،0-1،2 مم).
2. إزالة فلقة من الشتلات القديمة لمدة 7 أيام باستخدام مقص تشريح. تعويم فلقة مع الجانب المراقبة تواجه حتى على قطرة القاعدية العازلة (الشكل 1، الخطوة 1).
3. ضع 30 ميكرولتر من العازلة القاعدية في وسط غطاء زجاجي (الحجم: 18 × 18 مم، سماكة: 0،12-0،17 مم) (الشكل 1 الخطوة 2). تحويل الزجاج غطاء رأسا على عقب بلطف. والتوتر السطحي منع انخفاض عازلة من السقوط. عقد غطاء زجاجي مع ملاقط على حافة واحدة. ضع حافة المعاكس على شريحة زجاجية بحيث انخفاض عازلة تقريبا فوق فلقة.
4. مع حافة غطاء زجاجي لا يزال على الشريحة، والاستمرار في الضغط على الحافة المقابلة مع ملاقط، وضبط الموقف من الانخفاض عازلة تحت غطاء زجاجي بحيث تكون مباشرة فوق العينة فلقة (الشكل 1، الخطوة 3). ترك من الزجاج غطاء. جبل انخفاض على عينة مما أدى إلى إعداد دون فقاعات الهواء.
5. تمحو عازلة الزائد باستخدام أنسجة خالية من الوبر. مراقبة إعداد فورا (راجع الخطوة 3).
   ملاحظة: ليست هناك حاجة لختم العينات.

3. VAEM مراقبة واكتساب السينما

ملاحظة: نظام المجهر TIRF ⁹ المستخدمة في هذه الدراسة يوصف على النحو التالي: تم تجهيز مجهر مقلوب مع وحدة TIRF وعدسة موضوعية TIRF مع الفتحة العددية 1.49. من أجل السيطرة الآلية لزاوية دخول الليزر، يتم استخدام مربع عنصر التحكم. بروتين الفلورية الخضراء (GFP) هو متحمس مع 488 نانومتر ضخ بصريا ليزر أشباه الموصلات، وروقال انه تم الكشف عن مضان من خلال 510-550 نانومتر الفرقة تمرير فلتر لمنع تألق ذاتي من البلاستيدات الخضراء. القيمة القصوى المقاسة من انتاج الألياف السلطة هي 13،0-13،5 ميغاواط. للكشف، إلكترون تتضاعف الجهاز المسؤول عن جانب (EM-CCD) نظام الكاميرا رئيس وحدة تغير الكاميرا التكبير C-جبل تستخدم.

1. معايرة معدات الاختبار والتركيز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة لملاحظات VAEM دقيقة. فمن المستحسن أن فحوص دورية للإجراءات تعديل مسار الليزر، ومناسبة لالمجهر، يتم تنفيذها.
   1. تحديد الموقف المركزي مضيئة مع موضوعي مسار الضوء خالية من العدسة على سقف الغرفة المجهري. بمناسبة موقعا مركزيا، ووضع ختم دائرة الملونة على السقف (الشكل 2، الخطوة 1، 2).
   2. إلقاء الضوء على السقف مع العدسة الشيئية (الشكل 2 الخطوة 3، 4). نقل طlluminated المنطقة إلى موقف وسط (الشكل 2، الخطوة 5). تركيز الليزر (الشكل 2، الخطوة 6). صقل موقف ليزر مركز لمركز (الشكل 2، الخطوة 7).
2. وضع العينة على مرحلة المجهر وتحديد خلايا للمراقبة باستخدام إضاءة حقل مشرق.
3. تأكد من أن بروتين فلوري يمكن ملاحظة في الخلايا، وتحديد موقف ض -axis على سطح الخلية باستخدام epifluorescence إضاءة (الشكل 3A).
4. أداء الملاحظات VAEM.
   1. تركنوا زاوية دخول شعاع الليزر تدريجيا مع مربع وحدة تحكم. وفي الوقت نفسه، رصد صورة حية بعناية. في البداية، سوف يكون واضحا للصورة (الشكل 3B).
   2. كما يزيد زاوية الليزر، فإن الصورة VAEM تصبح أقل واضح، في نهاية المطاف إنتاج صورة واضحة (الشكل 3C وD). في هذه المرحلة، ووقف increaالغناء زاوية الليزر. في حالة فقدان إشارة مضان، تنخفض إلى زاوية الضحلة.
   3. صقل زاوية دخول ليزر للحصول على أفضل صورة. صقل موقف ض -axis يمكن أيضا تحسين الصورة. إذا لزم الأمر، وضبط المعلمات البصرية (قوة الليزر، والطول الموجي ومجموعة فلتر) والمعلمات صورة الاستشعار [حجم الصورة، وقت التعرض، كسب، التحويل الرقمي وبضرب الإلكترون (EM) أرباح].
      ملاحظة: في حالة المعدات المجهر TIRF المذكورة أعلاه، المعلمات التمثيلية هي على النحو التالي. التكبير من عدسة عادل امام الكاميرا: 2X. انتاج الليزر: 1،0 ميغاواط. حجم الصورة: 512 × 512 بكسل. وقت التعرض: 100 مللي ثانية. كسب: 5 ×؛ التحويل الرقمي: 11 ميغاهرتز؛ وEM مكاسب: 100.
5. الحصول على الفيلم باعتباره TIFF ملف صورة متعددة الصفحات باستخدام برنامج المجهر التجاري. هنا، والفيلم هو من النقاط المسمى GFP امض على سطح خلايا الثغور.
   ملاحظة: التمثيلية شروط الحصول على الصور هي كما فلأدنى مستوياته. الوضع الاستحواذ: تيار لذاكرة الوصول العشوائي؛ عدد الإطارات: 600؛ وحجم متعدد الصفحات ملف TIFF: ~ 302 MB.

4. تحليل مخطاط التموج لالكمي لالمسمى GFP دوت الإقامة الوقت عن طريق فيجي البرمجيات

1. تثبيت فيجي ('فيجي هو فقط يماغيج') برنامج ¹⁰ باستخدام إرشادات المؤلفين (http://fiji.sc/Fiji).
2. تشغيل فيجي وفتح ملف TIFF متعددة الصفحات المكتسبة باستخدام القائمة فيجي "ملف المفتوحة".
3. وضع خط على موقع مصلحة، وذلك باستخدام أداة فيجي شريط القوائم "خط مستقيم أداة التحديد". اختياريا، واستخدام "مقطع الخط أداة التحديد" أو "حر الخط أداة التحديد". في النتائج المعروضة هنا، وضعت خط مستقيم من 100 بكسل (الموافق 8،0 ميكرون) على خلية تابعة الشكل (4A).
4. تقديم صورة مخطاط التموج باستخدام القائمة فيجي "صورة-الأكوام-الديناميكي Reslice "(http://fiji.sc/Dynamic_Reslice) (الشكل 4B). اختياريا، "الوجه عموديا" و "استدارة 90 درجة" في إطار خانة الاختيار متاحة (لا تستخدم في النتائج المقدمة هنا). وX- و y-axis في الصورة مخطاط التموج تشير إلى موقف خط (100 بكسل المقابلة لكما 8.0 ميكرون)، ووقت رصد (600 بكسل الموافق 60 ثانية)، على التوالي. إذا كانت الصورة مخطاط التموج ليست مرضية، وموقف ونوع (على التوالي، مجزأة ومرفوعة) من خط على الصورة متعدد الصفحات قد تغيرت. كما التغييرات الخط، صورة مخطاط التموج يتغير بشكل حيوي. حفظ صورة مخطاط التموج كملف TIFF باستخدام القائمة فيجي "ملف-حفظ باسم-المشاجرة".
5. قياس طول النقطة في اتجاه محور الزمن.
   1. لأداء الحد من الضوضاء، وتطبيق فلتر التمويه على الصور مخطاط التموج باستخدام القائمة فيجي "عملية-فلاتر التمويه الضبابي". و"سيغما (رادالناهية) "المعلمة غير الانضباطي (يستخدم 1 بكسل دائرة نصف قطرها عن النتائج المقدمة).
   2. الجزء المناطق إشارة من العتبة، وذلك باستخدام القائمة فيجي "صورة-ضبط-عتبة".
      ملاحظة: هناك العديد من الخوارزميات العتبة للاختيار من بينها. في النتائج المقدمة، تم اختيار خوارزمية "الين" (الشكل 4C).
   3. الاستعداد لقياس الوقت (ص) -axis طول النقطة باستخدام القائمة "القياسات تحليل-مجموعة". التحقق من "المستطيل إحاطة" في "مجموعة قياسات" النافذة. من الناحية المثالية ينبغي أن تكون مجموعة منطقة صغيرة قدر الإمكان، على أن تستبعد الضوضاء. هنا، تم تعيين الحد الأدنى من المنطقة في 50 بكسل. قياس الوقت (ص) -axis طول النقطة باستخدام القائمة "تحليل-تحليل الجزيئات". للحصول على القيم نتيجة وإثبات مصداقية المناطق القياس، والتحقق من "عرض النتائج" و "إضافة إلى مدير </ م> "صناديق.
   4. القيم في العمود "الطول" هي الوقت (ص) -axis أطوال لسائل قياس (الشكل 4D). حفظ القيم باستخدام القائمة جدول نتائج "ملف-حفظ باسم" وحساب ومعالجة بيانات من فترات صورة النقطة باستخدام الحزمة الإحصائية و / أو برنامج جداول البيانات (الشكل 4E).

النتائج

في هذه المقالة الفيديو، وبروتوكولات لمراقبة VAEM من GFP-PATROL1 في A. وتقدم خلايا معقدة thaliana فلقة الثغور. انخفاض السماء تصاعد هي طريقة إعداد بسيط قد يساعد على التقليل من حدوث فقاعات الهواء في الأعمال التحضيرية VAEM من A. النبتات thaliana (الشكل 1). سوف Overt...

Discussion

في هذه المقالة الفيديو، الذي يتم إعطاء بروتوكولات لرصد وقياس السلوك الديناميكي من النقاط GFP-PATROL1 على مجمع الثغور من نبات الأرابيدوبسيس thaliana. كما هو موضح هنا، والمراقبة VAEM هو أداة قوية لتصوير حي لأسطح الخلايا النباتية. تحت ظروف تجريبية تستخدم هنا لرصد GFP-PATROL1، كان ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted microscope	Olympus	IX-73
TIRF unit	Olympus	IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens	Olympus	UAPON 100 × OTIRF	NA = 1.49
Laser angle control box	Chuo Seiki	QT-AK
Optically pumped semiconductor laser	Coherent	SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter	Olympus	U-FBNA
EM CCD camera	Hamamatsu Photonics	ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit	Olympus	U-TVCAC
MetaMorph software	Molecular Devices	MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual	Olympus	AX7385	Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil	Olympus	Immersion Oil Typr-F	ne = 1.518 (23 degrees)