على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Summary

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Abstract

الخلايا الجذعية (DCS) هي المهنية الخلايا المقدمة للمستضد المسؤولة في المقام الأول لاكتساب ومعالجة وعرض المستضدات على مستضد الجزيئات لبدء الحصانة بوساطة الخلايا التائية. الخلايا الجذعية يمكن تقسيمها إلى عدة مجموعات فرعية ظاهريا وغير متجانسة وظيفيا. ثلاث مجموعات فرعية مهمة من الخلايا الجذعية الطحال هي بلازماوية الشكل، وخلايا CD8α ^{نقاط البيع} وCD8α ^NEG. في البلدان النامية بلازماوية الشكل والمنتجين الطبيعي الإنترفيرون من النمط الأول ومهمة لمكافحة الفيروسات مناعة الخلايا التائية. فرعية CD8α ^NEG العاصمة متخصصة لMHC من الدرجة الثانية تقديم المستضد وشملت مركزي في فتيلة خلايا CD4 T. وCD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية هي المسؤولة في المقام الأول عن عبر تقديم المستضدات الخارجية وCD8 T فتيلة الخلية. وقد أظهرت CD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية أن تكون أكثر كفاءة في تقديم المستضدات شحمي سكري جزيئات CD1d إلى سل تي المتخصصةالسكان ل المعروفة باسم ثابتة القاتلة الطبيعية خلايا T (iNKT). إدارة FLT-3 يجند يزيد من وتيرة هجرة الأسلاف الخلايا الجذعية من نخاع العظام، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى توسيع الخلايا الجذعية في الأعضاء الليمفاوية الطرفية في نماذج الفئران. تكيفنا هذا النموذج لتنقية أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية وظيفية لاستخدامها في التجارب نقل خلية للمقارنة في الجسم الحي الكفاءة من مجموعات فرعية العاصمة مختلفة.

Introduction

تم اكتشاف الخلايا الجذعية (DC) منذ ما يقرب من أربعين عاما باسم "النجمية الكبيرة (تغصن اليوناني) خلية" وجدت في الأجهزة اللمفاوية ^1. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن البلدان النامية هي خلايا مقدمة للمستضد الوحيدة التي يمكن أن تحفز على نحو فعال خلايا T ساذجة ^2. والمهمة الرئيسية لهذه الخلايا هي امتصاص وعرض المستضدات والمعالجة بكفاءة وتحميل هذه على تقديم المستضد الجزيئات. في الطحال الماوس، البلدان النامية يمكن فصلها إلى بلازماوية الشكل وفرعية التقليدية. وتتميز البلدان النامية بلازماوية بانخفاض التعبير عن CD11c وومستويات عالية من B220 وGR-1. بل هي أيضا إيجابية للسطح علامة mPDCA1 وتفرز النوع الأول الإنترفيرون ردا على حصيلة مثل مستقبلات 9 (TLR9) بروابط. في البلدان النامية التقليدية مرتفعة عن CD11c ووMHC من الدرجة الثانية التعبير. ويمكن تقسيمها إلى ثلاث مجموعات فرعية مختلفة تعتمد على التعبير عن سطح علامات المظهرية مثل CD4، CD8α، DEC205، CD11B والخلايا الجذعية مستقبلات المثبطة 2 (DCIR2، معترف بها من قبل الأجسام المضادة 33D1) البروتينات ^3،4. ومن المعروف أيضا CD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية كما cDC1، هي ايجابية لDEC205، ولكن سلبية لعلامات الدم النخاعي مثل CD11b و33D1. وCD8α ^NEG البلدان النامية، كما دعا cDC2، إيجابية ل33D1، CD11b وCD4 ولكنها تفتقر DEC205. فرعية سلبية مزدوجة (أي سلبية لكلا CD4 وCD8α) هي نادرة نسبيا، وسلبية للDEC205 و33D1. هو أقل فرعية السمات التي تميزت وقد يكون شكلا أقل تميزا من CD8α ^NEG العاصمة.

الاختلافات المظهرية في مختلف مجموعات فرعية العاصمة تمتد أيضا إلى وظائفهم في الجسم الحي. وCD8α ^NEG البلدان النامية هي أكلة للغاية ويعتقد أن تقديم مستضد خارجي أساسا عن طريق معقد التوافق النسيجي الكبير الثاني لخلايا CD4 T ^3. في المقابل، في ^{نقاط البيع} البلدان النامية CD8α هي متخصصة لتقديم المستضد البروتين القابلة للذوبان على MHC الصف الأولفي آلية تسمى عبر العرض. نتائج عبر العرض يعتمد على حالة تفعيل هذه البلدان النامية ^5، وإما أن تؤدي إلى توسيع الخلايا التائية السامة (CTLs) أو تطور الخلايا التائية التنظيمية ^{6 2،7.} استهداف مستضد إلى CD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية استخدام نتائج تسليم بوساطة مكافحة DEC205 الضد إلى حد كبير في حذف خلايا تي ^8، في حين عرض المستضدات المشتقة من الخلايا أفكارك المصابة يؤدي الى CTL استجابة قوية ^9.

بالإضافة إلى الاعتراف مستضدات الببتيد، تطورت الجهاز المناعي الثدييات الاعتراف الدهون ومولدات المضادات شحمي سكري. يتم عرض هذه المستضدات من قبل جزيئات CD1، التي هي معقد التوافق النسيجي الكبير الطبقة أحب بروتينات سطح الخلية الموجودة في النماذج الخاصة المتعددة في مختلف الثدييات. في الفئران، ونوع واحد من الحفظ جدا جزيء CD1 دعا CD1d هو المسؤول عن تقديم المستضدات شحمي سكري ^10. الاختصاص ويطلق السكان من خلايا تي التي تعترف CD1d / المجمعات شحمي سكري خلايا NKT ثابتة (خلايا iNKT). هذه الخلايا تعبر عن شبه ثابتة مستقبلات الخلايا التائية (TCR) يتألف من سلسلة TCRα ثابتة أن يقترن مع سلاسل TCRβ التي التنوع ¹¹ محدودة. وخلافا للخلايا T التقليدية التي تحتاج لتتكاثر والتفريق لتصبح تنشيط خلايا T المستجيب، وجود خلايا iNKT باعتبارها السكان المستجيب وتبدأ الاستجابة بسرعة بعد تناوله شحمي سكري ^12. تحديد الخلايا مستضد الدهون ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية هي منطقة نشطة للبحث، لذا تم اقتراح العديد من أنواع الخلايا المتميزة مثل B الخلايا، الضامة والبلدان النامية لأداء هذه المهمة. ومع ذلك، وقد تبين أن مجموعة فرعية CD8α ^{نقاط البيع} من البلدان النامية هي الخلية الأساسية التوسط امتصاص وعرض المستضدات الدهون في خلايا فأر iNKT ¹³ و شحمي سكري بوساطة عبر فتيلة من خلايا CD8 T ^14.

ove_content "> لمقارنة كفاءة تقديم المستضد من قبل مختلف خلايا مقدمة للمستضد، نهج مباشرة هو لنقل أنواع مختلفة من ناقلات الجنود المدرعة النقاء نابض مع المبالغ المعادلة المستضد إلى المضيفين السذاجة. وغالبا ما يتم إجراء تجارب نقل خلية من هذا النوع للدراسات المناعية. ومع ذلك، إجراء الدراسات نقل مع البلدان النامية خارج الحي مستضد تعامل يشكل تحديا، لأن هذه الخلايا موجودة السكان نادرة كما هو الحال في الأجهزة اللمفاوية حيث أنها تشكل أقل من 2٪ من مجموع الخلايا ^(15). ولذا فمن الضروري تعزيز تطوير هذه الخلايا في الحيوانات المانحة لزيادة كفاءة بروتوكولات العزلة.

ومن المعروف أن اللمفاوية المشترك والأسلاف النخاعي المشتركة، التي مطلوبة من أجل جيل من الحزب الديمقراطي المسيحي، CD8 ^{نقاط البيع} وفرعية CD8 ^NEG العاصمة، صريحة تتعلق FMS مستقبلات التيروزين كيناز 3 (FLT-3). عليها في الجسم الحي FLT-3 يجند (FLT-3L) الإدارة، emigratوزيادة أيون من FLT-3 معربا عن الخلايا السلف من نخاع العظام، مما أدى إلى زيادة البذر من الأعضاء الليمفاوية الطرفية وتوسيع بهم ناضجة العاصمة ذرية ^16. يتم فقدان التعبير عن FLT-3 خلال الالتزام B، T أو NK مسارات تمايز الخلايا. لذلك، لوحظ فقط الحد الأدنى من التعديلات في هذه الخلايا على إدارة FLT-3L. لوحظ توسع مماثل في السكان في العاصمة الفئران تحمل الأورام الناتجة عن زرع خط الخلية B16-سرطان الجلد إفراز الفئران FLT-3L، الذي يوفر طريقة بسيطة واقتصادية لتوفير مستويات النظامية مستمرة من FLT-3L ^17،18. باستخدام هذا النهج، قمنا بتطوير بروتوكول على أساس زرع الخلايا B16-سرطان الجلد إفراز FLT-3L لتحفيز التوسع في جميع مجموعات فرعية العاصمة العادية في الطحال الماوس، وبالتالي زيادة كبيرة في العوائد من هذه الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن تجارب لاحقة . نجد دائما أنه في غضون 10-14 يوما بعد ايم تحت الجلدمزرعة للورم إفراز FLT-3، والفئران تطوير تضخم الطحال مع تخصيب ملحوظ في البلدان النامية تشكل 40 - 60٪ من مجموع خلايا الطحال. من هذه الطحال، مجموعات فرعية العاصمة مختلفة يمكن أن تكون معزولة مع نقاء عالية باستخدام معيار المتاحة تجاريا مجموعات تنقية الخلايا التي تستخدم علامات المظهرية-فرعية معينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تتم التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC). يتم تنفيذ جميع الإجراءات التي تتطلب العقم في خزانة السلامة البيولوجية.

1. زرع B16.Flt3L الميلانوما في الفئران

1. ثقافة FLT-3 معربا عن B16 سرطان الجلد خط خلية في T25 قوارير زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة من 0.5 × 10 ⁶ خلية / مل في المتوسط ​​DMEM كاملة مع 10٪ CO ₂ عند 37 درجة مئوية. تنمو حتى تصل إلى خلايا ~ 90٪ التقاء (~ 20 ساعة).
2. حصاد الخلايا بواسطة التربسين الهضم. نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وغسل الخلايا الملتصقة مع برنامج تلفزيوني. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. إضافة الباردة 20 مل الكامل DMEM المتوسطة (4 درجة مئوية) التي تحتوي على مصل العجل الجنين (FCS) لإرواء عملية الهضم البروتيني. رفع الخلايا من قبل طفيفة البزل تليها pipetting بلطف صعودا وهبوطا.
3. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة بقاء الخلية. و resuspend إلى كثافة من 10 ⁸ خلية / مل في برنامج تلفزيوني.
4. الفئران زرع (C57BL / 6 أو سلالة متوافق نسيجيا آخر) مع الخلايا السرطانية عن طريق الحقن تحت الجلد كما وصفها Machholz وآخرون. ¹⁹ في قاعدة العنق مع 100 ميكرولتر من تعليق خلية (10 ⁷ خلايا).
5. السماح للورم أن ينمو حتى اضح أو مرئية (2-10 ملم في القطر، وعادة 7-12 أيام) قبل التضحية الحيوانات لأجهزة الحصاد.

2. إعداد الطحال تعليق خلية واحدة من ورم وإذ الفئران

1. تخدير الفئران مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين (ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين ل> 5٪ ومواصلة التعرض 2 دقيقة على الأقل بعد توقف التنفس). التضحية FLT-3 الورم القتامي تحمل الماوس عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للقتل الرحيم.
2. ديsinfect الجلد مع الايثانول 70٪ والطحال الحصاد باستخدام تقنية العقيم مع المعونة من مقص العقيمة ^20.
3. وضع الطحال في طبق بتري معقمة لنقلها إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. تنفيذ جميع الخطوات من هنا تحت ظروف معقمة.
4. نقل الطحال إلى طبق بيتري الطازجة وتغسل مع RPMI المتوسطة. قطع الطحال إلى قطع صغيرة (~ 0.2 سم ²⁾ باستخدام مشرط. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10 مل من محلول كولاجيناز / الدناز.
5. صب تعليق هضمها جزئيا من أنسجة الطحال على مصفاة الخلية 70 ميكرون. ضغط شظايا الأنسجة المتبقية من خلال شبكة من مصفاة باستخدام 5 مل حقنة الغطاس.
6. غسل فلتر شبكة مع 10 مل من متوسطة جديدة والتخلص من مرشح. الطرد المركزي تعليق في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لخلايا بيليه.
7. نضح طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل من العازلة تحلل كريات الدم الحمراء. في احتضان RT وأو 10 دقيقة. إخماد العازلة تحلل كريات الدم الحمراء عن طريق إضافة 10 مل من المتوسط ​​RPMI كاملة.
8. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. resuspend في حجم مناسب لتحقيق كثافة الخلية من 10 ⁸ خلية / مل في الخلية فرز عازلة (على سبيل المثال، أجهزة ماكينتوش) التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل من FC-كتلة الجسم المضاد (2.4G2).

3. تنقية بلازماوية البلدان النامية، CD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية وCD8α ^NEG البلدان النامية من الطحال تعليق خلية واحدة

ملاحظة: عزل مجموعات فرعية العاصمة الطحال من تعليق خلية واحدة هو إجراء متعددة الخطوات كما هو موضح في الشكل رقم 1 تنفيذ كافة الخطوات باستخدام عازلة تبرد قبل وحمام الماء المثلج للحفاظ على درجة حرارة 4-8 درجة مئوية. يتم احتساب كافة وحدات التخزين كاشف في القسم التالي من بروتوكول للمساهمة الأولي من 200 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال في 10 ⁸ خلية / مل). يمكن زيادتها هذا الأمر أوأسفل على أساس الحاجة الخاص بك عن طريق تغيير حجم التعليق الخلية (دائما في كثافة 1 X 10 ⁸ خلايا / مل)، والكواشف الأخرى نسبيا في الخطوة الأولى (3.1.1 و 3.2.1). ضبط كميات كاشف في كل خطوات لاحقة وفقا لذلك. على سبيل المثال، إذا بدءا من 100 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال في 1 × 10 ⁸ / مل، واستخدام نصف كميات كاشف ورد في جميع الخطوات.

1. عزل بلازماوية البلدان النامية (PDC)
   1. إضافة 300 ميكرولتر من المسمى البيوتين كوكتيل الأجسام المضادة المنصوص عليها في بلازماوية عدة العزلة العاصمة إلى 200 ميكرولتر من تعليق خلية الطحال.
   2. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. الاستفادة من أنبوب كل 3 دقائق للحفاظ على الخلايا مع وقف التنفيذ، وتحقيق أقصى قدر من الأجسام المضادة ملزمة.
   3. إضافة 12 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح طاف لإزالة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز غير منضم.
   4. Resuspend والخليةبيليه في 500 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز. إضافة 300 ميكرولتر من مكافحة البيوتين الخرز الضد مترافق. كرر الخطوة 3.1.2 و3.1.3.
   5. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية في 2 مل من خلية عازلة الفرز. تنفيذ جميع الخطوات من هذه النقطة في RT باستخدام مخازن تبريد مسبقا.
   6. وضع الخلايا المغناطيسية جديدة تنشيط فرز عمود LS في الوقوف المغناطيسي. غسل وتتوازن العمود مع 5 مل من خلية عازلة الفرز.
   7. ماصة تعليق الخلية على العمود، وتطبيق برفق إلى وسط سطح سرير العمود. جمع التدفق من خلال.
   8. غسل العمود مع 10 مل من خلية عازلة الفرز. جمع هذا التدفق من خلال الجمع بين ومع تدفق من خلال من الخطوة 3.1.7. وأثرى PDCS في هذا التدفق عمود من خلال (FT1).
   9. بيليه الخلايا من FT1 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، resuspend في 2 مل خلية عازلة الفرز وتمر الخلايا من خلال عمود LS جديدةبتكرار الخطوات 3.1.6 - 3.1.8. هذا الاستخدام من عمودين متتابعة غلة نقاء تعزيز الخلايا المعزولة.
   10. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، و resuspend مع 2 مل كاملة RPMI. وضع على الجليد لحين الحاجة إليها.
2. عزل CD8α ^{نقاط البيع} وCD8α ^NEG البلدان النامية
   ملاحظة: الخطوة الأولى في هذا الإجراء هو استنزاف الخلايا البائية، PDC، T وNK.
   1. بدءا كله تعليق خلية الطحال (1 مل ​​10 ⁸ خلية / مل حصلت عليه في الخطوة 2.8)، إضافة 100 ميكرولتر من البيوتين مترافق كوكتيل الأجسام المضادة المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α ^{نقاط البيع} العاصمة.
   2. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. الاستفادة من أنبوب بلطف كل 3 دقائق لتحقيق أقصى قدر ملزمة من الأجسام المضادة المسمى البيوتين إلى الخلايا المستهدفة.
   3. إضافة 12 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح السوبرعائم لإزالة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز غير منضم.
   4. إضافة 150 ميكرولتر من خلية عازلة فرز و 100 ميكرولتر من الخرز مكافحة البيوتين المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α ^{نقاط البيع} العاصمة. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة.
   5. إضافة 10 مل الفرز الخلية العازلة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   6. Resuspend الخلايا في 1 مل خلية عازلة الفرز وتمرير أكثر من عمود LS جديدة وفقا للإجراءات في الخطوات 3.1.6 خلال 3.1.8.
   7. جمع تدفق الخالي من الملصقات من خلال 2 (FT2) وتجاهل retentate العمود. وأثرى هذا جزء الخالي من الملصقات لCD8α ^{نقاط البيع} وCD8α ^NEG البلدان النامية.
   8. بيليه الخلايا في FT2 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   9. Resuspend الخلايا في 1 مل العازلة خلية الفرز وإضافة 200 ميكرولتر من-CD8α المضادة حبات مغناطيسية مترافق المنصوص عليها في عدة العزلة CD8α ^{نقاط البيع} العاصمة.
   10. ممثلأكل الخطوات 3.2.2 خلال 3.2.6. وأثرى تدفق من خلال العمود لCD8α ^NEG البلدان النامية واستنزاف لCD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية. هذا هو المسمى تدفق من خلال 3 (FT3).
   11. إلى أزل CD8α ^{نقاط البيع} البلدان النامية الاحتفاظ بها في العمود، وإزالة عمود من المغناطيس، إضافة 5 مل من خلية عازلة الفرز وتطهير مصفوفة عمود باستخدام المكبس المتوفرة مع عمود LS.
   12. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح وطاف resuspend في 1 مل خلية عازلة الفرز. لزيادة نقاء، تشغيل خلايا مزال مرة أخرى من خلال عمود LS جديدة بتكرار الخطوات 3.1.6 إلى 3.1.8، إلا تجاهل التدفق من خلال وجمع الخلايا الاحتفاظ بها في 3.2.11.
   13. لتنقية CD8α ^NEG البلدان النامية من تعليق FT3، بيليه FT3 بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وresuspend في 300 ميكرولتر من خلية عازلة الفرز.
   14. إضافة 100 ميكرولتر من المجموعة الاستشارية للألغام المضادة للCD11c وحبات المغنطيسية. تخلط جيدا واحتضان في حمام ماء مثلج لمدة 15 دقيقة.
   15. إضافة 10 مل خلية فرز خلايا العازلة وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   16. كرر الخطوات من 3.1.5 خلال 3.1.8. ويتم اختيار CD8α ^NEG البلدان النامية بشكل إيجابي مع الخرز CD11c وولا بد أن العمود. تدفق من خلال يمكن التخلص منها.
   17. أزل الخلايا الاحتفاظ بها في العمود كما هو موضح في الخطوة 3.2.11 لجمع النقي CD8α ^NEG البلدان النامية.

4. النبض ناقلات الجنود المدرعة مع المستضدات ونقل خلية

1. عد الخلايا الحية بعد تنقيتها باستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان ²¹ لتمييز الخلايا الحية والميتة.
2. احتضان الخلايا مع مستضد في الاختيار. استخدام نظائرها من المستضد شحمي سكري يسمى ألفا galactosyl سيراميد (αGalCer) في 100 نانومتر تركيز ^13. عادة، لوحة 10 ⁶ خلايا قابلة للحياة / جيد في المتوسط ​​RPMI كاملة باستخدام فائقة منخفضة اتاكhment U-أسفل 96 لوحات جيدة للحد من مرفق الخلية. احتضان الخلايا في 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعة.
3. حصاد الخلايا بواسطة pipetting بلطف عدة مرات. استخدام واسعة نصائح تتحمل ماصة للتقليل من تلف الخلايا من قوى القص. غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني وتجمع هذه يغسل لتعظيم حصاد الخلايا.
4. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend إلى كثافة المطلوبة في برنامج تلفزيوني. عادة، حقن 1000000 الخلايا في 200 ميكرولتر في الحيوان المتلقي. تبقي الخلايا على الجليد لتحقيق أقصى قدر من الجدوى قبل الإدارة في الحيوانات المضيفة.
5. حقن الخلايا عن طريق الوريد في الفئران إما من خلال عبثا الذيل الأفقي أو الضفيرة الوريدية الرجعية المدارية ^19. استخدام 27 G إبرة في حقنة 1 مل، وحقن الحد الأقصى لحجم 0.1 مل في الماوس.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

نتائج هذا الإجراء تعتمد على التوسع في مجموعات فرعية العاصمة من قبل الفئران FLT-3L التي أعرب عنها خلايا سرطان الجلد المزروع. وقد استمدت الورم B16.Flt3L من C57BL / 6 الماوس، وينبغي زرعها في الحيوانات مع هذه الخلفية سلالة من أجل تجنب الفشل من الورم لتصبح المنشأة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وتقبل الخلايا الجذعية ليكون المستضد المهنية الرئيسية تقديم الخلايا المشاركة في فتيلة من ردود الخلايا التائية. وظيفتها الرئيسية هي لمسح المكروية الأنسجة عن طريق تناول ومعالجة المستضدات لعرضها على خلايا تي. من أجل دراسة وظيفة فرعية العاصمة محددة، وهذه تحتاج إلى أن ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies, Gibco	25300-054
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (dry powder)	QIAGEN	79254
200 proof ethanol	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Used to prepare 70% ethanol
RBC lysis buffer	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM medium with L-glutamine	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030081
MEM non-essential amino acids	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM essential amino acids	Life Technologies	11130-051
β-mercaptoethanol	Life Technologies, Invitrogen	21985-023
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Phosphate buffered saline (PBS Ca2+ and Mg2+ free pH 7.2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco’s PBS (DPBS with Ca2+ and Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0.5 M Ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solution	Life Technologies	15575-020
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Fetal calf serum	Atlanta Biologicals	S11050
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Invitrogen	15140-163
Trypan blue (dry powder)	Sigma-Aldrich	T6146-5G	Prepare 0.08% with PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotech	130-092-786
Magnetic beads conjugated with anti-mouse CD11c	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos mouse DC isolation kit	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-gamma receptor blocking antibody (Clone 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Anti-mouse CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Anti-mouse CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Anti-mouse B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml syringes	BD	26048
23 G1 needle	BD	305145
100 mm Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	875712
Surgical instruments	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Cell strainer (70 µm)	BD	352350
Large Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Vacuum filtration system (500 ml (0.22 µm))	Corning	431097
LS columns	Miltenyi	130-042-401
Magnetic stand MACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-302
Wide-bore 200 μl pipette tips	PerkinElmer	111623
Corning ultra-low attachment 96-well plates	Corning	CLS3474-24EA
6-8 week old female C57BL/6 mice	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L melanoma cell line			described by Mach et al., 2000
Serum free DMEM and RPMI media 500 ml DMEM with L-glutamine, or 500 ml RPMI-1640 with L-glutamine 5 ml MEM nonessential amino acids (100x, 10 mM) 5 ml HEPES Buffer (1 M) 5 ml L-glutamine (200 mM) 0.5 ml 2-mercaptoethanol (5.5 x 10-2 M)			Mix all the ingredients in a biosafety cabinet with either DMEM or RPMI media depending on your need. Filter sterilize the media by passing through a 0.22 µm vacuum filtration system.
Complete RPMI and DMEM media			Add 50 ml of heat inactivated fetal calf serum to serum free RPMI or DMEM media to obtain complete media.
MACS buffer			Add 2 ml of 0.5 M EDTA and 10 ml of heat inactivated fetal calf serum to 500 ml of Phosphate-buffered saline (PBS, Ca2+ and Mg2+ Free, pH 7.2) and 2 µg/ml 2.4G2 (Fc-Block antibody).
FACS staining buffer			Dissolve sodium azide to 0.05% (0.25 g per 500 ml) in MACS buffer to obtain FACS staining buffer
10x Collagenase D and DNase 1 stock solution Dissolve 1 g of collagenase D and 0.2 ml of DNase 1 stock (1 mg/ml, 100x) in 20 ml of PBS containing Ca2+ and Mg2+ to obtain a solution of approximately 1,000-2,000 Units of collagenase activity per ml.			This 10x stock solution can be prepared ahead of time and stored at -20 °C for several weeks. Dilute 1 ml of this with 9 ml of serum free RPMI immediately before use.