باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

Summary

نقدم بروتوكول بشأن كيفية الاستفادة من الإنتاجية العالية التصوير المقطعي البرد الإلكترون لتحديد دقة عالية في هياكل الموقع من الآلات الجزيئية. يسمح البروتوكول كميات كبيرة من البيانات التي سيتم تجهيزها، ويتجنب الاختناقات المشتركة، ويقلل من وقت التوقف عن العمل الموارد، مما يتيح للمستخدم التركيز على المسائل البيولوجية الهامة.

Abstract

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introduction

النوع الثالث أنظمة إفراز (T3SS) هي المحددات الأساسية الفوعة لكثير من الكائنات الممرضة سلبية الغرام. وinjectisome، المعروف أيضا باسم مجمع إبرة، هو آلة T3SS المركزية اللازمة لالنبات مباشرة من البروتينات المستجيب من البكتيريا في الخلايا المضيفة حقيقية النواة ^{1 و 2.} ويضم injectisome إبرة خارج الخلية، وهي هيئة القاعدية، ومجمع حشوية المعروفة أيضا كما المجمع فرز ^3. وتوضيح دراسات سابقة هياكل 3-D من injectisomes تنقيته من السالمونيلا والشيجيلا، جنبا إلى جنب مع الهياكل الذرية للبروتينات الجسم القاعدية الكبرى ^{4، 5.} آخر في هياكل الموقع من injectisomes من السالمونيلا والشيجلا، واليرسنية كشفت عنها البرد ET ^{6 7.} ومع ذلك، فإن مجمع حشوية، ضروري لاختيار المستجيب والتجمع إبرة، لم تصور في تلك الهياكل.

البرد ET هو موسر تقنية مناسبة لتصوير الآلات الجزيئية في قرار نانومتر ضمن سياق الخلوي الأصلي لها (في الموقع). ومع ذلك، فإن القرار يمكن تحقيقه عن طريق البرد ET محدودة بسبب عينة سماكة. للتغلب على العائق، ونحن تصوير injectisomes سليمة في الشيجلا سلالة الفلكسنرية ضراوة التي تم تعديلها وراثيا لإنتاج minicells رقيقة بما يكفي لالبرد ET. قيود أخرى من البرد ET هو حساسية من العينة للإشعاع الناجم عن شعاع الالكترون، الذي يدمر بسرعة كبيرة المعلومات ذات الدقة العالية في العينة. ونتيجة لذلك، يتم استخدام جرعات منخفضة للغاية بالنسبة الفردية الميل الصور بحيث جرعة مناسبة يمكن توزيعها بين الميل سلسلة كاملة. هذا يقلل كثيرا من نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في إعادة الإعمار النهائي، مما يجعل من الصعب التفريق بين السمات الهيكلية للموضوع من كمية كبيرة من الضوضاء في مقطعية ويحد القرار الذي يمكن تحقيقه من خلال cryo- ET. Conventiمعالجة الصور اونال مثل فورييه والمرشحات في الفضاء الحقيقي وكذلك أخذ العينات باستمرار يمكن استخدامها لزيادة النقيض من ذلك، ولكن على حساب تصفية الكثير من المعلومات ذات الدقة العالية. في الآونة الأخيرة، جعلت مقطعية الفرعي المتوسط ​​من الممكن زيادة كبيرة في SNR وبعد ذلك القرار النهائي في بعض الحالات إلى مستويات نانومتر الفرعية ^{8، 9.} يتم إجراء تحليل أكثر تفصيلا من المجمعات ممكن عن طريق استخراج حسابيا الآلاف من tomograms فرعية تتضمن مجالات الاهتمام من tomograms الأصلية ومن ثم مواءمة وحساب متوسط ​​tomograms الفرعية لتحديد الهياكل المعقدة في الموقع الطبيعي مع ارتفاع SNR ودقة أعلى. هذه الأساليب يمكن أن تكون متكاملة مع نهج الجينية لتقديم رؤى أكبر في المجالس الجزيئات والتشكل ديناميكية في سياق الخلوي الأصلي.

بشكل عام، عشرات أو حتى مئات الآلاف tomograms دون حاجة إلى أن متوسط ​​من أجل تحديد عاليةالهياكل، قرار في الموقع. الحصول على عدد كاف من الميل سلسلة اللازمة لإنتاج هذا العدد الكبير من tomograms الفرعية سرعان ما يصبح عنق الزجاجة. وغالبا ما تؤثر على الناتج الميل السلسلة التي يسببها شعاع التحول، مرحلة رد الفعل، وكذلك التكبير، والتناوب وعيوب الانحراف، والتي يجب حلها لجعل سلسلة الميل إلى محاذاة قبل إعادة الإعمار. وعادة ما يتم محاذاة سلسلة الميل عن طريق تتبع الذهب علامات إيمانية، التي يتم اختيارها بشكل تقليدي يدويا من خلال التفتيش على سلسلة الميل، مما تسبب في اختناق بعد آخر. وقد وضعت العديد من حزم البرمجيات الآلي لاكتساب الميل سلسلة من المجاهر الإلكترونية الكمبيوتر التي تسيطر عليها ^{10، 11، 12،} والميل سلسلة المواءمة وإعادة إعمار ^{13 و 14 و} مقطعية الفرعي في المتوسط ^​​15-18. كما التعامل مع هذه الحزم عمليات منفصلة في سير العمل من البرد ET، يصبح من المرغوب فيه لبناء مستوى أعلى من التجريد إلى عملية SYSTEMAتبسيط tically مخطط كامل في خط أنابيب واحد. لذلك، قمنا بتطوير مكتبة المجمع البرمجيات "tomoauto" تهدف إلى تنظيم عدد من هذه الحزم إلى وحدة شبه الآلي واحدة، مما يسمح للتشغيل مستخدم بسيطة مع الحفاظ على التكوين الكامل لكل مكون بطريقة مركزية. المكتبة هي مصدر مفتوح، موثقة جيدا، وضعت بشكل مستمر ومتاح مجانا للاستخدام، والتنمية مصممة أو مزيد من التكامل وذلك عن طريق الانترنت مصدر بعيد كود مستودع (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).

وقد استخدم هذا الخط البرد ET الإنتاجية العالية لتصور injectisomes سليمة في S. minicells الفلكسنرية. تم توليد ما مجموعه 1917 tomograms باستخدام هذا الأسلوب، وكشف عن قرار عالية هيكل الموقع من الجهاز سليمة في بما في ذلك منصة الفرز حشوية يحددها مقطعية الفرعي في المتوسط ^​​19. جنبا إلى جنب مع النمذجة الجزيئية من النوع البري ومآلات utant، ويوفر خط الانابيب الإنتاجية العالية لدينا وسيلة جديدة لفهم بنية ووظيفة injectisome سليمة في سياق الخلوي الأصلي.

Protocol

1. إعداد خلية صغروية

1. لجعل S. minicells الفلكسنرية، وتحويل 1 ميكرولتر من البلازميد pBS58، والذي يعبر بشكل جوهري الجينات انقسام الخلايا القولونية ftsQ، ftsA، وftsZ من نسخ منخفضة السبيكتينوميسين مقاومة البلازميد إلى 5 ميكرولتر electrocompetent إستربتومايسين مقاومة المصلي 5A (M90T-SM) الخلايا بواسطة الصعق الكهربائي عند 2.5 كيلو فولت لمدة 5 ميللي ثانية في 1 مم cuvettes.
2. عينات مخزن خلية صغروية في -80 ° C في 15٪ الجلسرين في 1.5 مل microtube المبردة. عندما تصبح جاهزة للاستخدام، كشط ما يقرب من 5 ميكرولتر من الخلايا من microtube unthawed باستخدام طرف ماصة وتعليق الخلايا في 4 مل مرق الصويا زيتية مع السبيكتينوميسين تضاف إلى 100 ميكروغرام / مل تركيز. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
3. ماصة 2 مل من ثقافة من 1.2 إلى 200 مل مرق الصويا زيتية مع السبيكتينوميسين أضاف مرة أخرى إلى 100 ميكروغرام / مل تركيز. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية إلى مرحلة سجل في وقت متأخر.
4. لإثراء minicells، الطرد المركزي200 مل من ثقافة من 1.3 في 1000 x ج لمدة 5 دقائق. صب بعناية الكسر طاف في أنبوب الطرد المركزي الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة. صب بعناية قبالة والتخلص من جزء طاف، وتخلط بلطف بيليه مع السائل المتبقية باستخدام طرف ماصة ونقل ما يقرب من 100 ميكرولتر من خليط بيليه إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.

2. EM الشبكة التحضير

1. وضع R2 / 2 هولي الجانب فيلم الكربون 200 شبكة الشبكة النحاسية الكربون حتى على شريحة زجاجية.
   ملاحظة: يتم اختيار R2 / 2-200 شبكة الشبكة لزيادة عدد الميل سلسلة التي يمكن تعيينها للحصول في ساحة الشبكة واحد في حين لا تزال تدعم العينة ووضع حافة فيلم الكربون في مجال الكاميرا في التكبير المطلوب. شبكات سلكية أدق وأصغر الأفلام الكربون هولي مثل R1.2 / 1.3 400 شبكة يمكن استخدامها للحصول على عينات تصويرها في أعلى التكبير. أكبر الأفلام الكربون هولي مثل R3.5 / 1 200 شبكة يمكن استخدامهاد لعينات تصوير في انخفاض التكبير أو إذا كان يجب أن لا يحتوي على مجهرية حافة الكربون وأفلام الكربون هولي مع تباعد أكبر مثل R1 / 4 200 شبكة يمكن استخدامها للمساعدة في محاذاة المرحلة مجال الاهتمام وحماية المناطق من الإفراط في التعرض في التركيز وتتبع الروتين.
2. وضع الشريحة على منصة في جهاز التفريغ توهج.
   ملاحظة: نحن نستخدم جهاز في المنزل الذي تم تشكيله أنود ومنصة في مجفف فراغ و هو مدعوم من مولد عالية التردد. بعد خلق فراغ، ونعلق مولد التحقيق عالية التردد إلى القطب الموجب والطاقة على تحقيق لمدة 1 دقيقة لتوهج أداء الشبكة. الوقت اللازم لتوهج التفريغ الشبكة يمكن أن تتراوح من بضع ثوان إلى دقيقة. متفاوتة في وقت التفريغ توهج يمكن أن تستخدم لتشخيص مشاكل مع تركيز العينة والشبكات التي تظهر الجافة مع عدم وجود الجليد الزجاجي.
3. إزالة الشبكة مع مجموعة من الملقط، وقفل ملقط مغلقة مع ب المرنةو.
4. إضافة 100 ميكرولتر من 10 نانومتر حل الذهب الغروية إلى أنبوب microcentrifuge مع minicells أعد في 1.4 وتخلط بواسطة عبها بلطف الأنبوب مع إصبع. مع الجديد مكان ماصة 4 ميكرولتر من الخليط على شبكة أعد في 2.2.
   ملاحظة: الذهب الغروية هو متاح في مجموعة متنوعة من الأحجام وينبغي الحرص على أن حجم الذهب أكبر من 5 بكسل نظرا لحجم بكسل من الميكروسكوب بحيث تتم معالجتها في التكبير المكتسبة، في حين لا يجري كبيرة جدا لملامح غامضة من الفائدة.
5. إعداد جهاز الهبوط للتجمد. ملء حاوية تجميد الخارجي مع النيتروجين السائل ثم ملء الغرفة الداخلية مع الإيثان السائل. نعلق ملقط مع الشبكة لقضيب المكبس وقفل قضيب المكبس في موقف المطروحة.
   ملاحظة: انظر ايانكو وآخرون ²⁰ لبروتوكول اصفا استخدام جهاز الهبوط للتجمد التجاري.
6. وصمة عار على الشبكة عن طريق لمس بعناية قطعة من ورق الترشيح لركان قطرة من العينة حتى الغضروف المفصلي بين الشبكة ورقة الترشيح يفصل وفتل على ورقة الترشيح يتوقف، ثم الإفراج فورا عن قضيب المكبس، وتجميد الشبكة. إزالة بعناية ملقط من قضيب المكبس ووضع الشبكة إلى صاحب الشبكة.
7. إعداد محطة نقل البرد EM عن طريق ملء منطقة التحميل وامتصاص حاوية مضخة مع النيتروجين السائل. مرة واحدة في منطقة التحميل هي في السائل درجة حرارة المكان النيتروجين صاحب الشبكة وخرطوشة العينة المجهر في منطقة التحميل.
8. إزالة بعناية حلقة القفل، وهو إما حلقة القفل مترابطة صغيرة على المجاهر Polara السابقة أو مقطع حلقة على غرار C على نماذج لاحقة؛ وضع الشبكة EM في خرطوشة باستخدام ملقط ثم أعد بلطف حلقة القفل مرة أخرى إلى خرطوشة تأمين الشبكة.
9. إزالة حامل العينة متعددة من المجهر ونعلق عليه إلى محطة النقل. وضع خرطوشة العينة في حامل باستخدام ملقط خرطوشة لد سحب حامل من منطقة التحميل ونقل صاحب العينة متعددة إلى المجهر.
   ملاحظة: انظر تشن وآخرون ²¹ لبروتوكول البصرية تفاصيل 2،1-2،9.

3. ارتفاع الإنتاجية مجموعة الآلي إمالة سلسلة

1. مجموعة من خرائط منخفضة التكبير
   1. فتح نافذة المستكشف الجديد عن طريق النقر على 'فتح' في القائمة 'المستكشف' من SerialEM ¹⁰ (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
   2. البحث الساحات الشبكة التي تحتوي على ظروف التصوير مقبولة (أي الجليد الرقيق، لا تلوث، موضع اهتمام) باستخدام الشاشة الفلورية في انخفاض التكبير (~ 2،300X لعينة خلية صغروية).
      ملاحظة: [اختياري: هذه الخطوة يمكن أن يكون آليا مع SerialEM من قبل المونتاج الشبكة بأكملها، لكن يمكن أن يكون أسرع لمجرد اختيار عدد قليل من المناطق يدويا]
   3. ضبط المرحلة لارتفاع eucentric عن طريق إمالة صاحب العينة إلى 50 درجة ثم ضبطض الارتفاع حتى الترجمة س ص المرحلة هو الحد الأدنى بين وجهات النظر مائلة وغير المعنون.
   4. الانتقال إلى وسط الميدان الشبكة وانقر على "أضف المرحلة نقاط البيع 'في نافذة المستكشف لتخزين موقف المرحلة الحالية.
   5. مواصلة الخطوات 3.1.1-4 أعلاه حتى تم حفظها جميع المناصب الساحات شبكة مرحلة مقبولة.
   6. فتح ملف المونتاج MRC جديد عن طريق النقر على 'مونتاج جديد "في قائمة" ملف ". في إعداد المونتاج الحوار الذي يفتح، حدد عدد من القطع في X و Y التي ستكتسب مربع شبكة بأكمله (على سبيل المثال، 10 × 10 لمعيار شبكة 200 شبكة). استخدام binning عالية مثل 8 وحدد 'نقل المرحلة بدلا من تحويل صورة "و" تجاوز الارتباط تستخدم لمحاذاة قطع "أزرار الراديو.
   7. في نافذة المستكشف انقر موقف المرحلة الأولى وتعيينه ليتم الحصول عليها عن طريق التحقق من "اكتساب" مربع. كرر ذلك لكل موقف المرحلة في نافذة المستكشف.
   8. فتح المستكشف الحصول الحوار عن طريق النقر على 'الحصول على النقاط "في قائمة" المستكشف ". تحقق من 'اكتساب صورة خريطة' و 'eucentricity الخام "مربع وتأكد من أن جميع خانات أخرى دون رادع. انقر على "متابعة" لجمع المونتاج في كل موقف المرحلة.
2. اكتساب الميل سلسلة
   1. في نافذة المستكشف اختيار واحد من الخرائط المكتسبة وانقر على زر "تحميل خريطة '.
   2. في نافذة المستكشف فوق "إضافة نقاط 'زر وتحديد نقاط في الخريطة التي في الحصول على سلسلة الميل. ثم انقر على 'أوقفوا إضافة نقاط' زر. كرر لكل خريطة جمعها.
   3. في القائمة كاميرا اختر 'المعلمات' وتحديد معايير لطرق التركيز، الابتدائية، وسجل. [اختياري: يمكن تحديد البيانات في المعلمات من أجل وضع سجل للجرعة مجزأة]
   4. تحديد نقطة في نافذة المستكشف والتحقق من "سلسلة الميل9؛ خانة الاختيار. في إمالة سلسلة نافذة الحوار إعداد يفتح حدد المعلمات المطلوبة لجمع الميل سلسلة. أكرر لبقية النقاط المحددة في إطار المستكشف، ولكن لا تقم بتحديد الخرائط.
   5. في القائمة المستكشف مرة أخرى حدد "الحصول على نقاط". في المستكشف الحصول الحوار اختيار "إعادة ترتيب للبند، ضبط تلقائي للصورة" و "eucentricity الخام 'كما المهام الأولية، وحدد" الحصول سلسلة الميل "باعتبارها المهمة الرئيسية، وحدد" صمامات العمود إغلاق في نهاية "لإغلاق العمود عند كل من النقاط تم جمعها. على الشروع في سلسلة الميل سيتم جمعها في كل نقطة في كل خريطة.

4. إنتاجية عالية التجهيز الآلي إمالة سلسلة والإعمار عن طريق Tomoauto

1. تصحيح الحركة شعاع التي يسببها في البيانات الجرعة مجزأة [اختياري]
   ملاحظة: Tomoauto يستخدم MOTIONCORR ²² (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.htمل) لإزالة الحركة التي يسببها شعاع من الميكروسكوب-مجزأة الجرعة. NOTIONCORR يجب تثبيت ¹⁶ على النظام.
   1. مع إمالة سلسلة الأصلي، سجل الناتج من SerialEM ¹⁰ والفردية الصور جرعة مجزأة كل في دليل العمل الحالي، في محطة تنفيذ الأمر:
      dose_fractioned_to_stack
      هو اسم سلسلة الميل إلى معالجة.
2. المواءمة وإعادة الإعمار الخيمة سلسلة
   ملاحظة: Tomoauto افتراضيا يستخدم IMOD ¹³ (http://bio3d.colorado.edu/imod/) للتعامل مع إمالة سلسلة الآلي نموذج الجيل الإيماني، والمحاذاة، وتحديد وظيفة نقل المقابل (CTF)، CTF-تصحيح ^23، و إعادة الإعمار. بدلا من المستخدمين لديها الخيار في tomoauto استخدام RAPTOR ²⁴ (المدرجة في IMOD) لتوليد نموذج إيمانية الآلي، CTFFIND4 ²⁵ (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) لتحديد CTF، وtomo3d ²⁶ (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) لإعادة البناء أو في أي تركيبة من حزم البرامج التي ترتيب. يتم التعامل مع هذا التكوين وكذلك المعلمات المتوفرة في كل حزمة من قبل ملف التكوين العمومي التي يمكن أن تعدل لتناسب القيم الأكثر شيوعا في المختبر بينما ملفات التكوين المحلية ويمكن أيضا أن تنشأ لمعلمات التفصيل تستخدم لعينة محددة، وجمع تعيين أو الفردية الميل سلسلة. يجب تثبيت كل الحزم التي ترغب في استخدامها على النظام.
   1. مع سلسلة الميل في دليل العمل الحالي، في محطة تنفيذ الأمر
      tomoauto --CTF --mode = محاذاة
      هو سلسلة الميل لتتم معالجتها و هو دياميثالثا من علامات إيمانية في نانومتر. وهذا الأمر محاذاة وتقدير CTF للسلسلة الميل تلقائيا. فمن الممكن لتخطي معالجة CTF عن طريق إزالة الخيار --CTF من الأمر.
   2. تفقد الانحياز الميل سلسلة بصريا عن أي أخطاء واضحة في معالجة تشكيلة وتفقد CTF يقدر نفذ الأوامر:
      3dmod <اسم الملف> .ali
      submfg <اسم الملف> _ctfplotter.com
      على التوالي، حيث هو اسم سلسلة الميل دون احقة. أيضا التحقق من إخراج الأمر tomoauto لمعرفة متوسط ​​الخطأ المتبقية الناتجة عن المحاذاة، وهو الإحصائية الكمية من نوعية المحاذاة.
   3. نظرا لمحاذاة مقبولة المضي قدما المعالجة قبل تنفيذ الأمر:
      tomoauل--CTF --mode = إعادة بناء
      مع استبدال المستخدم نفسه كما في 4.2.1. وهذا الأمر تصحيح CTF، محو علامات إيمانية من سلسلة الميل ويحسب اعادة الاعمار. مرة أخرى معالجة تمويل الإرهاب يمكن تخطي كما هو الحال في 4.2.1.
   4. [اختياري] لتخطي الخطوة التفتيش البصرية وأتمتة كامل التجهيز والتعمير تنفيذ الأمر
      tomoauto --CTF
   5. [اختياري] لاستخدام التكوين المحلي معين، راجع وثائق tomoauto حول كيفية إنشاء ملف التكوين المحلي، ومن ثم تنفيذ الأمر
      tomoauto [خيارات] -L
      حيث هو اسم أسيوط المحليملف iguration.

5. الفرعية مقطعية المتوسطات

ملاحظة: نحن نستخدم حزمة I3 ¹⁵ (http://www.electrontomography.org/) لمعالجة مقطعية الفرعي التجارب المتوسط، ومع ذلك وصف بروتوكول ينطبق عموما على معظم المتاحة-مقطعية الفرعية تجارب عملية البرمجيات المتوسط ​​packages16to شبه مقطعية المتوسط، ومع ذلك وصف بروتوكول ينطبق عموما على معظم المتاحة-مقطعية دون حزم البرمجيات المتوسط ^​​16-18.

1. مع مقطعية أعيد بناؤها في دليل العمل الحالي فتح مقطعية لالجسيمات قطف قبل تنفيذ الأمر:
   tomopick <اسم الملف> .rec
   حيث هو كما في 4.2.2. في النافذة التي تفتح استخدام زر الماوس الأيسر للنقر على لأول مرة في الجسم القاعدية ثم رأس إبرة لتحديد injectisome واستخدام السهم صعودا وهبوطا مفاتيح لحثالة من خلال شرائح من tomograم. تحديد كافة injectisomes واضحة في هذه الطريقة. هذا يخزن الإحداثيات في ملف نصي تحديد المحور الطويل للهيكل، وكذلك تقدير اثنين من يولر ثلاث زوايا واصفا التوجه للهيكل.
2. استخراج حسابيا 400 ³ مكعبات فوكسل من مقطعية تركزت في منتصف المحور الطويل محددة قبل تنفيذ الأمر:
   مقطع تغيير حجم -cx <س> -cy <ص> -cz -ix 400 -iy 400 -iz 400
   <اسم الملف> .rec <اسم الملف> _001.mrc
   حيث ، <ص>، هي إحداثيات النقطة الوسطى لهيكل و<اسم> هو كما في 4.2.2. حجم المكعب استخراج يجب أن تختلف من هيكل والتكبير المستخدمة، ويجب أن تكون كبيرة بما يكفي لإحاطة وافية هيكل الفائدة، والتي لهذه العينة هو 400 ³ voxels.
3. أسفل العينة (بن) في مقطعية الفرعي بعامل أربعة للحد من الوقت اللازم للحساب لمحاذاة الأولية قبل تنفيذ الأمر:
   binvol -b 4 <اسم الملف> _001.mrc <اسم الملف> _001.bin4.mrc
   حيث هو كما في 5.2.
4. تطبيق يولر تحديد زوايا لtomograms الفرعية وحساب المعدل العالمي لإنتاج قالب الأولي قبل تنفيذ الأمر.
   I3totsum.sh
5. محاذاة وتصنيف عينات أسفل tomograms الفرعية باستخدام قناع تصنيف ثنائي المنطقة حشوية. أداء مقطعية الفرعي المتوسط ​​في فورييه الفضاء للحد من القطع الأثرية إسفين في عداد المفقودين مميزة من التصوير المقطعي. لbinning 4 البيانات، يرجى استخدام SAMPFACT = "4 4 4".
   i3mramsacls.sh
6. كرر الخطوة 5.5 باستخدام tomograms الفرعية عينات أسفل بمعامل اثنين (SAMPFACT = &# 34؛ 2 2 2 ") ومرة ​​أخرى مع البيانات الأصلية (SAMPFACT =" 1 1 1 ").
   i3mramsacls.sh

النتائج

عينات من minicells S. تم جمع الفلكسنرية ومعالجتها كما أظهرت في التخطيطي الشكل 1 باستخدام tomoauto التالية خط أنابيب المفصل في الشكل 2. تم جمع الميل سلسلة باستخدام SerialEM ^10، والذي يسمح للالإنتاجية العالية اكتساب المي?...

Discussion

طريقة الإنتاجية العالية وصفها هنا مكننا من معالجة 1917 البرد الميل سلسلة وتنتج أكثر من 4500 tomograms الفرعية للS. سليمة الفلكسنرية injectisome ^19. وأدت البيانات التي تم جمعها على توصيف مفصل للinjectisome في الموقع، بما في ذلك حشوية الفرز المعقدة. وقد استخدمت هذ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org