الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Summary

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Abstract

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Introduction

فيروس نقص المناعة البشري 1 يغزو (HIV-1) في الدماغ أثناء المرحلة الحادة للعدوى الفيروس، ويصيب منتجة كلا الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المقيمين الدماغ، مما يؤدي إلى تفعيلها - وإطلاق سراح كل المستمدة من المضيفة وسطاء التهابات وذوبان HIV-1 virotoxins مثل تات وgp120 (إعادة النظر في ^1،2). ونتيجة لذلك، يصبح قيام دولة neuroinflammatory المزمنة في الجهاز العصبي المركزي، والتي يعتقد أنها تساهم في التسبب في HIV-1 اضطرابات أسوشيتد العصبي (HAND) ^3-5.

وقد تبين overexpression المزمن من HIV-1 تات أو انترلوكين (IL) -17A داخل الجهاز العصبي المركزي من الفئران أن يؤدي في الاوعية الدموية الدقيقة الفراغ ^6،7. هذا يثير احتمال أن neuroinflammation المزمن يمكن أن تسهم في التسبب في HAND من خلال التأثير على الأوعية الدموية في الدماغ. من أجل مواصلة النظر في هذه المسألة، وقد وضعنا أساليب لقياس struc الأوعية الدموية الدماغيةدرجات.

وتصف هذه الورقة طريقة لتحديد عدد العقد الشعرية، شرائح الشعرية، يعني طول الجزء، يبلغ الطول الإجمالي الجزء، يعني قطرها الشعرية، وإجمالي حجم الشعرية استخدام في التصوير المجراة من الشبكات الشعرية من خلال نافذة القشرية الجمجمة رقيقة (معدلة من وصفه سابقا بروتوكولات) ^8،9، وكذلك خارج الجسم الحي التصوير من أقسام الدماغ، وذلك باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. ويوفر هذا النهج مجتمعة لتحديد الكميات شاملة من المعلمات الأوعية الدموية الدماغية، منذ رقيقة الجمجمة النافذة القشرية في الجسم الحي يسمح للحفاظ على البيئة الدماغية، في حين فيفو السابقين التصوير الشبكات الشعرية في شرائح الدماغ يمكن إعادة بناء كاملة، ثلاثي الأبعاد الشبكات الشعرية - ومن ثم يمكن كميا باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وافقت جامعة جنة جامعة روتشستر على الثروة الحيوانية عن الإجراءات المتبعة في هذه الورقة.

1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية (والفئران)

1. إعداد المنطقة الجراحية مع كل المعدات المطلوبة. تعقيم جميع الأدوات المستخدمة أثناء الإجراء مسبقا باستخدام الايثانول 70٪. اختياريا، واستخدام تعقيم الزجاج حبة أو تعقيم لتعقيم الأدوات.
2. ضع الماوس في غرفة الاستقراء الأيزوفلورين متصلة المرذاذ الأيزوفلورين. تحديد مستويات الأيزوفلورين إلى 4٪ بمعدل 1 لتر / دقيقة.
   ملاحظة: بالنسبة لتجارب ذكرت هنا والفئران مع الدوكسيسيكلين (DOX) محرض HIV-1 تات التحوير مدفوعا نجمية محددة البروتين ييفي الدبقية (GFAP) المروج (HIV تات-TG الفئران) كانت تستخدم ¹⁰ لدراسة تأثير فيروس نقص المناعة البشرية -1 يسببها neuroinflammation على الدماغي بنية الأوعية الدموية، كما هو موضح سابقا ^7،10.
3. بلطف ترجيح كفة غرفة تحريض لمراقبة الماوس &# 39؛ ق المنعكس المقوم. مرة واحدة وقد تم قمعها المنعكس المقوم، تعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 2٪ وإعادة توجيه تدفق الهواء من غرفة تحريض للمخروط الأنف على مقاعد البدلاء الجراحي.
4. بسرعة تحريك الماوس من غرفة تحريض على المياه التي غرست سادة التدفئة. الاستمرار في تطبيق الأيزوفلورين (1.5-2٪) من خلال مخروط الأنف. ضبط التخدير وفقا للتسامح الماوس الفردية تقييمها من خلال معدل التنفس (RR) الرصد.
   ملاحظة: الاكتئاب من RR يمكن التشويش على المعلمات غاز الفسيولوجية تغيير تدفق الدم إلى المخ والتقييم قطر السفينة. محاولة للحفاظ على RR بين 55-65 نفسا في الدقيقة. ويمكن أيضا أن معدل ضربات القلب (HR) أن تستخدم تقييم عمق التخدير. الحفاظ HR بين 300-450 نبضة في الدقيقة لمنع التغييرات الفسيولوجية لقطر السفينة. عادة، سوف التخدير تكون كافية بين 1،5-2،0٪ الأيزوفلورين في 1 لتر / دقيقة للماوس معين.
5. تنفيذ قرصة أخمص القدمين إلى مزيد من التحقق من عمق التخدير. إذا لم يستجب الماوس، بالاتصالاتسينعقد العمليات الجراحية.

2. إعداد الجمجمة نافذة رقيقة الجمجمة

1. تطبيق الاصطناعي هلام المسيل للدموع لعيون الماوس. تماما إزالة الشعر من فروة الرأس من الفأرة باستخدام مقص أو الحلاقة الكهربائية.
2. تعقيم فروة الرأس من خلال تطبيق حل بوفيدون اليود. السماح ليجف. ثم، تحت المجهر ضوء، وإزالة الجلد من فروة الرأس من الفأرة، وفضح تماما العظام الجدارية والعظام الأمامية الذيلية، ووضع العلامات bregma.
3. تطبيق كمية صغيرة من 10٪ من محلول كلوريد الحديديك إلى الجمجمة من أجل تجفيف الأغشية لإزالة سهلة. إزالة الأغشية المجففة مع # 5/45 ملقط عن طريق كشط بلطف الجمجمة.
4. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء حول نافذة headplate. اضغط بلطف headplate ضد الجمجمة من الفأرة، والحفاظ على المنطقة من اهتمام في وسط النافذة. تطبيق قطرة من الاسمنت الأسنان إلى headplate لبلمرة الغراء.
5. تطبيق طبقة رقيقةمن الغراء على طول حافة النافذة headplate لإنشاء خزان الذي عقد المالحة. مرة واحدة قد جفت الغراء، المسمار headplate في تسخير الماوس headplate.
   ملاحظة: تسخير الماوس headplate المستخدمة في هذا الإجراء هو بنية ذات قاعدة معدنية وأعمدة معدنية اثنين. على كل عمود هناك ربيع واحد والجوز الجناح. يتم وضع headplate على رأس النبع، وتشديد الجوز الجناح حتى الرأس وعلى مستوى لا يتحرك.
6. إزالة أي الغراء من نافذة headplate باستخدام مثقاب تعلق على الحفر microtorque وضعت في 6000 دورة في الدقيقة. وقف كل 10-15 ثانية لمنع ارتفاع درجة حرارة الماوس الجمجمة التي يمكن أن تؤدي إلى أضرار هيكلية للسفن.
   1. باستخدام مثقاب الجديد، ضع microtorque الحفر 1.5 ملم أفقيا من خط الوسط (ثلث القطر من النافذة headplate). تبدأ رقيقة الجمجمة حول هذا الموقع في 4000 دورة في الدقيقة. نقل حفر بلطف عبر الجمجمة مع عدم وجود ضغط هبوطي المباشر.
   2. وقف دريللينغ كل 10-15 ثانية لمنع الانهاك الجمجمة الماوس. خلال هذا الوقت، وإزالة الغبار المتراكم الجمجمة باستخدام اسطوانة الهواء المضغوط.
   3. استخدام قطرات من RT المالحة لتبريد الجمجمة لمدة 5-10 ثانية. بلطف إزالة جميع السوائل مع الأنسجة الرخوة لمواصلة الجمجمة رقيق.
7. لترقق النهائي من الجمجمة، ضع كمية صغيرة من المياه المالحة في الخزان headplate وبخفة اكتساح microblade الأسنان فوق منطقة الفائدة حتى السفن الصغيرة هي واضحة للعيان.

3. رصد معلمات الفسيولوجي

1. بمجرد ضعفت الجمجمة تماما، فصل الماوس من حامل ووضعها على ظهرها. الشريط بلطف إلى أسفل ساقيه الخلفيتين لفضح بوضوح الفخذين وسطي.
2. إزالة الشعر على حد سواء الفخذين وسطي مع مقص أو آلة الحلاقة الكهربائية. تطهير موقع الجراحية من خلال تغطية الفخذين مع بوفيدون اليود.
3. قرصة الجلد على الفخذ الأيمن وسطي فوق الوريد الفخذيوالشريان باستخدام ملقط # 5. برفق الجلد صعودا واستخدام المقص لقطع وإزالة الجلد.
   ملاحظة: محجوز الفخذ الأيسر في حالة المضاعفات الجراحية (الشذوذ الأوعية الدموية والأوعية تمزق).
4. تطبيق ما يقرب من 3-5 قطرات من المياه المالحة 0.9٪ إلى موقع الجراحية. وهذا يسمح لأكبر التكبير من السفن، وكذلك الحفاظ على موقع رطب ومنع جفاف السفن. فصل الوريد الفخذي من الشريان عن طريق تشريح بصراحة في حزمة وعائية عصبية الفخذ باستخدام اثنين # 5/45 ملقط.
5. وضع اثنين، 3 قطع سم من الخيط الجراحي تحت الشريان الفخذي حوالي 1 سم عن بعضها البعض. تطور في اتجاه عقارب الساعة خياطة العلوي لإنشاء وقف النزف الوعائي التي من شأنها أن تساعد في منع فقدان الدم بصورة مفرطة خلال القسطرة.
6. إجراء شق صغير في الشريان الفخذي باستخدام مقص الربيع. وضع القسطرة في الشريان من خلال شق والتقدم حتى القسطرة آمن داخل الشريان.
لفك جديلة خياطة العليا (وقف النزف) لتقييم للكشف عن التسربات ووضع القسطرة السليم. تأمين القسطرة في الشريان الفخذي من خلال ربط اثنين من عقدة حول القسطرة داخل الوعاء باستخدام الخيوط الجراحية.
7. ضخ 10 ميكرولتر من الهيبارين (100 وحدة دولية / مل) من خلال القسطرة لمنع تخثر الدم. ثم، جراحيا إغلاق الفخذ الأيمن عن طريق خياطة الجلد مع خياطة 4-0 في نمط توقف بسيط.
8. ضخ 50 ميكرولتر من يوريتان (1.2 ملغ / غ) البريتونى في الربع السفلي الأيمن. أكرر بعد خمس دقائق مع حقنة أخرى 50 ميكرولتر إلى الربع السفلي الأيسر ليصبح المجموع 100 ميكرولتر من يوريتان داخل الصفاق. خفض ببطء مستويات الأيزوفلورين إلى ما يقرب من 0.25٪ في حين إعادة فحص بالتزامن الماوس لعمق التخدير.
   ملاحظة: حافظ على إبرة سطحية داخل التجويف البريتوني على طول جدار البطن الخلفي بحيث لا خرم الأمعاء. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق معسر المستقيمة مو البطنscles بعيدا عن الأحشاء ثم عن طريق الحقن.
9. باستخدام الأنابيب الشعرية، وجمع عينة 40 ميكرولتر من الدم الشرياني من القسطرة. إرفاق القسطرة إلى محول ضغط الدم مزودة محبس رباعية مليئة المالحة ومليئة الهيبارين حقنة.
10. الشريط محول ضغط الدم إلى جهاز جراحي لمنع إزالة غير مقصودة من القسطرة. بدء رصد الضغط الشرياني يعني.
11. إدراج أنبوب الدم الشعرية شغل في منفذ دخول محلل غازات الدم. مرة واحدة وقد تم استخراج كافة الدم، وإزالة أنبوب شعري من ميناء الدخول. سوف تظهر مستويات O _{2 و} CO غاز ₂ الدم على ورقة مطبوعة من محلل غازات الدم.

4. حقن من صبغ نيون

1. قرصة الجلد على الفخذ الأيسر وسطي باستخدام ملقط # 5. برفق الجلد صعودا واستخدام المقص لقطع وإزالة الجلد. إعداد ديكستران مترافق الحمراء التي تنبعث منها رودامين صبغ(70 كيلو دالتون) (10 ملغم / كغم الذائبة في المياه المالحة).
2. تحديد الفخذ vein.Using حقنة 1 مل مع 30 G إبرة المرفقة، رسم الحل أعدت مسبقا من صبغة الفلورسنت المناسب للتصوير على خط 130 ميكرولتر من الحقنة. إزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق رسم الصبغة تماما في حقنة ويسددها بقوة الجدار حقنة.
   1. ثني G 30 إبرة في وحوالي 30 درجة زاوية عن طريق الضغط عليه ضد سطح صلب الجانب شطبة تصل. شغل الإبرة مع الصبغة وتجاهل أي السائل الزائد، وترك العينة 100 ميكرولتر.
3. حقن العينة 100 ميكرولتر من صبغ ببطء في الوريد الفخذي. بعد إزالة الإبرة، وتطبيق ثابت والضغط برفق لموقع الحقن لوقف أي نزيف. السماح للصبغ أن تعمم لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، الوريد الفخذي الأيمن يمكن أن تستخدم بدلا من ذلك لحقن صبغة الفلورسنت لمنع المزيد من فقدان الدم من خلال إنشاء موقع الجراحة أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كانالحيوان ينزف دون حسيب ولا رقيب من موقع الجراحية، وهذا قد يكون دليلا على أن الكثير من الهيبارين أعطيت لطرد القسطرة. إذا لم يكن هناك تخثر في غضون 10-15 دقيقة والفأر لا يزال ينزف، والنظر في إعادة التجربة مع ماوس جديد.
4. إغلاق الفخذ اليسرى عن طريق خياطة الجلد جنبا إلى جنب مع خياطة 4-0، ثم الوجه بعناية الماوس على المعدة لها، ووضعه في تسخير الماوس headplate.

5. في فيفو ثنائي الفوتون التصوير

1. نقل جهاز جراحي لالمجهر ثنائي الفوتون، مع التأكد من الحفاظ على مستويات التخدير مستمرة. وضع كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ إلى الخزان headplate وانخفاض الهدف المجهر بحيث يأتي في اتصال مع المياه المالحة. تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام الهدف-عرض brightfield
2. ضبط الليزر الإثارة ثنائي الفوتون إلى الطول الموجي المناسب لصبغة الفلورسنت. بدء اثنين من الفوتون التصوير باستخدام 25X سbjective.
   لاحظ أنه في هذه التجارب استخدمنا ديكستران مترافق إلى أحمر ينبعث منها صبغة رودامين الذي كان متحمس عند طول موجي 780 نانومتر ل. A 607/36 ممر الموجة مرشح الانبعاثات للكشف عن مضان من الصبغة، و480/20 ممر الموجة مرشح الانبعاثات كانت تستخدم للكشف عن تألق ذاتي الشرايين
3. تحديد موقع الشعرية سرير على شاشة عرض، وتضخيم هذا المجال باستخدام زووم بصري 2. صور اكتساب من الشعيرات الدموية باستخدام برامج التصوير ثنائي الفوتون.
4. بعد اكتمال التصوير، تضحية الماوس بواسطة الخلع عنق الرحم تليها قطع الرأس.

6. التصوير فيفو السابقين ثنائي الفوتون

1. باستخدام مقص غرامة اضافية، وجعل شق في فروة الرأس من العظام الجداريين في العظام الأمامية من الفأرة. تأمين الجلد على جانبي الجمجمة مع إصبع مؤشر والإبهام.
2. وضع مقص غرامة اضافية تحت العظم الجداري وسطي وقطع الجمجمة على طول الدرز السهمي. وقف قطع الجمجمة حوالي 3 ملم بعد bregma علامات.
   ملاحظة: تطبيق الضغط التصاعدي عندما قطع الجمجمة لمنع قطع الدماغ.
3. باستخدام ملقط # 5، فصل الجمجمة من الدماغ وإزالة بعناية أي السحايا من سطح الدماغ. يمكن السحايا المتبقية ممزق بالصدفه الدماغ. وينبغي اتخاذ الحذر الشديد لتجنب ذلك. الشريحة بلطف # 5 ملقط تحت المخ تتقدم ببطء إلى الأمام حتى الدماغ خالية من الجمجمة.
   ملاحظة: هذا الضغط النزولي ينبغي أن تستخدم من أجل تجنب ثقب الدماغ.
4. وضع الدماغ في أداة الدماغ باجتزاء محددة للفئران. غسل الدماغ عن طريق تطبيق قطرات من السائل النخاعي المفتعل حول الدماغ.
5. إزالة 2 مم قسم الاكليلية من الدماغ من bregma 0 إلى bregma -2. وضع قسم الاكليلية على شريحة زجاجية مقعرة تحتوي على السائل المخي الشوكي الاصطناعي مع 0 bregma (معظم جزء من الجمجمة القسم) التي تواجه صعودا. تغطية بلطف SL الدماغكريم مع زلة غطاء زجاجي.
   ملاحظة: تجنب الضغط على الزجاج مرة واحدة وضعت في قسم المخ لأن هذا قد تشوه بنية الأوعية الدموية.
6. نقل الشريحة إلى مرحلة المجهر ووضع كمية صغيرة من المياه المالحة 0.9٪ على زلة غطاء. انخفاض الهدف المجهر حتى يأتي في اتصال مع المياه المالحة. تحديد موقع خط الوسط من الدماغ باستخدام الهدف brightfield.
7. بدء التصوير ثنائي الفوتون وتحديد خط الوسط مرة أخرى باستخدام الهدف 25X. تحقيق هذا من خلال البحث عن الشق الطولي على السطح القشري من قسم الاكليلية. وضع الحافة اليمنى من الشاشة التصوير على خط الوسط وتحريك الشاشة أفقيا المشاهد على ثلاثة إطارات كاملة (حوالي 1.5 مم من خط الوسط).
   لاحظ أنه في هذه التجارب، وكانت المعلمات التصوير مماثلة لتلك المذكورة في المذكرة في الخطوة 5.2.
8. تحديد العمق الذي الشعيرات الدموية هي بالكاد مرئية على الشاشة الرأي. خفض الطائرة من التركيز إضافي 20ميكرون لتحديد الجزء العلوي من ض المكدس.
9. تعيين سمك الصورة ل1 ميكرون. خفض شاشة عرض 100 ميكرون وضبط قوة الليزر مثل جميع أنحاء أن أقل من 1٪ من وحدات البكسل مشبعة.
   ملاحظة: يتم تجميع الصور ض المكدس من سلسلة من 100 500x500x1 التوالي الصور ميكرومتر. وكلما زاد ض المكدس فإن أكثر دقة الحسابات مرحلة ما بعد المعالجة تكون. عموما، محاولة لجمع ض المكدس من 100 ميكرون أو أكبر.
10. اضغط على أيقونة XY كرر يليه رمز XY المجاور. وبمجرد أن ض المكدس كاملة، اضغط على أيقونة سلسلة حررت وحفظ الملف.

7. معالجة البيانات

1. فتح في الجسم الحي الصورة الشعرية في برنامج يماغيج. تعيين بكسل إلى نسبة المسافة على أساس القيم التي تم الحصول عليها من برنامج ثنائي الفوتون يدويا.
   1. حدد * * التوالي أيقونة من القائمة أدوات. رسم خط يمتد من جدار الشعيرات الدموية واحد إلى ممن لهمموقع جدار الشعيرات الدموية، وسجل طول المقدمة من يماغيج.
      لاحظ أنه قد يكون من الضروري لتكبير الصورة من أجل وضع تصور واضح حواف جدران الشعيرات الدموية.
   2. كرر الخطوة 7.1.1 في مواقع مختلفة على طول شعري، فضلا عن الشعيرات الدموية متعددة في الصورة.
2. فتح ملف ض المكدس في البرنامج التحليلي مثل أميرة. حدد رمز الشعيرة محرر من شريط الأدوات التطبيق الفرعية
   1. تعيين سمك المشاهد إلى ما يقرب من 20. نقل المشاهد إما إلى أعلى أو أسفل ض المكدس.
   2. حدد رمز تتبع وتحريك المؤشر فوق الصورة المحملة. مكان العقد على الشعيرات الدموية في المواقع المذكورة في الشكل 2C. سوف تظهر تلقائيا قطاعات بين العقد المجاورة. تتبع الشعيرات الدموية في جميع أنحاء كامل ض المكدس.
      ملاحظة: سوف يكون من الضروري وضع العقد في بين نقطة النهاية ونقطة فرع من أجل تتبع الشعيرات الدموية عبتيoughout ض المكدس.
   3. لإزالة هذه العقد، انقر فوق رمز إزالة المتوسط.
      ملاحظة: هذا يمكن أن تخلق شرائح الخاطئة يحلق التي يجب إزالتها يدويا عن طريق اختيار حلقة باستخدام اختر رمز واحد، ومن ثم اختيار أيقونة إزالة مختارة. إذا استمرت حلقات لتظهر في نفس المنطقة خلال تتبع، فمن المرجح أن وضعت العقد على الشعيرات الدموية المختلفة.
   4. مرة واحدة تعقب اكتمال، حدد رمز الرسم البياني معلومات لفتح جدول بيانات تحتوي على المعلمات الأوعية الدموية استخراج تلقائيا. وهي متاحة على شاشة العرض الرئيسية عدد العقد والقطاعات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يسمح النافذة القشرية رقيقة الجمجمة في الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير من الشعيرات الدموية القشرية (الشكل 1). منطقة مناسبة لصورة تظهر عديدة، الشعيرات الدموية متميزة (الشكل 1A). في نفس مجال الرؤية، ليس هناك الشرايين جدار الخلية ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على تحليل الهياكل الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ في مجموعة واسعة من النماذج التجريبية / الإعدادات. لنجاح هذا الأسلوب، يجب أن يتقن ثلاث خطوات حاسمة. أولا، يجب على نافذة رقيقة الجمجمة لا ضرر الجمجمة أو الدماغ الكامنة. فمن السهل أن ث...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging