JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Abstract

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils ≥ 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Introduction

تشكل الخلايا المناعية الفطرية نسبة أساسية من الخلايا داخل المكروية الورم وارتبطت مع خباثة الورم في المرضى والنماذج الحيوانية من السرطان 1. في الآونة الأخيرة، فقد أصبح موضع تقدير على نطاق واسع أن الاستجابات المناعية المزمنة تلعب أدوارا حاسمة في تعزيز تطور الورم، ورم خبيث ومقاومة الكيميائي 2. الضامة هي خلايا المناعة الفطرية الهامة التي ثبت لتنظيم مباشرة استجابة الخلايا السرطانية للعلاج الكيميائي 3،4. ومع ذلك، لا يعرف دور العدلات، اللاعبين الرئيسيين في نظام المناعة الفطري، في تنظيم استجابة الورم للعلاج مضاد للسرطان. أهداف هذه البروتوكولات هي استخدام طريقة سريعة وموثوق بها لفصل العدلات من عينات الدم CLL المريض وللتمييز خلايا HL60 على طول الطريق المحببات لدراسة دورها في تنظيم حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى وكلاء المضادة للسرطان الغدد الليمفاوية.

= "jove_content"> العدلات هي العنصر الخلوي الأكثر وفرة من نظام المناعة الفطري في الدم 5 ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة 6. العدلات دورا أساسيا في ارتفاع الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة بالإضافة إلى وظائف المستجيب المتغيرة في العديد من الحالات المرضية 7. لذلك، وهي طريقة سريعة وموثوق بها لعزل العدلات من خلايا الدم الأخرى، مثل طريقة الفصل التدرج الكثافة، مطلوب للدراسات في المختبر. وسوف تستخدم هذه الطريقة لعزل العدلات تسهيل إجراء مزيد من البحوث على وظائف مناعية بوساطة العدلات في الجسم الحي وخارج الحي.

القدرة على الحصول على مجموعات نقية من العدلات هي خطوة أولى مهمة للتحقيق في المرضى الذين يعانون من الأمراض المناعية 8. كثافة طريقة فصل الانحدار هو أسلوب المثالية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من الخلايا. وmethoد ينطوي على إضافة حل كثافة التدرج في الجزء السفلي من أنبوب يحتوي على الدم البشري المخفف تليها الطرد المركزي في 300 غ لمدة 35 دقيقة دون انقطاع. تظهر حلقة من الخلايا وحيدة النواة في واجهة والعدلات الموجودة أدناه السابق. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة فيما يتعلق بأساليب الأخرى المتاحة مثل مجموعات العزلة المتعادلة التي هي أكثر تكلفة بكثير 9. وبالإضافة إلى ذلك، عزل العدلات من الدم البشري من قبل مجموعات تجارية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة إلى علامة السطحية النوعية للعدلات الإنسان، تزيد من خطر تنشيط الخلايا أو تمييز. يسمح كثافة طريقة فصل التدرج عزل العدلات في غضون فترة قصيرة من الزمن. ضمن نفس الخطوة، وأيضا فصل الخلايا وحيدات النوى واستردادها. إنها تقنية الأساسية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا نقية من أجل تحقيق السلامة الوظيفية.

من أجل تقليد microenv الورمironment، أجريت تجارب 3D. ونظرا لنصف عمر قصير العدلات في المختبر، والتجارب 3D مع العدلات الإنسان العذبة ليست نهائية. لهذا السبب، وبفعل البرولمفوسيت (HL60) الخلايا على التمايز إلى خلايا تشبه الخلايا المتعادلة باستخدام محرضات تمايز سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) وحمض الريتينويك (RA). وذلك باستخدام خلايا HL60 متباينة (HL60 فرق) منع وجود استجابات مختلفة من العدلات بسبب العزلة من مختلف الجهات المانحة.

في 3D المختبر تمثل نماذج ثقافة مرحلة وسيطة بين في المختبر نماذج 2D و في النماذج الحية. في ثقافة 2D، والخلايا المنتشرة على سطح البلاستيك تشكيل إرفاق ملفات خلية غير طبيعية للبروتينات المودعة التي التشويه والتحريف على هذا السطح الاصطناعية. على العكس من ذلك، فإن الخلايا في شكل ثقافة 3D إرفاق ملفات الطبيعية خلية خلية منذ الخلايا والمصفوفة خارج الخلية التي توليف هي المواد الطبيعية التي ترد فيها.لهذا السبب، ونماذج 3D شارك في ثقافة، خصوصا بين الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى، كانت مفيدة جدا للإشارة إلى مساهمتها في نمو الورم، الأوعية الدموية، والانبثاث. ونتيجة لذلك، والثقافات 3D جعل ثقافة خلية محاكاة الظروف الفسيولوجية التي توجد في الجسم الحي 10.

Protocol

1. العدلات عزل والمشارك الثقافة مع خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية

أجريت إجراءات بموجب موافقة لجنة ليون الأخلاق مستشفى مع جميع المرضى توقيع الموافقة المسبقة عن: ملاحظة.

  1. عزل خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية والعدلات
    1. جمع أنابيب من الدم المحيطي على EDTA (EDTA 1.8 ملغ لكل مليلتر من الدم) من المرضى الذين شخصت إصابتهم بسرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL).
    2. إضافة كل 15 مل من الدم إلى أنبوب 50 مل العقيمة وتمييع مع 15 مل RPMI (تخفيف 1: 1)، ثم بعناية وببطء إضافة 15 مل من كثافة حل الانحدار إلى أسفل الأنبوب دون خلط المراحل. ضمان أن الحل كثافة التدرج في RT لإعداد.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 35 دقيقة في RT ودون فرامل. يجب فصل الدم إلى أربع مراحل متميزة كما هو مبين في الشكل 1A، من أعلى إلى أسفل: الصفائح الدموية والبلازما وخلايا وحيدات النوى (ثحلقة هيت)، حل التدرج الكثافة، المحببة وكريات الدم الحمراء.
    4. جمع عصابة البيضاء التي تمثل خلايا اللوكيميا الأولية مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل الجديد.
      1. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم) تصل إلى 50 مل في مجموعه وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
      2. Resuspend وبيليه مع 5 مل برنامج تلفزيوني ثم إضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 مل في مجموعه وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
      3. Resuspend وبيليه مع المتوسطة RPMI كاملة (RPMI 1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ملغ / مل الستربتومايسين) لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
    5. نضح المراحل العليا وترك مرحلة المحببة وكريات الدم الحمراء وإضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 25 مل ثم يضاف 3٪ ديكستران في 0.9٪ NaClup إلى 50 مل في المجموع. خلط الأنابيب 10 مرات والاحتفاظ بها لمدة 30 دقيقة في RT دون خلط.
    6. جمع العلوي RBC الفقراء طبقة العدلة لد وضعها في أنبوب مل العقيمة 50 نظيفة وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT. resuspend كل بيليه مع 5 مل برنامج تلفزيوني ثم إضافة عازلة خلية تحلل الأحمر إلى 50 مل في المجموع.
    7. إبقاء الأنابيب في الظلام لمدة 15 دقيقة في RT ثم الطرد المركزي في 500 غ لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الكريات مع برنامج تلفزيوني (إضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 مل في المجموع) ثم الطرد المركزي في 500 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
    8. Resuspend والكريات مع المتوسط ​​RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد. الحفاظ 3 × 10 5 من كل نوع من الخلايا في 50 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) في 5 أنابيب مل من البلاستيك لتحديد نقاء عزلتهم باستخدام التدفق الخلوي.
  2. تحليل عدد المورفولوجية من بالسكان خلية معزولة
    1. للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10 4 عدلات و 3 × 10 4 خلايا وحيدة النواة في 150 ميكرولتر كامل المتوسطة RPMI. تجميع الشرائح الزجاجية، وبطاقات الترشيح، وغرف العينة في جهاز الطرد المركزي cytospin، وضمان أن رانه الطرد المركزي غير متوازن.
    2. وضع كل نوع من الخلايا في حجرة العينة وخلوي الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 10 دقيقة في RT إزالة الشرائح وبطاقات الترشيح، وغرف عينة من أجهزة الطرد المركزي. تفكيك بعناية، حتى لا تتلف الخلايا على الشريحة. تجاهل بطاقات الترشيح وغرف عينة.
    3. وصمة عار على الخلايا باستخدام بالغيمزا عدة تلطيخ والحفاظ على الشرائح لمدة 1 ساعة حتى يجف. دراسة الخلايا عن طريق مجهر مع التكبير 100X.
  3. اختبار نقاء خلايا معزولة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. تسمية الخلايا اللوكيميا الأولية المعزولة مع الأجسام المضادة CD19 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). تسمية العدلات النقاء مع خليط من أضداد الإنسان المدرجة في الجدول 1 (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    2. غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) من أنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
    3. resuspend كل بيليه في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
    4. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PerCP-Cy5.5 (695/40 BP )، PE (575/26 BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP)، APC-Cy7 (780/60 BP). ضمان تعويض اللون.
  4. Coculture من خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية مع ذاتي العدلات
    1. البذور 2 × 10 5 خلية / مل من خلايا اللوكيميا الأولية وحدها أو مع العدلات ذاتي في 1:10 النسبة في المتوسط ​​RPMI كاملة. للقيام بذلك، وضبط أعداد الخلايا عن طريق تمييع تعليق خلية وإضافة 2 × 10 5 خلية / مل من خلايا اللوكيميا الأولية إلى 2 × 10 6 خلية / مل العدلات. مزيج بعناية.
    2. إضافة 25 ميكرومتر مثبط التيروزين كيناز بروتون (BTK) (ibrutinib) إلى الخلايا. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  5. خلية الحصاد وتحليل FACS
    1. كولإلخ الخلايا في أنابيب بلاستيكية 5 مل لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. غسل الكريات مع 1 مل PBS-FBS (4٪) ثم الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
    2. الكريات Resuspend في Annexin V و PI باستخدام طقم التجارية واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 10 دقيقة في RT. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة في الشكل 2A و التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PI (610 / 20 BP). ضمان تعويض اللون.

2. تمايز الخلايا HL60 على طول المحببات المسار وCoculture مع خلايا RL سرطان الغدد الليمفاوية B في 3D النموذجي

  1. تمايز البرولمفوسيت الإنسان (HL60) الخلايا إلى خلايا تشبه العدلات
    1. ضبط HL60 عدد الخلايا إلى 3 × 10 5 خلية / مل ثم يضاف 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، و 1.25٪ DMSO للحث على تمايز بهم. البذور كل 3 × 10 5 خلايا HL60 لكل بئر في لوحة 48-جيدا ثم احتضان لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    2. وفي وقت لاحق، وجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الخلايا مع المتوسط ​​RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
    3. ثم تمييع تعليق خلية في المتوسط ​​RPMI كاملة لضبط عدد الخلايا HL60 إلى 3 × 10 5 خلية / مل وحمل مرة أخرى التمايز من خلال إضافة 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، و 1.25٪ DMSO. البذور كل 3 × 10 5 HL60 الخلايا لكل بئر في لوحة 48-جيدا واحتضان لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. تحليل التمايز HL60 (HL60 فرق)
    1. جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي أنابيب في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الكرية مع المتوسط ​​RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
    2. لتحليل التغيرات في التعبير علامات سطح الخلية التدفق الخلوي. ضع كل 3 × 10 5 خلايا غير متمايزة HL60 (من ثقافة الخلية) و 3 × 10 5 HL60 الخلايا المختلفة في أنابيب بلاستيكية 5 مل لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
    3. Resuspend والكريات في 50 ميكرولتر PBS-FBS (4٪). تسمية الخلايا مع CD11b مكافحة الإنسان مترافق إلى AF700 أو CD38 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    4. يغسل مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) ثم الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend والكريات في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
    5. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة من 3A الشكل والتكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP)، اليكسا فلور 700 (730/45 BP).
    6. لاختبار التغيرات الشكلية في فرق HL60، لشل حركة الخلايا على الشرائح الزجاجية للفحص المجهري.
      1. للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10 4 خلايا غير متمايزة HL60 (من ثقافة الخلية) و 3 × 10 4 HL60 فرق في 150 ميكرولتر كاملة RPMI المتوسطة. تجميع الشرائح الزجاجية، وبطاقات الترشيح، وغرف العينة في جهاز الطرد المركزي cytospin، وضمان أن أجهزة الطرد المركزي متوازن.
      2. وضع كل نوع من الخلايا في حجرة العينة وخلوي الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة الشرائح وبطاقات الترشيح، وغرف عينة من أجهزة الطرد المركزي. تفكيك بعناية، حتى لا تتلف الخلايا على الشريحة. تجاهل بطاقات الترشيح وغرف عينة.
      3. وصمة عار على الخلايا باستخدام بالغيمزا عدة تلطيخ والحفاظ على الشرائح لمدة 1 ساعة حتى يجف. دراسة الخلايا عن طريق مجهر مع التكبير 100X.
  3. 3-الأبعاد (3D) الثقافة
    ملاحظة: تأكد من أن المواد المستخدمة في هذه التجربة باردة والتجربة تجري على الجليد.
    1. resuspend كل 5 × 10 4 خلايا RL، إما وحدها أو مختلطة مع فرق HL60 في نسبة RL: HL60 فرق 01:10، مع 300 ميكرولتر الغشاء القاعدي مصفوفة باستخدام 1 مل ماصة قطع مع مقص معقم من أجل توسيع الانفتاح على حوالي 2 إلى 3 مم. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة.
    2. البذور لكل 300 ميكرولتر من تعليق خلية / جيد في 24 لوحة جيدا. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ثم يضاف 1 مل إكمال RPMI المتوسطة لكل بئر واحتضان لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تغيير المتوسطة كل يومين. إضافة 10 نانومتر الفينكريستين في يوم 5.
  4. تحليل FACS
    1. بعد 7 أيام من الثقافة، نضح المتوسطة ويغسل كل جيدا مع 1 مل PBS الجليد الباردة مرتين. إضافة 3 مل / جيد من الجليد الباردة PBS-EDTA (5 ملم). فصل جل من قاع البئر عن طريق كشط استخدام الجزء السفلي من 200 رأس ماصة ميكرولتر. يهز لوحة بلطف على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    2. نقل تعليق خلية في أنبوب معقم 15 مل ويهز أنابيب بلطف على جيمه لمدة 30 دقيقة أخرى. تحقق من ظهور التعليق الخلية متجانسة. (إذا لم يكن كذلك، ثم يهز الخلايا لوقت أطول أو إضافة المزيد من PBS-EDTA).
    3. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الكريات مع برنامج تلفزيوني ثم الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. و resuspend مع برنامج تلفزيوني-FBS (4٪) وعلامة مع الأجسام المضادة CD19 مكافحة الإنسان مترافق PE-Cy7 والأجسام المضادة CD38 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    5. يغسل مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪)، ثم أنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الخلايا مع Annexin V و PI باستخدام طقم التجارية.
    6. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة في الشكل 4A و التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PI (610 / 20 BP)، PE-Cy7 (780/60 BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP). ضمان تعويض اللون.

النتائج

كثافة طريقة فصل التدرج الموصوفة هنا يوفر خلايا اللوكيميا الأولية والعدلات unstimulated عزل من دم المرضى CLL يمثل الشكل 1A طبقات الدم المختلفة التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة (من أعلى إلى أسفل: الصفائح الدموية والبلازما، حلقة ...

Discussion

الموصوفة هنا، بروتوكول فعالة وبسيطة وسريعة وغير مكلفة لعزل العدلات من الدم البشري مع نقاء عالية باستخدام نهج الطرد المركزي التدرج الكثافة والواقعة في نفس الخلايا وحيدة النواة خطوة فهي أيضا مفصولة واستردادها. السكان خلية معزولة و≥90٪ نقية.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 Gibco Invitrogen21875-034
Fetal bovine serum (FBS)Gibco Invitrogen10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)Gibco Invitrogen14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)Life technologies25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep)Life technologies15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) CliniSciencesA3001
Vincristine EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix BD Biosciences354234Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer BD Biosciences555899
Ficoll (Pancoll)PAN BiotechP04-60500
Dextran Sigma-AldrichD8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Retinoic acidSigma-AldrichR2625
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE5134
Sodium chloride (NaCl)EuromedexS3014
Annexing V-FLOUS staining kit Roche11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kitCosmos BiomedicalCB361550-0000
LSRII flow cytometryBD Biosciences
CytocentrifugeThermo Scientific
Leica DMR-XA microscopeLeica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability CounterNexcelom  Bioscience

References

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -. M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

109 HL60 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved