JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

Abstract

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Introduction

Macro autophagy is an intracellular process that involves the catabolic degradation of both damaged and dysfunctional cellular components, such as organelles and proteins for the purpose of either recycling or energy production. To initiate this metabolic process, the cell engulfs the damaged cellular components into a double-membrane structure, known as an autophagosome, which fuses with a lysosome and its content is degraded and recycled 1,2. There are two major types of autophagy, the non-selective and selective. The non-selective autophagy process occurs when the cell is under nutrient deprivation conditions and needs to scavenge for both essential nutrients and energy. However, selective autophagy occurs to mediate the removal of both dysfunctional/damaged organelles and proteins that otherwise could be toxic. One of the most studied selective autophagy process is the removal of mitochondria, termed mitophagy 1,3-5.

Mitochondria are the central organelles for cell metabolism and the primary source of adenosine triphosphate (ATP) via oxidative phosphorylation through the electron transport chain, fatty acid oxidation, and tricarboxylic acid (TCA) cycle. Moreover, mitochondria regulate reactive oxygen species (ROS) production and release proteins that participate in cell death pathways 6-8.

PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1) and Parkin RBR E3 ubiquitin ligase (Parkin) are the key proteins implicated in the mitophagy process. Parkin can protect against cell death by keeping the cell healthy through mitochondrial quality control9. Upon the loss of mitochondrial membrane potential, cytosolic Parkin is recruited to the mitochondria by PINK1. This recruitment triggers the sequential events of mitophagy 10. There is a broad range of evidence that mitophagy is a fundamental mitochondria quality control process and abnormalities in this process drive disease 7. For instance, autosomal recessive Parkinson's disease has been associated with mutations in the genes that encode for Parkin and PINK1 (PARK2 and PINK1, respectively) 11. The quality control of mitochondrial health is essential for the removal of mitochondria that contribute to the accumulation of ROS12. Excessive presence of intracellular ROS can lead to damage of both nuclear and mitochondrial DNA (DNA and mt DNA, respectively).

Herein, we show a time-lapse video microscopy approach to follow the aggregation of Parkin after the induction of Parkin-mediated mitophagy in immortalized mouse embryonic fibroblasts via in vitro administration of carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP), an uncoupling agent. FCCP disrupts ATP synthesis by short circuiting protons across the outer mitochondria membrane and hence uncoupling oxidative phosphorylation from the electron transport chain 13. Triggering the depolarization of the mitochondrial membrane leads to the disruption of mitochondria and selective Parkin-dependent removal. Therefore, transfecting the cells of interest with an expression vector encoding Parkin fused with a fluorescent marker (enhanced yellow fluorescent protein, EYFP) can be used as a fluorescent tag to follow the recruitment of Parkin during the mitophagic process. In order to visualize the mitochondria, we co-transfected pDsRed2-Mito, which encodes red fluorescent protein (DsRed2) that contains a mitochondrial targeting sequence of cytochrome c oxidase subunit VIII (Mito). pDsRed2-Mito is designed for fluorescent labeling of mitochondria14. The time required for Parkin translocation into the mitochondrial membrane can be measured and gives an indirect measure of cellular health. For example, we can say that if a cell line knocked-out for a particular gene of interest shows either a faster or slower recruitment of Parkin after the induction of mitophagy by FCCP, that gene product would be a key player in order to keep the metabolic rates of the cell at the physiological status and prevent the development of diseases. Therefore, the time-lapse video microscopy provides a very powerful tool for both basic and clinical research applications in following the dynamic of labeled proteins during their molecular processes and understanding how these processes are affected during a pathological condition.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. Electroporation للمن الخلايا الليفية مع كلا التعبير ناقلات EYFP-باركين وpDsRed2-ميتو

  1. تنمو الماوس خلدت الخلايا الليفية الجنينية في 10 سنتيمتر لوحة الأنسجة الثقافة باستخدام DMEM (Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر) متوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
    1. في 80٪ confluency الخلية، تجاهل المتوسطة DMEM كاملة عن طريق الشفط معقمة وإضافة 10 مل من 1X العقيمة حل العازلة الفوسفات (PBS) (80 غرام من كلوريد الصوديوم، 2.0 غرام من بوكل، 14.4 غراما من نا 2 هبو 4، 2.4 غرام من KH 2 ص 4 و 1 لتر المقطر H 2 O، PH: 7.4).
    2. تجاهل برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA 0.25٪. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (2-3 دقيقة). إضافة 4 مل من المتوسط ​​DMEM كاملة، resuspend الخلايا وإخراج 10 _6؛ لتر من تعليق خلية لمدة العد عدادة الكريات.
      ملاحظة: تم تصميم عدادة الكريات حتى أن عدد الخلايا في مجموعة واحدة من 16 الساحات الزاوية يساوي عدد الخلايا × 10 4 / مل.
  2. البذور 1 × 10 6 الخلايا على 10 سم أطباق زراعة الأنسجة 24 ساعة السابقة لعملية Electroporation لل.
  3. تجاهل المتوسطة DMEM كاملة عن طريق الشفط معقمة وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تجاهل برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA 0.25٪. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (2-3 دقيقة). إضافة 4 مل من المتوسط ​​DMEM كاملة وresuspend الخلايا في أنبوب 15 مل.
  4. تدور الخلايا في أسفل 250 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية). تجاهل طاف بواسطة الشفط المعقم و resuspend بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. تدور الخلايا في أسفل 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل طاف بواسطة الشفط العقيمة، وإضافة 100 ميكرولتر سو مزيج حل ل electroporation (82 ميكرولتر من Electroporation للحلول V + 18 ميكرولتر من حل التكميلي 1) إلى الخلية بيليه و resuspend بلطف بيليه بواسطة pipetting (لمزيد من التفاصيل يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم). إضافة 2 ميكروغرام من EYFP-باركين (الإثارة / الانبعاثات 514/527) و 1 ميكروغرام pDsRed2-ميتو (الإثارة / الانبعاثات 565/620) في تعليق خلية.
  6. نقل الحل لكفيت معقمة باستخدام باستور المتاح (ترد على حد سواء الأدوات مع عدة) وelectroporate باستخدام برنامج محدد سلفا المعاهد الوطنية للصحة / 3T3 U-030 (نبض واحد، والجهد 200 V، سعة 960 μF، الساعة نبض 20 ميلي ثانية ، عدد النبض: 1).
  7. مباشرة بعد Electroporation لل، إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط ​​قبل تحسنت الطازجة DMEM كاملة والبذور الخلية على 6 سم لوحة نسيج الثقافة الحية التصوير الصف واحتضان لهم في جو مرطب يحتوي على 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

2. الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر

    تعيين درجة حرارة الغرفة المجهر عند 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
  1. في هذه المرحلة، وإعداد وسيلة محددة التصوير الحي للمضي قدما في البروتوكول التجريبي. إعداد المتوسطة التصوير الحي على النحو التالي؛ مزيج DMEM خالية من الفينول تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 مليمول / لتر L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 ملغ / مل الستربتومايسين. قبل تدفئة المتوسطة التصوير الحي عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. تجاهل المتوسطة من الخلايا electroporated عن طريق الشفط المعقم وإضافة 1 مل من قبل حرارة متوسطة التصوير الحي، وذلك باستخدام الماصة P1000 واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. خلال الفترة وحة الحضانة، وتدفق 5٪ CO 2 في غرفة المجهر بالفعل عند درجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية.
  4. وضع لوحة مع الخلايا electroporated إلى غرفة المجهر تجنب الحركات الكبرى أو اهتزازات.
  5. باستخدام واجهة البرنامج، تعيين المجهر من أجل كشف كل fluoreإشارات مسرح الحادث من البروتينات الانصهار المشفرة بواسطة ناقلات-transfected المشترك، EYFP-باركين (المدى الإثارة 495-510 نانومتر، ومجموعة الانبعاثات 520-550 نانومتر والأخضر) وpDsRed2-ميتو (الإثارة القصوى 558 نانومتر، والانبعاثات الحد الأقصى 583 نانومتر، أحمر).
    1. فتح الوقت الفاصل بين برامج الفيديو المجهر. في القائمة العلوية تحديد FITC لEYFP-باركين والرودامين لpDsRed2-ميتو. في القائمة العلوية اختر التكبير (20X).
  6. باستخدام واجهة البرنامج، والبحث عن خلية واحدة التعبير عن كل ناقلات-transfected المشترك وتسجيل موقف. كرر هذه الخطوة حتى يتم جمع ما لا يقل عن 10 خلايا لكل حالة تجريبية (المجموعة التجريبية).
    1. اختر من القائمة "تطبيقات" وانقر على موضوع اكتساب الأبعاد. في موضوع النوافذ اكتساب الأبعاد تحديد المعايير اللازمة، مثل عدد من عمليات الاستحواذ، لفترة من الزمن بين كل الاقتناء وموضع الخلية المسجلة. انقر على "اكتساب"لبدء عملية الاستحواذ.
  7. بدء اكتساب القاعدية كل من EYFP-باركين وDsRed2-ميتو إشارة الفلورسنت جمع الصور في كل 5 دقائق لفترة الإجمالي لمدة 15 دقيقة.
  8. إعداد قبل تحسنت المتوسطة التصوير الحي مع تركيز FCCP أعلى مرتين من تركيز العمل النهائية (0،1 حتي 10 ميكرومتر، نوع التي تعتمد على خلية).
  9. مقاطعة عملية اكتساب وإضافة بلطف 1 مل من قبل تحسنت المتوسطة التصوير الحي مع FCCP في لوحة داخل غرفة المجهر باستخدام الماصة P1000.
  10. استئناف عملية الاستحواذ كما هو موضح سابقا، لمدة إجمالية قدرها 3 ساعات، وذلك باستخدام موقف المسجلة. حفظ جميع الصور المكتسبة من أجل تحليلها وإنشاء شريط فيديو لعملية mitophagic عند شراء أكثر من.

3. تحليل

  1. جمع كل الصور تم الحصول عليها في شكل "و tiff" على جهاز كمبيوتر شخصي
  2. فتح الصور مع لينة الرسموير وتحديد الفترة الزمنية وقعت من الميتوكوندريا التي يسببها الاستقطاب مع FCCP إلى الصورة الأولى تظهر تجنيد باركين في غشاء الميتوكوندريا (يتم الحصول على الصور كل 5 دقائق). كرر هذا التحليل لكل خلية في المجموعة التجريبية.
  3. تسمية الخلية الأولى من العمود على جدول مع اسم المجموعة التجريبية. لكل المجموعة التجريبية، وقياس فترات الزمنية لتجنيد باركين ما لا يقل عن 10 الخلايا. جعل متوسط ​​فترات الزمنية المحسوبة لتجنيد باركين وتحديد الانحراف المعياري لكل مجموعة تجريبية (متوسط ​​± SD، ن = 10).
    1. تنظيم في أعمدة فترات زمنية محسوبة واحدة. يحتوي كل عمود ن = 10 قياسات صالح المجموعة التجريبية.
    2. حدد وظيفة "المتوسط" من القائمة بناء الصيغة. حدد البيانات في العمود. حدد وظيفة "الانحراف المعياري" من القائمة بناء الصيغة. سيليط البيانات في العمود.
  4. باستخدام المنهج الإحصائي، مقارنة المجموعات التجريبية تطبيق الإحصائية المناسبة من أجل تحديد فرق كبير في ديناميكية mitophagy بين المجموعات التجريبية. (على سبيل المثال، مجموعتين = الطالب اختبار t أو ثلاثة أو أكثر من مجموعات = أنوفا بالإضافة إلى اختبار ما بعد خاص)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

هنا، وتبين لنا كم من الوقت الفاصل بين الفيديو المجهري هو أسلوب القوية التي يمكن استخدامها لمتابعة الأحداث الجزيئية من البروتينات fluorescently الموسومة في خلية واحدة. تظهر نتائج ممثلة أيضا كيف تسمح هذه التقنية لاقتناء صور ذات جودة عالية. عندما يتم الح...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ويمكن تعريف الوقت الفاصل بين المجهري كتقنية الذي يمتد التصوير الخلية الحية من ملاحظة واحدة في الوقت المناسب لمراقبة ديناميات الخلوية على مدى فترات طويلة من الزمن. وهذه المنهجية المتميزة من متحد البؤر بسيط أو المجهر الخلايا الحية لأنه يسمح للمراقب لتحديد في الوقت ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by NIH grants (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 to R.G.P.), the Kimmel Cancer Center NIH Cancer Center Core grant P30CA056036 (R.G.P.), a grant from the Breast Cancer Research Foundation, generous grants from the Dr. Ralph and Marian C. Falk Medical Research Trust (R.G.P.) and a grant from the Pennsylvania Department of Health (R.G.P.). In part this work was supported by an American Italian Cancer Foundation postdoctoral fellowship (G.D.) and Bioimaging Shared Resource of the Sidney Kimmel Cancer Center (NCI 5 P30 CA-56036).The Department specifically disclaims responsibility for an analysis, interpretations or conclusions. There are no conflicts of interest associated with this manuscript.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMCorning Life Science10-013-CVPre-warm at 37 °C before use
Phenol-free DMEMCorning Life Science17-205-CVPre-warm at 37 °C before use
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Pre-warm at 37 °C before use
L-GlutamineGibco25030Pre-warm at 37 °C before use
Penicillin/streptomycinCorning Life Science30-002-CIPre-warm at 37 °C before use
EYFP-PARKIN expression vectorAddgene23955
pDsRed2-Mito expression vectorClontech632421
Nucleofector 2B deviceLONZAAAD-1001S
Nucleofector for kit R NIH/3T3LONZAVCA-1001
ZEISS AXIOVERT 200M inverted microscopeCARL ZEISS
Carbonyl Cyanide 4-(trifluoromethoxy)-Phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC2920
MetaMorphMolecular DevicesExperimental Builder
ImageJNational Institute of HealthExperimental Builder

References

  1. Youle, R. J., Narendra, D. P. Mechanisms of mitophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).
  2. Zhi, X., Zhong, Q. Autophagy in cancer. F1000Prime Rep. 7, 18(2015).
  3. Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biol Chem. 393, 547-564 (2012).
  4. Lemasters, J. J. Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging. Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).
  5. Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria. J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).
  6. Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control. Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).
  7. Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. Mitophagy mechanisms and role in human diseases. Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).
  8. Di Sante, G., et al. Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria. Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).
  9. Tanaka, A. Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network. FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).
  10. Shiba-Fukushima, K., et al. PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy. Sci Rep. 2, 1002(2012).
  11. Trinh, J., Farrer, M. Advances in the genetics of Parkinson disease. Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).
  12. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417, 1-13 (2009).
  13. Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).
  14. Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability. Mol Vis. 10, 248-253 (2004).
  15. Jin, S. M., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance. J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).
  16. Kerr, M. C., et al. Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins. J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).
  17. Edin, F., et al. 3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve. Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).
  18. Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles. Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).
  19. Meseguer, M., et al. Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).
  20. Campbell, A., et al. Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).
  21. Bingol, B., et al. The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy. Nature. 510, 370-375 (2014).
  22. Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1. Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).
  23. Batlevi, Y., La Spada, A. R. Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging. Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).
  24. Frank, M., et al. Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner. Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).
  25. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
  26. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).
  27. Lemasters, J. J. Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3). Redox Biol. 2, 749-754 (2014).
  28. Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).
  29. Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy. Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).
  30. Kim, I., Lemasters, J. J. Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation. Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).
  31. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

111 Mitophagy FCCP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved