JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن تصف الإجراء التجريبي بسيطة وسريعة لتوليد الخلايا الليفية الأولية من الأذنين وذيول الفئران. لا يتطلب إجراء تدريب خاص الحيوان، ويمكن استخدامها لتوليد الثقافات الليفية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما.

Abstract

وتستمد الخلايا الأولية مباشرة من أنسجة ويعتقد أن يكون أكثر تمثيلا للالحالة الفسيولوجية للخلايا في الجسم الحي من خطوط الخلايا المحددة. ومع ذلك، ثقافات الخلية الأولية عادة ما يكون لها عمر محدود وتحتاج إلى كثير من الأحيان إعادة تأسيس. الليفية هي مصدر يمكن الوصول إليها بسهولة من الخلايا الأولية. هنا، نحن نناقش إجراء التجارب بسيطة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان وذيول الفئران. يمكن استخدامها على بروتوكول إنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان المخزنة في RT لمدة تصل إلى 10 يوما. عند اتباع البروتوكول بعناية، من غير المرجح أن تحدث على الرغم من استخدام الأنسجة غير معقمة تخزينها لفترة طويلة في بعض الحالات التلوث. الليفية تتكاثر بسرعة في الثقافة ويمكن توسيعها لتشمل أعداد كبيرة قبل ان يخضع الشيخوخة تنسخي.

Introduction

وتستمد الخلايا الأولية من الأنسجة ومثقف يعيشون في ظل ظروف في المختبر. ويفترض عموما أن الخلايا الأولية أكثر شبها الدولة الفسيولوجية والخلفية الوراثية من الأنسجة التي نشأت من خطوط الخلايا خلد أو ورم 1. لهذا السبب، الخلايا الأولية تمثل نموذجا مفيدا لدراسة المسائل البيولوجية 2،3. ولكن، على عكس خطوط الخلايا المنشأة التي تنمو إلى أجل غير مسمى، الخلايا الأولية تخضع في نهاية المطاف الشيخوخة في الثقافة وتحتاج إلى كثير من الأحيان إعادة تأسيس.

وتشمل الخلايا الأولية التي تستخدم عادة الخلايا الليفية، الخلايا الظهارية، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا T والخلايا B، الضامة المشتقة من نخاع العظام (BMDM) والعظام المستمدة من نخاع الخلايا الجذعية (BMDC). وغالبا ما تستخدم الخلايا الليفية كما الخلية الأولية نموذج ثقافة. أنها توفر مزايا رئيسية على الخلايا الأولية الأخرى. وأنشأت مزارع الخلايا بسهولة، حافظ بسهولة ولا تحتاج إلى purificaنشوئها من الخلايا السابقة للثقافة. لديهم الانتشار الأولي السريع وأي شرط لبروتوكولات متوسطة أو تفعيل المتخصصة. الليفية يمكن transfected بكفاءة باستخدام البيولوجية والكيميائية والفيزيائية بروتوكولات 4،5. هناك إمكانية لتخزين الأذنين لمدة تصل إلى 10 يوما في RT قبل إنشاء مزارع الخلايا. الثقافات الليفية تؤدي إلى تصور عمليات حشوية ومناسبة لإعادة برمجة إلى الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا 6.

الليفية هي خلايا هامة من النسيج الضام التي تفرز بروتينات الكولاجين والمصفوفة خارج الخلية 7. أنها توفر الإطار الهيكلي في العديد من الأنسجة 8 وتلعب دورا أساسيا في التئام الجروح وإصلاح الأنسجة 9،10.

هنا، نحن تصف (4 ساعات <) بروتوكول بسيطة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية من آذان وذيول الفئران 11. البروتوكول يتطلب الحد الأدنى من الماوستجربة لحصاد الأنسجة (وعلى النقيض من البروتوكولات الأخرى 12،13)، ويمكن استخدامها لإنشاء الثقافات من آذان المخزنة في المتوسط ​​في RT لمدة تصل إلى 10 يوما.

Protocol

وتم إيواء الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية حتى euthanization (الرعاية المؤسسية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) المبادئ التوجيهية في جامعة سنغافورة الوطنية واللجنة الوطنية الاستشارية لمختبر أبحاث الحيوان (NACLAR) المبادئ التوجيهية).

1. الفئران

  1. من أجل الماوس واحدة من الخلفية الوراثية المناسبة. ويستند هذا البروتوكول على الأنسجة المستمدة من C57BL واحد / 6 الماوس.

2. إعداد الكامل المتوسطة

  1. إعداد المتوسطة كاملة بإضافة المكونات التالية لمعهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة: 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 50 ميكرومتر 2-المركابتويثانول، و 100 ميكرومتر الأسباراجين، 2 ملي الجلوتامين، 1٪ محلول البنسلين ستربتومايسين.

3. إعداد حلول أنزيم

  1. يعد حل كولاجيناز D في 15 مل المخروطية أنبوب أسفل.
    1. تزن 10 ملغ من كولاجيناز D. ديssolve كولاجيناز D في 4 مل المتوسطة كاملة.
  2. يعد حل pronase في أنبوب 1.7 مل microcentrifuge ل.
    1. تزن 10 ملغ من pronase.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من 1 M تريس العازلة (درجة الحموضة 8.0). إضافة 1 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة).
    3. أعلى مع 494 ميكرولتر من الماء المعقم.
    4. احتضان الحل pronase عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.

4. إعداد كولاجيناز D-pronase ميكس (≤2 الذيول)

ملاحظة: نفذ الخطوات اللاحقة في الثقافة العقيمة خلية غطاء محرك السيارة.

  1. إضافة 250 ميكرولتر من محلول pronase إلى 4 مل من محلول كولاجيناز D.
  2. تمرير كولاجيناز-D pronase خليط من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون إلى 15 مل العقيمة المخروطية أنبوب أسفل.

5. استخراج الخلايا الليفية من الأذن والذيل الأنسجة

  1. الموت ببطء الفئران فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المناسبة.
  2. وضع تعقيمها الأدوات الجراحية (مقص وملقط) في الخلية هود الثقافة.
  3. إضافة 10 مل المتوسطة كاملة في كل منهما 10 سم أطباق زراعة الخلايا لكل منهما.
  4. قطع آذان (~ 1 سم نصف قطر) و 5 سم من الذيل (من طرف الذيل) على فأرة الحاسوب مع مقص واحتضان لمدة 5 دقائق في 40 مل 70٪ من الإيثانول في 50 مل العقيمة المخروطية أنبوب أسفل.
  5. آذان الهواء الجاف والذيل عن طريق وضعها في صحن 10 سم ثقافة الخلية مفتوحة في غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق. جفت مرة واحدة، ونقل الأذن وقطع الذيل لأطباق ثقافة اثنين وصفت "آذان" و "ذيل" تحتوي على 10 مل المتوسطة كاملة كما هو موضح في الخطوة 5.3.
  6. إزالة الشعر من الأذنين والذيل باستخدام المقص.
  7. قطع الأذنين والذيل إلى قطع أصغر من 3 ملم في حجم باستخدام المقص.
  8. نقل الأنسجة يقتطع 1.8 مل قارورة cryotube المسمى "آذان" و "ذيل" وإضافة كولاجيناز كافية الحل D-pronase لحجم للوصول إلى علامة 1.8 مل في القارورة.
  9. Pالدانتيل قارورة cryotube أفقيا على شاكر ويهز العينات في 200 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة عند 37 ° C.
  10. بعد 90 دقيقة الحضانة، وإزالة قارورة cryotube من شاكر ووضع قارورة في غطاء محرك السيارة.
  11. إضافة 10 مل المتوسطة كاملة في كل منهما 10 سم أطباق زراعة الخلايا، وصفت "آذان" و "ذيل" لكل منهما، ووضع مصفاة 70 ميكرومتر خلية في كل طبق.
  12. وضع هضمها الأذن والذيل الأنسجة في مصفاة 70 ميكرومتر الخلية في أطباق وفقا لذلك وصفت أعدت في الخطوة 5.11 وبقوة طحن الأنسجة باستخدام 10 مل حقنة المكبس ل> 5 دقائق. هز مصفاة الخلية في بعض الأحيان على المدى المتوسط ​​لغسل الخلايا من مصفاة الخلية.
  13. ماصة تعليق خلية من كل طبق في أنابيب أسفل اثنين من 15 مل المخروطية المسمى "آذان" و "ذيل". غسل الطبق ومصفاة مع 10 مل إضافية المتوسطة كاملة وإضافة وسيلة لمناسبة 15 مل أنابيب أسفل المخروطية.
  14. تدور باستمرار الخليةتعليق لمدة 7 دقائق في ~ 580 x ج و 4 ° C باستخدام جهاز للطرد المركزي خلية المبردة.
  15. إزالة طاف، إضافة 10 مل المتوسطة كاملة لبيليه خلية في 15 مل المخروطية أنبوب أسفل وresuspend الخلايا.
  16. كرر الخطوة 5.14 و 5.15.

6. التثقيف من خليط الخلية

  1. إزالة طاف. تأكد من أن بيليه الخلية لا يزال دون عائق.
  2. اعادة تعليق الخلايا في 10 مل المتوسطة كاملة ويضاف خليط منهما لمدة 10 سم أطباق زراعة الخلايا المسمى "آذان" و "ذيل".
  3. إضافة 10 ميكرولتر حل الأمفوتريسين B (حل الأوراق المالية: 250 ميكروغرام / مل) إلى الثقافة.
  4. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
  5. في اليوم الثالث، استبدال المتوسطة مع المتوسطة كاملة 10 مل الطازجة التي تحتوي على 10 ميكرولتر من الأمفوتريسين B لإزالة الأنقاض (الشكلان 1 و 2).

7. الثقافة الفرعية من الخلايا الليفية

  1. عرجثقافة ن تصل حوالي 70٪ confluency (يوم 4/3 للثقافة) إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 1X الفوسفات 5 مل العقيمة مخزنة المالحة (PBS).
  2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل 1X محلول معقم التربسين- EDTA إلى الخلايا.
  3. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة.
  4. بعد 5 دقائق، اضغط بلطف الطبق الثقافة وإضافة 6 مل المتوسطة كاملة للخلايا.
  5. نقل تعليق خلية لأنبوب أسفل 15 مل مخروطي الشكل وتدور الأنبوب لمدة 5 دقائق في ~ 450 x ج و 4 ° C باستخدام جهاز للطرد المركزي خلية المبردة.
  6. إزالة طاف، وبلطف إعادة تعليق بيليه خلية في 5 مل المتوسطة كاملة.
  7. البذور 2 × 10 5 الخلايا في صحن 10 سم ثقافة الخلية واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 3-4 أيام قبل تكرار الخطوات 7،1-7،6.

8. إعداد الآذان للشحن

ملاحظة: إجراء رانه الخطوات اللاحقة في الثقافة العقيمة خلية غطاء محرك السيارة.

  1. الموت ببطء الفئران فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية المناسبة.
  2. وضع مقص ملقط تعقيمها وإلى الخلية هود الثقافة.
  3. إضافة 50 مل المتوسطة كاملة إلى 50 مل المخروطية أنبوب أسفل.
  4. قطع آذان (~ 1 سم نصف قطر) على فأرة الحاسوب مع مقص.
  5. نقل الأذنين في 50 مل المخروطية أنبوب أسفل (كما أعدت في الخطوة 3) باستخدام ملقط.
  6. ختم الأنبوب السفلي 50 مل المخروطية مع parafilm قبل الشحن في RT في الخانة المناسبة.

النتائج

استخراج الخلايا الليفية من نتائج الأنسجة في كمية كبيرة من الحطام الأنسجة (الشكل 1). وعلى النقيض من الحطام الأنسجة، والخلايا الليفية تلتزم الأنسجة السطوح البلاستيكية الثقافة بين يوم 1 و 3 من الثقافة. وسيلة الثقافات الليفية يمكن تغيير بسلام في يوم 3 من الثقافة، ...

Discussion

هنا نقدم إجراء التجارب بسيطة وغير مكلفة وسريعة لإنشاء الثقافات الليفية الأولية من آذان وذيول الفئران. استخراج ينبغي أن يؤدي إلى تقسيم الخلايا الليفية ملتصقة وبسرعة في غضون 3 أيام بعد العزلة من الأنسجة. قيود هاما من الخلايا الأولية هو الشيخوخة، وتوقف نمو دائم 15....

Disclosures

The authors declare no conflict of financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI-1640HyCloneSH30027.01
Fetal Calf SerumHyCloneSV30160.03
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
AsparagineSigma-AldrichA4159
GlutamineSigma-AldrichG8540
Penicillin/StreptomycinHyCloneSV30010
EthanolMerck Millipore107017Absolute for analysis
Collagenase DRoche Diagnostics11088866001From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase proteaseMerck Millipore53702From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8)1st BASE1415Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8)1st BASEBUF-1053Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)1st BASEBUF-2040-10X4LUltra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10XSigma-Aldrich59418C-100ML0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin BSigma-AldrichA2492-20ml250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
ScissorsAesculap
ForcepAesculapAE-BD312R
0.2 μM syringe filterSartorius Stedim16534
70 μM cell strainerSPL93070
Syringe plungerTerumoSS+10L
Cryovial tubeNUNC368362
1.7 ml microcentrifuge tubeAxygenMCT-175-C
10 cm cell culture dishGreiner664160Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tubeGreiner188271
50 ml conical bottom tubeGreiner227261
Water bathGFL1002
CentrifugeEppendorf5810R
Incubation shakerSartorius StedimCertomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscopeCarl Zeiss AG

References

  1. Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
  2. Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary epithelial cells. Genes Dev. 15 (1), 50-65 (2001).
  3. Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).
  4. Lim, J., Dobson, J. Improved transfection of HUVEC and MEF cells using DNA complexes with magnetic nanoparticles in an oscillating field. J Genet. 91 (2), 223-227 (2012).
  5. Li, M., et al. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21 (11), 1527-1543 (2010).
  6. Patel, M., Yang, S. Advances in reprogramming somatic cells to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6 (3), 367-380 (2010).
  7. Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell luman formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
  8. Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
  9. Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89 (3), 219-229 (2010).
  10. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. J Invest Dermatol. 127 (5), 998-1008 (2007).
  11. Shen, Y. J., et al. Genome-derived cytosolic DNA mediates type I interferon-dependent rejection of B cell lymphoma cells. Cell Rep. 11 (3), 460-473 (2015).
  12. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, A. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. (44), (2010).
  13. Baglole, C. J., et al. Isolation and phenotypic characterization of lung fibroblasts. Methods Mol Med. 117, 115-127 (2005).
  14. Alt, E., et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential. Biol Cell. 103 (4), 197-208 (2011).
  15. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  16. Lander, M. R., Moll, B., Rowe, W. P. A procedure for culture of cells from mouse tail biopsies: brief communication. J Natl Cancer Inst. 60 (2), 477-478 (1978).
  17. Moore, C. B., Allen, I. C. Primary ear fibroblast derivation from mice. Methods Mol Biol. (1031), 65-70 (2013).
  18. Liu, J., et al. Generation of stable pluripotent stem cells from NOD mouse tail-tip fibroblasts. Diabetes. 60 (5), 1393-1398 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

107

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved