تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي تصوير في الوقت الحقيقي متعددة الخلايا حيوية في المكروية ورم

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام المجهر multiphoton لأداء الموسعة الوقت الفاصل بين التصوير من التفاعلات متعددة الخلايا في الوقت الحقيقي، في الجسم الحي في قرار خلية واحدة.

Abstract

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Introduction

وقد تبين أن نشر الخلايا السرطانية من الورم الثديية الأساسي لإشراك الخلايا السرطانية فحسب، ولكن الخلايا المضيفة اللحمية بما في ذلك الضامة والخلايا البطانية. وعلاوة على ذلك، ورم الأوعية الدموية غير طبيعي مع زيادة نفاذية ^1. وبالتالي، تحديد كيفية الخلايا السرطانية، الضامة، والخلايا البطانية تتفاعل التوسط نفاذية الأوعية الدموية ودخول الوعاء الخلايا السرطانية في المكروية الورم الرئيسي المهم لورم خبيث التفاهم. يمكن فهم حركية نفاذية الأوعية الدموية، دخول الوعاء الخلايا السرطانية وآلية الإشارات الكامنة للتفاعلات متعددة الخلايا في الورم المكروية تقديم معلومات حاسمة في تطوير وإدارة العلاجات المضادة للسرطان.

وكانت الوسيلة الأساسية لدراسة الورم نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي قياس الأصباغ خارج الأوعية مثل ايفانز الزرقاء ^2، وارتفاع dextrans الوزن الجزيئي (155 كيلو دالتون)³ وfluorophore أو البروتينات المشع مترافق (بما في ذلك الزلال) ⁴ في نقطة زمنية محددة بعد حقن الصبغة. التطورات في المجهر، وقد مكنت النماذج الحيوانية والأصباغ الفلورية التصور من العمليات الخلوية ونفاذية الأوعية الدموية في الحيوانات الحية من خلال intravital المجهري ^5.

التصوير الحيوانات الحية مع الحصول على صور ثابتة، أو تسلسل قصيرة مرور الزمن على مدى عدة نقاط الوقت لا يسمح لفهم كامل لأحداث ديناميكية في المكروية الورم ^6،7. في الواقع، أظهرت ثابت الحصول على الصور على مدار 24 ساعة أن الورم الأوعية الدموية هو المتسرب، ولكن ديناميات نفاذية الأوعية الدموية لم يكن لوحظ ^6. وبالتالي، تمديد التصوير المستمر مرور الزمن تصل إلى 12 ساعة يلتقط حركية الأحداث ديناميكية في المكروية الورم.

يصف هذا البروتوكول استخدام الموسعة multiphot الوقت الفاصلعلى intravital المجهري لدراسة أحداث متعددة الخلايا الحيوية في المكروية الورم. وصفت أنواع خلايا متعددة في المكروية الورم مع الأصباغ عن طريق الحقن أو عن طريق استخدام الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن البروتينات الفلورية. عن طريق الوريد القسطرة ذيل الأصباغ الأوعية الدموية أو البروتينات يمكن حقن بعد بدء التصوير للحصول على البيانات الحركية من أحداث متعددة الخلايا في المكروية الورم. لتصوير الخلايا الحية يتعرض الورم الثديية من خلال إعداد الجراحي رفرف الجلد. يتم الحصول على الصور لمدة تصل إلى 12 ساعة باستخدام مجهر multiphoton مجهزة متعددة أنابيب مضخم (PMT) للكشف عن ^8. باستخدام الفلاتر المناسبة، خوارزمية الطرح تمكن 4 أجهزة كشف PMT للحصول على 5 إشارات الفلورسنت في المكروية الورم في وقت واحد ^9. عالية الدقة multiphoton حيوي داخلي المجهر يلتقط احد قرار خلية التصوير من التفاعلات ورم سدى في المكروية الورم، مما يؤدي إلى أفضل شnderstanding من نفاذية الأوعية الدموية وورم الخلايا دخول الوعاء ^10-13. على وجه التحديد، ممتدة التصوير حيوي داخلي كشفت محلية شديدة، عابرة أحداث نفاذية الأوعية الدموية التي تحدث بشكل انتقائي في مواقع التفاعل بين الخلايا السرطانية، والبلاعم والخلايا البطانية (كما هو موضح المكروية ورم من ورم خبيث، TMEM ^{14) (13).} وعلاوة على ذلك، يحدث دخول الوعاء الخلايا السرطانية فقط في TMEM ومكانيا وزمانيا ترتبط مع نفاذية الأوعية الدموية ^13. وقدم قرار خلية واحدة من القوى المحركة لهذه الأحداث من الممكن من خلال استخدام موسع الوقت الفاصل بين multiphoton المجهري للخلايا fluorescently المسمى في المكروية الورم.

Protocol

يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك موافقة مسبقة من كلية ألبرت أينشتاين للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. توليد Fluorescently الأورام إعتبر والضامة المرتبطة ورم

1. توليد الخلايا السرطانية التي fluorescently المسمى عبور الأصليين، والماوس وراثيا نموذج عفوية، الثديية السرطان حيث الماوس الثدي فيروس الورم محطة الطويلة تكرار يدفع التورام منتصف تي مستضد (MMTV-PyMT) مع الفئران المعدلة وراثيا مع الصحفيين الفلورسنت [أي، وتعزيز الفلورية الخضراء بروتين (EGFP)، وتعزيز البروتين سماوي فلوري (ECFP) أو Dendra2] ^8،9.
2. الضامة التسمية Fluorescently في الحيوانات PyMT مع fluorescently المسمى الخلايا السرطانية عن طريق عبور نماذج الماوس المعدلة وراثيا مع الصحفيين الفلورسنت محدد myeloid- وmacrophage- [أي MacGrالتابعين ¹⁵ أو الفئران MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP ^16].
3. بدلا من ذلك، تولد fluorescently المسمى الأورام من خلال زرع مثلي الخلايا fluorescently المسمى PyMT الورم (مسانج)، وخطوط خلايا سرطان الثدي البشرية أو الأورام الأولية المريض حقوق الإنسان مستمد (xenografts) ^11،17.
   1. زرع fluorescently المسمى الخلايا السرطانية في الفئران PyMT مسانج مع خلايا الدم النخاعي الفلورسنت المسمى بروتين لتوليد الحيوانات مع fluorescently المسمى الخلايا السرطانية وخلايا الدم النخاعي ^13.
4. ضخ 100 ميكرولتر من 10 ملغ / كغ الفلورسنت 70 كيلو دالتون ديكستران من الوريد (IV) الوريد الذيل إلى شديد الفئران جنبا إلى جنب نقص المناعة المكتسب (SCID) مع الأورام طعم أجنبي من خطوط الخلايا البشرية أو الأورام الأولية المستمدة من المريض إلى الضامة تسمية fluorescently السابقة 2 ساعة على بداية التصوير حيوي داخلي.

2. إعداد مجهر وإعداد التصوير

ملاحظة: يصف هذا الإجراء مجموعة المتابعةللتصوير حيوي داخلي على المجهر multiphoton ^8.

1. بدوره على جميع مكونات المجهر والليزر بما في ذلك أشعة الليزر ثنائي الفوتون وكشف عن.
2. بدوره على مربع التدفئة إلى 30 درجة مئوية إلى ما قبل الحارة المرحلة. هذه خطوة حاسمة للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية للحيوان.
3. للاستخدام على مكان مجهر مقلوب حسب الطلب المرحلة إدراج على المسرح المجهر. إدراج المخصص هو ورقة من 1/8 "الألومنيوم سميكة تشكيله لتناسب في الفضاء مرحلة إدراج ومع 1" قطر من خلال ثقب في مركز للتصوير.
   1. مسح مرحلة المجهر وإدراج المسرح مع 70٪ من الإيثانول والهواء الجاف.
   2. وضع قطرة ماء كبيرة على الهدف المجهر NA 20X، 1.05 في البقاء على اتصال بصري مع غطاء زجاجي.
   3. مكان غطاء زجاجي (# 1.5 سمك) عبر منفذ التصوير على إدراج المسرح المجهر. تأمين في مكان مع الشريط المختبر.
   4. استخدام لكمة ثقب لكمة 2 سم × 2 سم حفرةفي وسادة مطاطية مرنة ووضع وسادة مطاطية على المسرح المجهر مع ثقب في لوحة تتماشى مع ثقب في إدراج مرحلة المخصصة.

3. إعداد الذيل الوريد القسطرة والكواشف لحقن أثناء التصوير

1. قطع طول 30 سم من البولي إثيلين (PE) أنابيب.
2. باستخدام ملقط، نقل إبرة معدنية من 31 إبرة G ذهابا وإيابا حتى تقطع من تركيب البلاستيك.
3. باستخدام ملقط، إدراج نهاية حادة من الإبرة منفصلة في أنابيب البولي ايثيلين.
4. إدراج 31 G الإبرة في الطرف الآخر من الأنبوب PE.
5. حقنة ملء 1 سم مكعب مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) وأدخله في إبرة G 31 وطرد كل الهواء من الأنبوب والإبرة مع برنامج تلفزيوني. يستخدم برنامج تلفزيوني للحفاظ على ترطيب والأسمولية الدم ^9،18، ويمكن أيضا أن تستخدم المالحة لكن متساوي التوتر.
6. حقنة ملء 1 سم مكعب مع 200 ميكرولتر من 3 ملغم / كغم 155 كيلو دالتون ديكستران-tetramethylrhodamine (TMR) أو النقاط الكمومية لوضع العلامات الأوعية الدموية.
7. إعداد أي البروتينات عن طريق الحقن الأخرى مثل الإسوي حمض أميني 165 من نمو بطانة الأوعية الدموية عامل ألف (VEGFA ₁₆₅₎ في حقنة 1 سم مكعب ومكان على الجليد. ضخ 0.2 ملغ / كغ VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ في تركيز 0.05 ملغ / مل.

4. الإدراج في ذيل سكنى الوريد قسطرة

1. وضع الحيوان تحت التخدير باستخدام غرفة الاستقراء مع 5٪ الأيزوفلورين مع O ₂ مثل الغاز الناقل.
2. نقل الماوس إلى منصة الجراحية بمجرد تخدير بشكل كامل ولا يستجيب لقرصة أخمص قدميه.
3. فتح خط التخدير الأيزوفلورين إلى منصة الجراحية، إغلاق خط التخدير إلى غرفة الاستقراء ووضع مخروط الأنف على خطم الحيوان. تقليل الأيزوفلورين من 5٪ إلى 2.5٪.
4. تطبيق مرهم للعين للعيون من الماوس لمنع جفاف أثناء التخدير.
5. حرارة الحيوان تحت مصباح التدفئةل2 دقيقة إضافية لزيادة الدورة الدموية في الذيل مع تباطؤ دوران مع التخدير العميق.
6. تعقيم الوريد الذيل الفأر مع الايثانول 70٪.
7. إدراج غيض من إبرة G 31 من القسطرة التي شيدت في القسم 3 في الوريد الذيل الأفقي للحيوان، ودفع الإبرة في 2-3 ملم.
8. سحب على حقنة لرؤية الدم، وضمان القسطرة يتم وضعها في الوريد الذيل.
9. استخدام طول 1 سم من الشريط مختبر وضعت على الإبرة لعقد إبرة في مكان مواز إلى الوريد على طول الذيل.

5. الجلد رفرف إجراء جراحة لفضح ورم ثدي

1. مع الحيوان على منصة الجراحية مسحة الورم والسطح البطني مع الايثانول 70٪. ملاحظة: كما وصفها، لا يتم تنفيذ هذا الإجراء جو معقم و مطهر تماما. لجلسات التصوير الطويلة حيث العدوى يمكن أن تصبح عامل التباس، فمن المستحسن استخدام تقنية العقيم المناسبة.
2. باستخدام ستيريملقط جنيه، ورفع الجلد البطني ومع مقص العقيمة جعل شق تحت الجلد على طول خط الوسط بطني حوالي 1 سم في الطول. تجنب ثقب الغشاء البريتوني خلال شق.
3. خفض بلطف النسيج الضام ربط الغدة الثديية وورم بعيدا عن الصفاق لفضح ورم الثدي.
4. باستخدام مقص وملقط، وإزالة بلطف وقطع لفافة والدهون من سطح مكشوف من الورم مع المحافظة على سلامة الأوعية الدموية للورم وتقليل النزيف. هذه الخطوة حاسمة في الحفاظ على العمارة الورم والأوعية الدموية العرض من الورم.

6. إعداد الحيوان للفحص المجهري

1. نقل الحيوان إلى مرحلة التصوير قبل تحسنت مع الورم يتعرض ضعها على ساترة على إدراج المرحلة على الهدف المجهر للتصوير. الحرص على نقل قسطرة الوريد الذيل برفق مع الحيوان حتى لا طرد الإبرة.
2. المركز الرابعه التخدير مخروط الأنف على خطم الحيوان للحفاظ على مجموعة التخدير إلى 3٪ الأيزوفلورين.
3. وضع الحيوان بحيث يقوم الورم في ثقب في وسادة مطاطية ويجعل الاتصال مع ساترة الزجاج.
4. استخدام اثنين من منصات المطاط لعقد بلطف الورم في مكان واصلاحها إلى مرحلة المجهر مع الشريط مختبر للحد من الحركة خلال الحصول على الصور.
5. تملأ الغرفة من وسادة مطاطية مع برنامج تلفزيوني للحفاظ على النسيج المائية والحفاظ على اتصال بصري مع ساترة.
6. بدء مراقبة العلامات الحيوية للحيوان مع التحقيق الذي تجريه نبض مقياس التأكسج. نعلق جهاز استشعار كليب في الفخذ من الحيوان. بدلا من ذلك طوق الذي تم تكوينه لتناسب حول الرقبة يمكن استخدامها.
7. وضع مربع التدفئة أكثر من الحيوان للحفاظ على 30 ° C ^20.
8. ببطء خفض مستوى الأيزوفلورين إلى 0.5-1٪ للحفاظ على التخدير والحفاظ على تدفق الدم.

7. الحصول على الصور وحقن Fluorescوالأنف والحنجرة الأصباغ وحقن البروتينات

1. عن طريق التركيز المجهر العدسة على الخلايا السرطانية الفلورسنت على سطح الورم.
2. تحديد مساحة من الاهتمام من خلال ايجاد مناطق مع تدفق الأوعية الدموية. اختيار مساحة من الاهتمام مع تدفق الأوعية الدموية أمر بالغ الأهمية لتقييم ورم الأوعية الدموية.
3. مرة واحدة وقد تم اختيار المنطقة ذات الاهتمام تبديل المجهر في وضع التصوير multiphoton.
4. تعيين الحدود العليا والدنيا للض سلسلة. تعيين الحد الأعلى للض سلسلة باستخدام الضابط التركيز لتحريك الهدف إلى الموقع بداية المطلوب والنقر على زر Z موقف "الأعلى". تحديد الحد الأعلى للض سلسلة من خلال وضع تصور شبكة الألياف الكولاجين في سطح الورم في قناة الجيل الثاني التوافقي (SHG) ومراقبة عند أي خلايا ولكن فقط ألياف الكولاجين مرئية.
   1. تعيين الحد الأدنى للض سلسلة عن طريق تحريك الهدف إلى عمق التصوير المطلوب (typicaLLY 50-150 ميكرون)، والنقر على موقف Z زر "أسفل".
   2. تعيين حجم الخطوة عن طريق كتابة القيمة المطلوبة في حقل حجم الخطوة. تحديد حجم الخطوة بناء على اعتبارات لقرار واكتساب الوقت (عادة ما تستخدم 2 ميكرون عالية الدقة إعادة الإعمار 3D و 5 ميكرون خلاف ذلك).
5. تعيين الفاصل الزمني الفاصل بين طريق التحول إلى لوحة الوقت الفاصل بين ودخول الفاصل الزمني المطلوب في حقل الوقت الفاصل بين. لقرار الزمني الأمثل تعيين الفاصل الزمني إلى 0 ثانية عن التصوير المستمر. ملاحظة: للحصول الطويل الوقت الفاصل بين التصوير فمن المستحسن تعيين الفاصل الزمني إلى 10 ثانية بين الاستحواذ لتجديد السائل الغمر موضوعي.
6. مرة واحدة وقد تم تحديد المعلمات للتصوير، حقن ببطء 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR.
   1. إزالة المحاقن مع برنامج تلفزيوني في القسطرة الوريد الذيل واستبدالها مع حقنة تحتوي على 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في لىشمال شرق.
   2. حقن ببطء 155 كيلو دالتون ديكستران-TMR في الماوس، مع الحد الأقصى لحجم 200 ميكرولتر، واستبدال المحاقن مع حقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني. خطوة حاسمة: إجراء الحقن ببطء واتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الحصول على حل خارج الوريد.
7. بدء الاستحواذ على Z كومة الوقت الفاصل بين التصوير من خلال النقر على Z-ستاك وأزرار الوقت الفاصل بين لخفض لهم ومن ثم النقر على زر التسجيل.
8. إن أعدت dextrans الفلورسنت أخرى، أي ثيوسيانات 10 كيلو دالتون ديكستران-فلوريسئين (FITC)، أو البروتينات، أي VEGFA _165، مقدما، ضخها بعد بدء الحصول على الصور لفي = 0 بداية دقيقة.
   1. إزالة المحاقن مع برنامج تلفزيوني في الوريد القسطرة الذيل واستبدال مع حقنة تحتوي على 10 كيلو دالتون ديكستران-FITC أو VEGFA ₁₆₅ مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الخط.
   2. حقن ببطء عن طريق الحقن في الماوس عن طريق القسطرة الوريد الذيلواستبدال الحقنة مع حقنة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
9. كل 30-45 دقيقة، وضخ ببطء 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو المالحة للحفاظ على الماء للحيوان.

8. القتل الرحيم

1. عند انتهاء الحصول على الصور، الموت ببطء الحيوان.
   1. زيادة الأيزوفلورين إلى 5٪.
   2. حفاظ على الحيوانات أقل من 5٪ الأيزوفلورين حتى 30 ثانية بعد أن يتوقف عن التنفس وإزالة الحيوان من المرحلة.
   3. أداء خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم الكامل.

تجهيز 9. صورة

1. الحصول على صور في ملفات TIFF 16 بت لكل قناة على حدة في كل نقطة زمنية وحفظ بالتتابع.
2. أداء فصل التداخل الطيفي (أي GFP وCFP)، والقضاء على الانحراف س ص وجيل من افلام من متواليات الوقت الفاصل بين استخدام أساليب أنشئت في ImageJ ^9. أداء إعادة بناء سطح 3D من الصور عالية الدقة ¹³.

النتائج

تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي المجهري تمكن واحد قرار خلية التصوير من عمليات متعددة الخلايا في المكروية الورم. بواسطة خلايا fluorescently وضع العلامات الورم، الضامة، ومساحة الأوعية الدموية، وتصور شبكة الألياف الكولاجين باستخدام الثانية إشارة الجيل ?...

Discussion

التفاعلات الخلوية التي تحدث بشكل عفوي في المكروية الورم يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في الحركة الخلايا السرطانية ودخول الوعاء. عالية الدقة حيوي داخلي التصوير من الأنسجة السرطانية الحية يسمح التصور من ديناميات متعددة الخلايا التي يمكن أن تكون ^10،13،24 عابرة للغاية. ن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch