كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

Summary

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Abstract

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Introduction

فهم بنية البروتين على المستوى الذري هو المفتاح لكشف الأساس الجزيئي للمسارات البيولوجية والأمراض. الأشعة السينية البروتين البلورات هي / طريقة المطبق الأكثر استخداما لتحديد هياكل الجزيئات. التحدي الرئيسي لهذه الطريقة هو الحصول على كميات كافية من مطوية بشكل صحيح، البروتين النقي. هذا يصبح قضية خاصة عندما تعمل مع البروتينات الثدييات يفرز، التي تخضع التعديلات بعد متعدية محددة.

البروتينات أعرب البكتريا-هي المصدر الرئيسي للبروتينات تبلور المودعة في بنك معلومات البروتين ^1. ويفضل أنظمة التعبير البكتيرية إلى حد كبير لأنها سريعة وغير مكلفة وتنتج غلة عالية من البروتين عادة. ومع ذلك، غالبا ما تكون غير مطوية بشكل صحيح المجالات خارج الخلية من البروتينات الثدييات أعرب في البكتيريا، التي مطلوبة refolding حالة وتنقية واسعة الخطوات للحصول على متجانس FOlded البروتين. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات الثدييات تتطلب بالغليكوزيل آخر متعدية لتحقيق لطي السليم ^2. على الرغم من أن التعبير وبالغليكوزيل في خلايا الخميرة أو الحشرات يمكن التغلب على مشكلة قابلة للطي، والتعديلات بعد متعدية، بما في ذلك بالغليكوزيل، تختلف كثيرا عن تلك الخلايا الثديية ^3، مما أسفر عن البروتينات مع التعديلات غير صحيحة أو غير متجانسة.

خلايا الثدييات تعبر عن جميع الآلات الجزيئية اللازمة لضمان التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية المناسبة وقابلة للطي. ومع ذلك، لا يفضل هذه الأنظمة التعبير عادة من قبل معظم المختبرات، وذلك بسبب عائدات محدودة وارتفاع تكاليف الكواشف والمواد الاستهلاكية. Polyethyleneimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن هو معيار رخيصة نسبيا ولكن يفرض السمية الخلوية كبيرة وانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن، مما أدى إلى زيادة التكاليف في وسائل الإعلام خلية، DNA، وزراعة المعدات. العديد من البدائل لPEI باهظة التكاليف. نتناولهذه القضايا من خلال وصف مزيج من تحسين أدوات زراعة الخلايا ومعدلة كيميائيا PEI للطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا للتعبير عن البروتينات الثدييات يفرز، تليها خطوة واحدة تنقية. هذا الأسلوب القوي يعطي عوائد كافية للدراسات الفنية والبيوكيميائية ^4، وفي بعض الحالات، يؤدي إلى بروتين قابلة للتبلور دون مزيد من التنقية.

يصف هذا البروتوكول العديد من التقنيات لتحقيق أقصى قدر من التعبير والاستسلام للبروتينات في الثدييات يفرز في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293F الخلايا المزروعة في التعليق. كفاءة ترنسفكأيشن (والتكلفة)، وإنتاج البروتين وتنقية كلها تتعزز بشكل كبير باتباع هذا البروتوكول. PEI تعديل بإضافة الكربانيت من خلال خطوة واحدة رد فعل عصابة فتح (PEI-TMC-25 والتركيب والخواص وصفها بالتفصيل في المرجع ⁵⁾ يحسن إلى حد كبير كفاءة ترنسفكأيشن، ويقلل من السمية الخلوية من الموجبةاضطراب الغشاء، وبالتالي يقلل من تكاليف التجربة. وعلاوة على ذلك، بقاء الخلية وبروتين تعبير تحسنت كثيرا مع إضافة المكملات الثقافة لتوفير الجلوكوز والفيتامينات. الأهم لإنتاج البروتينات الغليكوزيلاتي، والمعاملة مع kifunensine، مثبط كيميائية غير سامة من مانوزيداز I، وتنتج البروتينات مع المعرفة، glycans غير الناضجة، والتي يمكن إزالتها بواسطة EndoHf endoglycosidase لانتاج البروتينات مع واحد N-acetylglucosamine في مكان كامل طول N-ربط غليكان ^6. وأخيرا، فإن إفراز البروتينات في المصل خالية والمتوسطة محددة كيميائيا يسمح تنقية السريعة والسهلة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. خطوة واحدة حامض والنيكل nitrilotriacetic (ني NTA) تنقية الراتنج يزيل معظم تلويث الأنواع في طاف، وفي بعض الحالات، يمكن أن تسفر عن بروتين من نقاء كافية لبلورة.

Protocol

1. إنتاج كميات مليغرام DNA البلازميد على نطاق واسع ترنسفكأيشن عابر

1. استنساخ البروتين من الفائدة في نسخة عالية عدد الثدييات ناقلات التعبير باستخدام الاستنساخ موقع التقييد، أو تقنية أخرى مناسبة.
   1. لأفضل النتائج، استخدم pHLsec ⁷ ناقلات، والتي لديها المدمج في محطة سي 6His العلامة، مروج تسلسل كوزاك قوي وإشارة إفراز الأمثل.
2. تحويل البلازميد على الخلايا المختصة.
   1. إضافة 20 ميكرولتر من الخلايا القولونية E. المختصة على 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
   2. خلايا الصدمة الحرارية في 42 درجة مئوية لمدة 35 ثانية، ثم احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
   3. إضافة 300 ميكرولتر من متوسط ​​النمو الميكروبي (SOC)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
   4. لوحة الخلايا على لوحة أجار مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة.
      1. استخدام 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين إذا البلازميد هو في ناقلات pHLsec.
3. المستعمرات ثقافة في 250 مل من مرق لوريا (LB) وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل مضاد حيوي (كربنيسيلين) O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
4. تنقية DNA من الثقافة باستخدام مرحبا السرعة البلازميد ماكسي كيت وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
   1. أزل الحمض النووي في المخزن EB (10 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 8.5)، بدلا من العازلة TE.
   2. قسامة البلازميد المنقى في المبلغ اللازم لترنسفكأيشن وتخزينها في -20 ° C.

2. على نطاق واسع الثقافة وعابر ترنسفكأيشن من خلايا 293F

1. الملحق 1 L 293F وسائل الإعلام مع 10 مل من الجلوتامين و 5 مل القلم / بكتيريا (سواء 100X). تخزينها في 4 ° C. 5 مل القلم / بكتيريا هو مصدر قوة كافية في ظروف خالية من المصل وتركيز المضادات الحيوية انخفاض يحسن بقاء الخلية خلال ترنسفكأيشن، مما يحسن من عوائد البروتين.
2. ثقافة الخلايا 293F في 300 مل سائل الاعلام في 1 L البولي حير قوارير مخروطي مع غطاء تنفيسالصورة في 37 ° C مع 8٪ CO _2، في حين تهتز في نسيج الثقافة حاضنة قياسية.
3. تمييع الخلايا إلى 5 ^× 5 10 / مل كثافة قبل ترنسفكأيشن يوم واحد.
4. في يوم ترنسفكأيشن، الملحق مستنبت بإضافة حجم 10٪ من 2٪ ث / ت سرع في 293F وسائل الإعلام.
   1. قياس تركيز الجلوكوز باستخدام جهاز الجلوكوز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والمكملات استخدام حسب الحاجة لتحقيق تركيز الجلوكوز من 500 ملغ / ديسيلتر.
5. إضافة kifunensine (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) في هذه الخطوة للسيطرة على البروتين بالغليكوزيل.
6. حساب حجم DNA اللازمة ل1 ميكروغرام البلازميد في 1 × 10 ⁶ خلايا. تحت ظروف معقمة، وتمييع DNA في 5 مل مصل خالية المتوسطة.
7. حساب حجم كاشف ترنسفكأيشن اللازمة ل1 ميكروغرام البلازميد في 2 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن. تحت ظروف معقمة، وتمييع كاشف ترنسفكأيشن (PEI-TMC-25) في 5 مل مصل خالية المتوسطة.
8. إضافةكاشف ترنسفكأيشن إلى حل DNA في 1 مل الزيادات، خلط بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT للمجمعات-DNA كاشف لتشكيل. ثم إضافة محلول على الخلايا بطريقة الإفلات من الحكمة.
9. السماح الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل للتعبير عن البروتين ل72-96 ساعة. الملحق مع وسائل الإعلام ~ 10٪ زيادة حجم خلية يوميا، أو حسب الضرورة للحفاظ على مستوى السكر في قراءة 400-600 ملغ / ديسيلتر.

3. تنقية

1. صب الثقافة في قارورة الطرد المركزي، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1300 x ج لتكوير الخلايا ومن ثم جمع طاف. إذا لزم الأمر، وتدور مرة ثانية و / أو استخدام فلتر 0.22 ميكرون لتوضيح طاف.
2. إضافة 10٪ حجم 10X ني NTA العازلة ملزمة (1.5 M كلوريد الصوديوم، 0.5 MK ₂ هبو _4، 0.1 M تريس درجة الحموضة 8.5، 50 ملي إميدازول).
3. إعداد عمود الجاذبية عن طريق إضافة 2 مل من ني NTA الطين في عمود وتوازنه مع 10 مجلدات العمود (CV) من 1X العازلة ملزمة. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بكل الخطوات عمود في غرفة C 4 درجات. البديلةاعل، البروتين البرد وجميع المخازن على الجليد قبل الخطوة العمود، والحفاظ على البروتين والتي تم جمعها من خلال التدفق على الجليد.
   ملاحظة: ني NTA الطين هو 50٪ راتنج من حيث الحجم والقدرة على تصنيع وملزمة المعلن هو 50 ملغ / مل. حبات ني NTA يمكن إعادة شحن لاستخدامات متعددة
4. تدفق طاف على الراتنج وجمع التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة.
5. يغسل مع 10 CV من غسل العازلة (300 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي K ₂ هبو ₄ و 20 ملي إميدازول درجة الحموضة 8).
6. أزل البروتين في 5 CV من شطف العازلة (300 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي K ₂ هبو _4، 250 ملي إميدازول درجة الحموضة 8).
7. إذا كنت بحاجة deglycosylation:
   1. عن الحجم النهائي من 0.5 مل، والتركيز شطافة إلى 0.43 مل باستخدام مكثف الطرد المركزي. إذا يترسب النموذج، بيليه أي حطام بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجات مئوية.
   2. إضافة 50 ميكرولتر من 500 ملي نا السيترات درجة الحموضة 5.5.
   3. إضافة 20 ميكرولتر من EndoHf (1 × 10 ⁶ U / مل). في احتضان RT لمدة 2 ساعة.
      ليسه: يعمل انزيم الأمثل عند 37 درجة مئوية، مما قد يسبب البروتين مركزة لتجميع. تمديد حضانة RT، إذا deglycosylation، المقررة من قبل SDS-PAGE أو immunoblotting، غير كامل. لم يقم انزيم النشاط في 4 درجات مئوية.
   4. لإزالة EndoHf: غسل الأميلوز الراتنج 3X في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو عازلة التخزين النهائي. احتضان البروتين مع الراتنج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تدور 5 دقائق في 1000 x ج لتكوير الخرز وجمع طاف.
   5. تركيز البروتين باستخدام الوزن الجزيئي قطع فلتر الطرد المركزي المناسب والعازلة الصرف إلى العازلة التخزين (150 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي HEPES 7.5 درجة الحموضة).

النتائج

يلي هذه الوثيقة نتائج هذا النظام التعبير تطبيقها على يفرز 13 كيلو دالتون المناعي (IG) المجال من البروتين مما اثار مستقبل بشري أعرب عن خلايا الدم النخاعي 2 (hTREM2، وبقايا 19-132). TREM2 هو نوع I بروتين الغشاء خارج الخلية التي تحتوي على مجال واحد أ.ج التي لديها اثنين من السندات ثاني...

Discussion

خلايا كلوة 293F تقدم إنتاج قوي من البروتينات التي تتطلب التعديلات بعد متعدية. هذا النظام يسمح التعبير السريع وقابلة للبروتينات مطوية أصلا تحتوي على ثنائي السلفيدات، بالغليكوزيل، والفسفرة التي لولاها تكون غائبة في استخدام المزيد من أدوات التعبير الروتينية. وبالإضافة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919