JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Abstract

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Introduction

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protocol

1. H2B-PSmOrange مرنا في المختبر النسخ ومرنا تنقية

  1. خطي H2B-PSmOrange تحتوي على pCS2 + البلازميد باستخدام انزيم التقييد نوتي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية باستخدام الحماية المناسبة مثل القفازات ومعطف المختبر لمنع التلوث مرنا والتدهور.
  2. تنقية الحمض النووي خطي باستخدام PCR عدة تنقية أو الفينول كلوروفورم الأساليب القائمة وفقا لبروتوكولات الصانعين.
  3. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي القالب خطي لSP6 مرنا النسخ وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  4. إزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 1.0 U ريبونوكلياز مجانا DNaseI لمدة 10-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. تنظيف مرنا باستخدام الحمض النووي الريبي تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  6. لزيادة نقاء مرنا والتركيز، ويعجل مرنا عن طريق إضافة 6 ميكرولتر خلات الصوديوم (3.0 M، ودرجة الحموضة 5.2) و 150 ميكرولتر 96٪ من الإيثانول. احتضان محل ixed في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل، وتصل إلى 24 ساعة.
  7. جمع مرنا من خلال الدوران الحل في 18.407 x ج لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل السائل و resuspend مرنا في 150 ميكرولتر الايثانول 70٪. خلط وأجهزة الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة إضافية في 4 درجات مئوية. تجاهل السائل، تجفيف بيليه لمدة 5 دقائق على الجليد و resuspend مرنا في 20 عالى النقاء ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا.
  8. تقييم التركيز والنقاء من مرنا من قبل قياس الضوئية من التخفيف 1: مرنا 100 (1 ميكرولتر مرنا في 99 ميكرولتر عالى النقاء ريبونوكلياز المياه مجانا).
  9. للتخزين على المدى القصير، والحفاظ على حل مرنا في -20 درجة مئوية. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على مرنا في -80 درجة مئوية.

2. H2B-PSmOrange مرنا حقن مكروي في الزرد الأجنة

  1. إعداد التزاوج أزواج الليلة قبل الحقن باستخدام TG (foxD3: GFP)؛ TG (FLH: GFP) الأسماك المعدلة وراثيا مزدوجة (أو أي GFP الأسماك المعدلة وراثيا أخرى). ترك الأسماك مفصولة وضع فاصلبينهما للسيطرة على وقت التزاوج.
  2. إزالة فاصل في الصباح الحقن وترك زميله الأسماك لمدة 20 دقيقة.
  3. أثناء التزاوج الوقت، يخفف من H2B-PSmOrange مرنا إلى تركيز النهائي من 130 جزء من الغرام / NL (في ريبونوكلياز المياه مجانا) ونقل 6 ميكرولتر حل الحقن في شعري حقن مكروي باستخدام طرف microloader. تحقق من حجم الحقن مع شريحة زجاجية معايرة. ضبط ضغط الحقن لحقن 2 حل مرنا نيكولا لانغ (260 خريج).
  4. جمع البيض في والبلاستيك طبق بتري معقمة تحتوي على 1X الأجنة (E3) متوسطة.
  5. نقل 20-30 الأجنة إلى طبق الحقن باستخدام ماصة باستور البلاستيك.
  6. حقن 2 مرنا نيكولا لانغ تحتوي على حل في الخلية أو أقل بقليل من الخلايا في صفار البيض في مرحلة خلية واحدة (11).
  7. نقل الأجنة المحقونة في طبق بتري تحتوي على 1X E3 المتوسطة، وإزالة الأجنة عادة وضع غير مخصبة أو لا، وتنمو لهم عند 28 درجة مئوية.
    ملاحظة: حماية ضوء سو الأجنة غير مطلوب في كافة مراحل التجربة.
  8. رفع الأجنة الزرد في 1X E3 المتوسطة وإضافة 0.2 ملي PTU (1-فينيل-2 ثيوريا) بعد المعيدة لمنع تصبغ. تغيير متوسطة مرتين في اليوم الواحد للحد من خطر التلوث الجرثومي.

3. الأجنة تضمين

  1. حدد GFP (الخضراء) وPSmOrange (البرتقالي / الأحمر) الأجنة، معربا عن المشترك باستخدام مجهر مجهر مجهزة مصباح مضان والمرشحات الانبعاثات المناسبة. نقل الأجنة الإيجابية في العقيمة طبق بتري تحتوي على 1X E3 المتوسطة.
  2. الأجنة Dechorionate تحت مجهر تشريحي باستخدام ملقط 12.
  3. نقل جنين واحد في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1.0 مل من قبل تحسنت 1.0٪ انصهار منخفضة الاغاروز (LMA) التي أعدت في الماء عالى النقاء باستخدام ماصة قطع رأس (P200). ملاحظة: قم بتدفئة LMA إلى 80 درجة مئوية ويبرد لمدة 3-5 دقيقة في RT قبل تضمين الجنين.
  4. نقل الأجنة في 150 ميكرولتر LMA إلىغرف ساترة وضبط التوجه الجنين، مثل الجانب الظهري أسفل في تجربة وصفها ليزر متحد البؤر مجهر المسح A1R مقلوب + (أو أي المجهر مناسبة أخرى)، وذلك باستخدام معلومات سرية البلاستيك على ما يرام. عندما LMA هو بلمرة، وملء الغرفة مع أسماك المياه التي تحتوي على 0.2 ملي PTU و 0.02٪ إيثيل 3-أمينوبنزوات methansulfonate (تريكين) للتخدير.
  5. قبل التصوير العينة، وانتظر 15 دقيقة للتأكد من تأثير تريكين. التخدير يمنع حركات الجنين، والتي يمكن رصدها باستخدام مجهر تشريحي مجهزة مع إضاءة brightfield.
    ملاحظة: غرف يمكن إعادة استخدامها مرتين.

4. PSmOrange Photoconversion

  1. وضع العينة تحت المجهر متحد البؤر ومسح العينة لتحديد المنطقة لphotoconvert باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر لتصوير GFP وPSmOrange على التوالي.
    ملاحظة: استخدم مقلوب ليزر متحد البؤر مجهر المسح A1R + على ستا مقلوبجنرال الكتريك TiEcontrolled بواسطة برنامج المجهر التصوير ومجهزة 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر لphotoconversion والتصوير. ومع ذلك، بالتأكيد لا يقتصر التطبيق لهذا المجهر طالما هي خطوط ليزر للتحويل والتصوير المتاحة.
    1. وضع هدف الهواء 20X في مكانه (NA: 0.75، WD: 1.0 مم؛ فوف: 0.64 X 0.64 مم).
    2. استخدام الإعدادات المجهر التالية للكشف عن البروتين PSmOrange قبل photoconversion: 561 الليزر نانومتر، 0.74 ميغاواط قياس في الطائرة التركيز فوق الهدف.
      ملاحظة: هذا يتوافق مع 40٪ على هذا النظام (قياس في الطائرة التركيز هو السبيل الوحيد لتحديد قوة فعالة). ضبط قوة الليزر وفقا لاحتياجات التجريبية كما كفاءة الحقن H2B-PSmOrange يمكن أن تختلف.
    3. إضافة عوامل التكبير لتسليط الضوء على مجال الاهتمام. أعلى تكبير تقليل الوقت الحصول على الصور، وبالتالي الضيائية.
  2. الحصول على كومة ض تغطي هيكلالصورة ذات الاهتمام باستخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر ليزر في وضع تسلسلي (وضع خط 1-> 4). إصلاح خطوة ض بين 1.0 و 2.0 ميكرون. متوسط ​​خط وتردد المسح يمكن استخدامها لتحسين جودة الصورة.
  3. مسح العينة وتحديد منطقة (ROI) أداة الفائدة لتسليط الضوء على المنطقة لphotoconvert. إصلاح العائد على الاستثمار مع منطقة التحفيز. حدد الوحدة النمطية صور التنشيط / التبييض، وتفعيل ليزر 488 نانومتر عن طريق التحقق من مربع منها، وتعيين ليزر 488 نانومتر إلى 80٪ (قوة الليزر 1 ميغاواط قياس في الهدف). ضبط سرعة المسح الضوئي إلى 0.5 ثانية / الإطار.
  4. فتح الأداة المساعدة photoconversion (ND تحفيز) وتحديد الإعدادات photoconversion.
    1. انقر على الأمر "إضافة" لتحديد بروتوكول photoconversion.
    2. ضبط "المرحلة" 1 في "اكتساب / تحفيز" القائمة على "شراء" وتشير إلى أن اكتسب عدد من الصور قبل photoconversion في القائمة "الحلقات".
    3. ضبط "المرحلة" 2 "لسانimulation "وأدخل عدد من الأحداث التحفيز التي يتعين القيام بها.
    4. ضبط "المرحلة" 3 كما هو موضح ل "المرحلة" 1. اختياريا، اضافة الى وجود الانتظار "المرحلة" بعد "المرحلة" 2 عن طريق إدخال وقت للانتظار قبل الجولة الأخيرة من التقاط صور.
    5. مرة واحدة يتم تعيين كافة المعلمات، تطبيق الإعداد التحفيز وتشغيل photoconversion.
      ملاحظة: قوة الليزر، وتواتر المسح الضوئي وعدد التكرارات لكل جولة من photoconversion يمكن أن تختلف وتختلف من جنين إلى الجنين. إعداد لبدء مع هو مبين في الجدول رقم 1.
  5. الحصول على ض المكدس النهائي باستخدام 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر تطبيق الإعدادات على النحو الوارد أعلاه. تعيين ليزر 640 نانومتر لتصور PSmOrange تحويلها باستخدام قوة الليزر عالية (تصل إلى 4.5 ميغاواط).

5. إلغاء التحميل الأجنة من LMA

  1. إزالة الجنين تحتوي على غرفة من المجهر. بعناية إزالة الجنين من ش الاغاروزالغناء ملقط.
  2. نقل الجنين الى بلاستيكية معقمة طبق بتري جديد أو إلى تعقيم 6 جيدا لوحة تحتوي على 1X E3 و 0.2 ملي PTU. احتضان الجنين عند 28 درجة مئوية حتى المرحلة المطلوبة للتنمية.

6. تحليل مصير Photoconverted PSmOrange البروتين معربا عن الخلايا

  1. إعادة تضمين الجنين كما هو موضح تحت نقاط 3.3 و 3.4.
  2. وضع العينة تحت المجهر متحد البؤر ومسح العينة لتحديد الخلايا photoconverted (640 نانومتر) في بنية GFP المعدلة وراثيا من الفائدة (488 نانومتر).
  3. الحصول على كومة ض تغطي الهياكل ذات الاهتمام باستخدام 488 نانومتر، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر في وضع تسلسلي (وضع خط 1-> 4). إصلاح خطوة ض بين 1.0 و 2.0 ميكرون. متوسط ​​خط وتردد المسح يمكن استخدامها لتحسين جودة الصورة.
  4. استخدم إحدى الطرق التالية لتحديد الخلايا التي GFP شارك السريع والبروتين photoconverted.
    1. حسب الطلب التلقائي فيجي صورةJ 3 ماكرو
      1. لف كومة الأصلي باستخدام "GaussianBlur" المساعد (→ عملية → مرشحات → GaussianBlur) وطرح رزمة سلسة من الأصل باستخدام "صورة حاسبة" المساعد (→ عملية → صورة حاسبة). استخدم هذه الخطوة لتصور هياكل الفائدة وتقليل الوقت الحسابية للتحليل.
      2. تطبيق عتبات محددة لقنوات خضراء وبعيدة الحمراء من أجل تسليط الضوء على الخلايا photoconverted (→ صورة → ضبط → عتبة). استخدام أداة "تحليل الجزيئات" للكشف عن المناطق عتبة مع إعداد مناسب (→ تحليل → تحليل الجزيئات).
      3. فتح "صورة حاسبة" المساعد وعرض رويس تداخل في القناة الخضراء وحتى الحمراء في الصفراء (→ عملية → حاسبة صورة).
    2. برامج التصوير المجهر لتقييم بيانات 3D
      1. عرض المكدس في3D باستخدام الخيار إظهار حجم (→ 3D التصور القائمة → مشاهدة حجم عرض). استخدام واجهة رسومية لتحديد قنوات خضراء وحمراء وبعيدا الحمراء، وضبط السطوع والتباين واقتصاص كومة 3D لتسليط الضوء على منطقة photoconverted (الشكل 1).
        ملاحظة: أساليب مماثلة لتحليل هي البيانات المتاحة في معظم البرامج المشتركة لتحليل الصور.

النتائج

ويوضح الشكل 1 مثالا للنظام PSmOrange photoconversion. مجمع الصنوبرية هو هيكل محفوظ في الدماغ البيني الظهرية الفقاريات. كما هو الحال في كثير من الفقاريات الأخرى، ويتكون هذا المجمع من الجهاز الصنوبرية في وسط الدماغ البيني والخلايا صنيبري اليسر...

Discussion

وقد ساعدت الأجنة وراثيا تحمل صحفيين الفلورسنت أساسا لفهم التطور الجنيني. ومع ذلك، لا يزال هناك حاجة ضرورية لالمروجين لتسهيل التصور محدد هياكل معينة. في غيابهم، يعتمد الباحثون على تقنيات مثل photoconversion من البروتينات الفلورية لمعرفة المزيد عن أصل وتطور هيكلها من الفائد...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Purification KitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermanyNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective Nikon GmbH GermanyNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number

References

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
  12. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  13. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

108 photoconversion PSmOrange CLSM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved