JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Abstract

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الإنسان الدورة الدموية وجندت بسرعة إلى مواقع التهابات. فتيلة هو الحدث الحاسم الذي يعزز وظيفة أكلة العدلات. على الرغم من أن دراسات مستفيضة وقد كشفت وجود وأهمية فتيلة العدلات خلال العدوى والإصابة، يعني من تصور هذه العملية في الجسم الحي كانت غير متوفرة. بروتوكول المقدمة يتيح رصد عملية ديناميكية من العدلات فتيلة في الحيوانات التي تعيش من خلال الجمع بين ثلاث منهجيات: 1) عن dsRed إشارة مراسل - تستخدم كمقياس للفتيلة 2) في الجسم الحي العدلات وسم - تحقيق ذلك عن طريق حقن مضان مترافق مكافحة اللمفاويات مستضد 6G (Ly6G) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) و 3) التصوير متحد البؤر حيوي داخلي. وتشارك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول: التي يسببها oxazolone الماوس التهاب الجلد الأذن، والتخدير المناسب للحيوانات، تكرار الحقن المضادة للLy6G ماب، والسابقention التركيز الانجراف أثناء التصوير. على الرغم من أن لوحظ عدد قليل من القيود، مثل الحد من وقت التصوير المستمر (~ 8 ساعات) في الماوس واحد وتسرب ثيوسيانات-ديكستران فلوريسئين من الأوعية الدموية في حالة التهابات، ويوفر هذا البروتوكول إطارا أساسيا للتصوير حيوي داخلي من السلوك معبي العدلة وظيفة، والتي يمكن بسهولة أن توسعت لفحص الخلايا المناعية الأخرى في نماذج التهاب الماوس.

Introduction

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة وقصيرة الأجل في الدورة الدموية. كانوا يجندون بسرعة إلى مواقع الإصابة أو الإصابات، حيث أنها تخدم البالعات كما المهنية من خلال الافراج عن الأوكسجين والنيتروجين وسيطة رد الفعل جنبا إلى جنب مع حبيبات تحتوي على الببتيدات المضادة للميكروبات والبروتياز 1. خلال تجنيدهم، العدلات هي "تستعد" من قبل مختلف وكلاء بما في ذلك المنتجات الميكروبية، chemoattractants، والسيتوكينات الالتهابية، مما أدى إلى تعزيز ملحوظ وظيفة بلعمية لدى وصوله إلى موقع الالتهاب 2. وقد تم دراسة آليات فتيلة العدلات على نطاق واسع في المختبر 3،4. ومع ذلك، لم يكن رصد دينامية العملية المجراة يمكن حتى الآن.

في الآونة الأخيرة، أصبح التصوير حيوي داخلي تقنية هامة لتصور وقياس ديناميكية الخلوية من العمليات البيولوجية في الكائنات الحية. Intraviتل التصوير لا يمكن أن يؤديها من خلال التقليدية-فوتون واحد الإثارة المجهر (على سبيل المثال، متحد) أو نهج multiphoton المجهري 5. مع مرور الوقت، وقد تم تحقيق تحسينات كبيرة في هذه التقنية تمكن زيادة دقة وضوح الصورة، وتحسين عمق التصوير، وانخفاض photodamage الأنسجة، وتعزيز 6،7 تثبيت الصورة. ونظرا إلى قدرة فريدة من نوعها لتمكين التصور الدينامي للهجرة الخلوية والتفاعل مع مرور الوقت، وقد تم تطبيق intravital المجهري نطاق واسع لمختلف مجالات الدراسة في علم المناعة 8. التصوير حيوي داخلي يمكن المناعة لفهم أفضل وتأطير الاستجابات المناعية في كل من المستوى الخلوي والجزيئي في العيش النماذج الحيوانية.

وقد وفرت التطورات الحديثة في مجال المعدلة وراثيا وكذلك تدق في الفئران مراسل أدوات مفيدة لرصد السلوكيات الحيوية العدلات في الحيوانات الحية. الليزوزيم M مدفوعة المروج تعزيز البروتين الفلوري الأخضر تدق فيوقد استخدمت الفئران على نطاق واسع لوصف الحركة من العدلات، وحيدات، والضامة خلال عمليات الالتهابات المختلفة بما في ذلك التسرب، والعدوى البكتيرية، والتهاب عقيم 9-15. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت الفئران المعدلة وراثيا معربا عن حشوية مضان بالرنين نقل الطاقة جهاز الاستشعار البيولوجي في دراسة أنشطة المتعادلة كيناز mitogen خارج الخلية الخاضعة للوائح وبروتين كيناز وداخل الأمعاء الملتهبة 16. نموذج الفئران مع خصوصية عالية للتعبير عن مضان في العدلات هو الضربة القاضية في الماوس صلصة الطماطم، التي تنتج لجنة المساواة العرقية recombinase فضلا عن tdTomato بروتين فلوري، الذي يقترن نفسها في التعبير من اللمفاويات مستضد 6G (Ly6G) 17. وقد أثبتت التصور العدلات Ly6G التي تعاني من نقص عبر هذا النموذج أن هذه الخلايا تمارس وظيفة عادية في مجموعة متنوعة من السياقات التهابات الجسم الحي معقمة أو المعدية في. الفئران المعدلة وراثيا معربا عن عن dsRed الفلورسنت صrotein الجينات تحت سيطرة الماوس interleuikin-1β استخدمت (IL-1β) المروج (pIL1-عن dsRed) لتصور السلوكيات متحركة من الخلايا المنتجة IL-1β - يعتقد انها تضم ​​العدلات، وحيدات التهابات، وتفعيل الضامة - الناشئة في التهاب الجلد 18.

في الجسم الحي العلامات يمكن أن تكون نهجا بديلا لتتبع سلوكيات الخلوية والجزيئية العدلات في الأنسجة الملتهبة. بعد الحقن في الوريد بجرعات منخفضة من fluorescently المسمى مكافحة GR-1 ريتوكسيماب (ماب)، شلال توظيف GR-1 + العدلات وقد تصور في الآفات الجلدية الماوس المصابين المكورات العنقودية الذهبية (19). وفي الجسم الحي إدارة تقارن تحتوي على streptavidin- مترافق 705 نقاط الكم نانومتر والمعقدة البيروكسيديز مكافحة Ly6G ماب تسمية تحديدا العدلات المتداولة 20. وعلاوة على ذلك، الإلتقام هذه تقارن في neutrophالحويصلات ايل تتيح تتبع النقل حويصلة عالية السرعة في العدلات المهاجرة في الخلالي. المجراة وضع العلامات مع الأجسام المضادة مضان مترافق ضد ف selectin بروتين سكري يجند-1 (PSGL-1)، L-selectin (CD62L)، إنتغرين αM (CD11b ) وchemokine (CXC عزر) مستقبلات 2 (CXCR2) في نموذج التهابات الناجمة عن TNFα وإجمال الآليات التنظيمية في اللعب أثناء التهاب في وقت مبكر 21. العدلات الاستقطاب تبرز uropods PSGL-1-التخصيب للتفاعل مع CD62L الحاضر على الصفائح الدموية تفعيلها، مما أدى إلى إعادة توزيع CD11b وCXCR2، المستقبلات التي تدفع الهجرة العدلة والشروع في التهاب.

IL-1β هي واحدة من الجينات التوقيع الذي ارتقى في العدلات معبي 22. في الفئران مراسل pIL1-عن dsRed، وإشارات مضان عن dsRed (أي.، تفعيل المروج IL-1β) ترتبط بشكل إيجابي مع IL-1β التعبير مرنا وإنتاج بروتين IL-1β. <سوب> 18 لمراقبة عملية فتيلة العدلات، وضعت طريقة intravital المجهري تنطوي على تحريض التهاب الجلد مع oxazolone (OX) في نموذج الفأر pIL1-عن dsRed التالية في الجسم الحي وسم العدلات مع مضان مترافق مكافحة Ly6G ماب. عبر هذا النموذج، فمن الممكن لدراسة سلوك وظيفة من العدلات معبي في النماذج الحيوانية من مختلف الأمراض والاضطرابات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة توليدو.

1. Phenotyping من pIL1-عن dsRed الفئران

يتم إنشاؤها النسل عن طريق تربية متخالف الفئران pIL1-عن dsRed مع البرية من نوع الفئران (WT) C57BL6: ملاحظة. تعتبر ثلاثة إلى أربعة أسابيع الجراء القديمة جاهزة للphenotyping. نزيف تحت الفك السفلي من الفئران يتبع بروتوكول المعمول به مع تعديلات طفيفة 23.

  1. عزل خلايا الدم البيضاء من الدم الكامل من الجراء ماوس
    1. إضافة 20 ميكرولتر من الهيبارين إلى كل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    2. الحصول على الجرو واحد من القفص. تسجيل بطاقة تعريف من الجرو. ليس مطلوبا لتخدير الجراء قبل جمع الدم من الوريد تحت الفك السفلي.
    3. عقد الجرو من قبل القفا الرقبة ويخترق الوريد تحت الفك السفلي في الالبريد الخد الحقيبة باستخدام مشرط 5 مم. تطبيق قوة كافية لخلق ثقب صغير، بحيث قطرات من الدم تحلب من وجهة الاختراق. استخدام إبرة جديدة لكل الجرو.
    4. جمع 3-5 قطرات من الدم في الفئران الوليدة في أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على الهيبارين. تنظيف الموقع ثقب والضغط لتسهيل الارقاء.
    5. وضع الجرو في القفص الجديد ومراقبة لمدة 30 دقيقة قبل أن تعود القفص لمنشأة الحيوان.
    6. جمع الدم من فئران بالغة من النمط الظاهري المعروف الضوابط الإيجابية والسلبية.
    7. إضافة 500 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء عازلة الناشر لكل أنبوب، أنابيب دوامة، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة على الجليد.
    8. ببطء إضافة 400-500 ميكرولتر من الجنين المصل البقري (FBS) تحت تعليق خلية في كل أنبوب. واجهة واضحة يمكن ملاحظتها بين تعليق خلية الطبقة العليا والطبقة السفلى من FBS.
    9. أنابيب غطاء وعينات الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 5 دقائق.
    10. كرر الخطوات من 1.1.7 - 1.1.9 الفراءذر إزالة خلايا الدم الحمراء. لا أكرر إذا تحلل كافية للمرة الأولى. وينبغي أن يكون بيليه الصعب أن نتبين بعد الطرد المركزي.
  2. lipopolysaccharide في (LPS) تحفيز والثقافة
    1. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من المعهد التذكاري الكامل روزويل بارك (RPMI) 1640 المتوسطة.
    2. نقل تعليق خلية إلى التدفق الخلوي أنبوب.
    3. جعل LPS العمل الحل عن طريق خلط 10 ميكرولتر من LPS حل سهم (1 ملغ / مل) مع 990 ميكرولتر من اكتمال المتوسط ​​1640 RPMI.
    4. إضافة 20 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل LPS حل العاملة إلى 200 ميكرولتر من تعليق خلية.
    5. أنابيب غطاء فضفاض واحتضان عينات لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  3. تحليل التدفق الخلوي
    1. فتح البرنامج الحصول على البيانات لالتدفق الخلوي. إعداد قالب شراء مسبق لعينة الاستحواذ.
    2. انقر فوق الأداة دوت المؤامرة في لوحة الأدوات. رسم FO مبعثر rward (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة. تعيين المعلمات الجهد FSC والتعاون بين بلدان الجنوب إلى مقياس خطي.
    3. اختيار أقل عتبات FSC والتعاون بين بلدان الجنوب المسموح به من قبل الكريات. تطبيق عتبات 200 و 50 لFSC والتعاون بين بلدان الجنوب، على التوالي.
    4. ضمن FSC مقابل SSC مؤامرة، رسم G1 البوابة التي تضم حيدات، والمحببة، والخلايا الجذعية، ويستثني الحطام، وخلايا الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية.
    5. انقر فوق الأداة الرسم البياني في لوحة الأدوات. رسم بياني FL2 (قناة مضان الحمراء). استخدام عينة السيطرة السلبية لتحديد خط الأساس للإشارات FL2 وعينة مراقبة إيجابية لرسم بوابة لتشمل جميع الأحداث الإيجابية عن dsRed.
    6. على لوحة FLUIDICS السيطرة على الكريات، تعيين وضع السوائل إلى "RUN" ومعدل التدفق إلى "مرحبا" (حوالي 60 ميكرولتر / دقيقة). الحصول على 10000 الأحداث لكل عينة.
    7. تحديد الجرو النمط الظاهري عن طريق قياس النسبة المئوية للخلايا إيجابية عن dsRed من البوابة G1.

الطبقة = "jove_title"> 2. تحريض التهاب الجلد في pIL1-عن dsRed الفئران

  1. تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن كوكتيل مخدر تحتوي على 100 ملغم / كغم من الكيتامين، 10 ملغ / كغ زيلازين، و 1 ملغ / كغ آسيبرومازين. الفئران تخدير كاف لا تظهر انسحاب مخلب هند لقرصة أخمص قدميه.
  2. تطبيق كريم الشعر إزالة إلى السطح الظهري من كلتا الأذنين من الفأرة. انتظر 30 ثانية إلى 1 دقيقة. مسح سطح الأذن مع القطن المبللة بالماء والسماح للهواء الجاف.
  3. قياس سمك الأذن باستخدام ميكرومتر واستبدال الماوس في قفص منفصل. نلاحظ حتى الشفاء من التخدير (~ 15-30 دقيقة). لحل التهاب الجلد الناجم عن المنتج إزالة الشعر، والسماح الماوس للراحة لمدة 3 أيام قبل إجراء مزيد من التجارب للخروج.
  4. إعداد 1.25٪ (ث / ت) OX عن طريق إذابة 16.7 ملغ من OX في 1 مل الأسيتون وخلط 750 ميكرولتر من OX حل / الأسيتون مع 250 ميكرولتر من زيت الزيتون. يعد حل السيارة عن طريق خلط 750 ميكرولتر من الأسيتون مع 250 &# 181؛ ل من زيت الزيتون.
  5. إعادة تخدير الماوس عن طريق الحقن الملكية الفكرية من كوكتيل مخدر (2.1). قياس سمك الأذن كما كان من قبل.
  6. تطبيق 12.5 ميكرولتر من 1.25٪ OX على كل جانب من الأذن اليمنى. تطبيق 12.5 ميكرولتر من الأسيتون / الزيتون حل مركبة النفط على كل جانب من الأذن اليسرى.
  7. حافظ على الماوس فصل من قفص زملاءه حتى تعافى تماما لمنع اهانة للآذان من قبل الفئران الأخرى، ثم استبدال الماوس في قفص الأصلي والعودة إلى منشأة سكنية الحيوان.
    ملاحظة: إزالة الشعر قد يؤدي إلى التهاب الجلد الطفيفة التالية تغيير سمك الأذن. سيتم حل هذا الالتهاب البسيط بعد 3 أيام أكده سمك الأذن العادية. بعد التطبيق الموضعي لمدة 24 ساعة، وتبين آذان المعالجة OX معنوي (p <0.01) تورم مقارنة حل مركبة آذان تعامل وحدها.

3. صفها من العدلات في pIL1-عن dsRed الفئران

ملاحظة: في وضع العلامات المجراة من العدلات من الجرعات المنخفضة وluorescence-مترافق العدلة محددة ماب يتبع البروتوكول وضعت مؤخرا 19. يتم إجراء الحقن الرجعية المدارية وفقا لبروتوكول المعمول به مع بعض التعديلات 24.

  1. إعداد مكافحة Ly6G-ماب العمل الحل عن طريق تمييع 10 ميكرولتر من 0.5 ملغ / مل اليكسا فلور 647 مترافق مكافحة Ly6G ماب (استنساخ 1A8) في 90 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  2. نقل 100 ميكرولتر من محلول العمل لمكافحة Ly6G ماب (50 ميكروغرام / مل) في حقنة الأنسولين U-100 مع إبرة 28 قياس.
  3. تخدير الكبار pIL1-عن dsRed الماوس عن طريق الحقن الملكية الفكرية للكوكتيل مخدر موضح سابقا (2.1). ضع الماوس البطن تخدير أسفل على لوحة العمل نظيفة.
  4. الضغط النزولي لطيف على ظهري الجلد وبطني لعين واحدة الماوس لتبرز جزئيا مقلة العين من مأخذ.
  5. وضع بعناية الإبرة، شطبة أسفل، في زاوية من حوالي 30 درجة في الموق الإنسي في الرجعية المداريالجيوب الأنفية.
    ملاحظة: يمكن للمشغل يشعر الضغط والاختراق ومقاومة بالارتياح بمجرد إدراج الإبرة في الجيوب الأنفية.
  6. ببطء وسلاسة حقن 100 ميكرولتر من مكافحة Ly6G ماب الحل (5 ميكروغرام ماب / الماوس / الحقن) في الماوس عن العمل. إزالة الإبرة بسرعة. وهناك كمية صغيرة من نزيف يشير إلى نجاح الحقن.
  7. تطبيق على الفور 1.25٪ OX وحل السيارة على اليمين وآذان الماوس الأيسر.
  8. بعد 8 ساعات، ويدير 100 ميكرولتر من مكافحة Ly6G-ماب حل الطازجة عمل (5 ميكروغرام ماب / الماوس / الحقن) عن طريق الحقن الرجعية المدارية في نفس الماوس.
  9. لتصور الأوعية الدموية، وعلى الفور قبل التصوير، وإدارة 100 ميكرولتر من 30 ملغ / مل فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -conjugated ديكستران (150 كيلو دالتون) من خلال حقن الرجعية المدارية.

4. حيوي داخلي التصوير من العدلات الاشعال في PIL-1-عن dsRed الفئران

  1. تخدير الفأر مع حقنة IP كوكتيل مخدر (2.1).0؛ تطبيق مرهم البيطرية للعيون الماوس لمنع جفاف بينما تحت التخدير للتصوير.
    1. إعداد 1 مل نصف جرعة كوكتيل مخدر عن طريق تمييع 500 ميكرولتر من كوكتيل مخدر الأصلي مع حجم مساو من برنامج تلفزيوني.
    2. نقل نصف جرعة كوكتيل مخدر إلى 1 مل المحاقن مع إبرة قياس فراشة 27.
    3. إدراج إبرة فراشة في البطن الماوس البريتونى وإصلاح جناح فراشة في البطن عن طريق تسجيل.
  2. وضع ساترة الزجاج في مركز للمرحلة التصوير. الشريط حواف ساترة ليثبت في مكانه.
  3. وضع قطرة من برنامج تلفزيوني على السطح البطني من الأذن الماوس وكذلك على ساترة.
  4. تخدير موضع الماوس مع الأذن على مدى ساترة. جبل غيض من الأذن، الجانب الظهري أسفل، من خلال يقحم الأذن بين ساترة وشريحة زجاجية، التي عقدت أيضا في مكان عن طريق الشريط.
  5. تشغيل متعدد الليزر مضان المجهر متحد البؤر وكل الإلكترونية ذات الصلةquipment. إطفاء الأنوار الغرفة لتقليل التعرض للضوء المحيط.
  6. فتح البرنامج الحصول على الصور. حدد قنوات ليزر للكشف عن الأصباغ الفلورية في القائمة قائمة صبغ.
  7. ضبط التركيز على الجلد الأذن ملتهبة من خلال رصد إشارات خضراء من الأوعية الدموية والإشارات الحمراء من عن dsRed + الخلايا من خلال العدسة.
  8. إجراء فحص سريع مع سرعة المسح الضوئي من 2 ميكرو ثانية / بكسل، والقرار 512 × 512 بكسل. حدد pseudocolor لكل قناة في القائمة عرض لايف. ضبط مقبض التركيز لوضع نهاية وبداية موقع المسح.
  9. القيام بمسح بطيئة مع سرعة المسح الضوئي من 4-8 μsec / بكسل ودقة 800 × 800 أو 1024 × 1024 بكسل. ضبط الجهد العالي، واكتساب، وتعويض على كل قناة على حدة لتحقيق أقصى قدر من شدة الاشارات مع تجنب التشبع (بكسل الحمراء). ينبغي أن يكون هناك سوى عدد قليل من بكسل الحمراء في كل قناة.
  10. إنشاء مجموعات صورة ثلاثية الأبعاد عن طريق المسح الضوئي عشره جلد الأذن تبدأ بشكل سطحي في الطبقة القرنية والتقدم نحو الانخفاض مع س، ص، كميات ض من 317 ميكرون × 317 ميكرون × 30 ميكرون (الهدف 40X)، 635 ميكرون × 635 ميكرون × 30 ميكرون (الهدف 20X)، أو 1270 ميكرون × 1270 ميكرومتر × 50 ميكرون (الهدف 10X) في 2 ميكرون ض الخطوات.
    ملاحظة: الطبقة القرنية هي الطبقة الخارجية من البشرة، ويمكن بسهولة المترجمة استنادا إلى إشارة قوية لتألق ذاتي.
  11. في تجارب التصوير الوقت الفاصل، سجل صور ثلاثية الأبعاد كل 2 أو 4 دقائق لمدة تصل إلى 8 ساعات.
  12. بشكل متقطع، كما يبدأ الماوس للتعافي من التخدير، لاحظت على أساس الملاحظة من شعيرات الوخز، وإدارة 5-10 ميكرولتر من نصف جرعة التخدير كوكتيل من خلال إبرة فراشة.
    ملاحظة: كن حذرا من جرعة التخدير - جرعة زائدة قد تؤدي إلى وفاة الماوس. بدلا من ذلك، يمكن تطبيق التخدير استنشاق في وعاء على الماوس للتخدير على المدى القصير ويمكن أن تستخدم مخروط الأنف للتصوير على المدى الطويل.
  13. إزالة الماوس تخدير من المرحلة عندما التصوير كامل. فصل الشريط وإزالة فراشة إبرة من بطن الفأر. عودة الماوس إلى قفص منفصل في منشأة سكنية الحيوان.
    ملاحظة: للحصول على التصوير على المدى القصير (<1 ساعة)، والفئران يتعافى تماما من التخدير بسرعة في 1-3 ساعة. للتصوير على المدى الطويل (~ 8 ساعات)، الفئران على التعافي ببطء، مع فترة نقاهة نموذجية من 12-16 ساعة. وبالتالي، فمن المستحسن إدارة المياه عن طريق الفم على الأقل عدة مرات خلال فترة النقاهة لمنع الجفاف الشديد.
  14. عملية قواعد البيانات والتصوير، وتتبع الخلايا الفردية، وتوليد مسارات الهجرة، وحساب يكون الاتجاه والسرعة للهجرة الخلية باستخدام صورة برامج التحليل 25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم تنفيذ فحص pIL1-عن dsRed الفئران على أساس المظهرية عن dsRed إشارة مضان التي تنتجها الكريات البيض في الدم الطرفية الخاصة بهم باستخدام التدفق الخلوي. ومن المعروف LPS تحفيز للحث على إنتاج IL-1β في خلايا الدم النخاعي بما في ذلك العدلات، وحيدات، والخلايا الجذعي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

والهدف من هذه الدراسة هو تطوير التكنولوجيا لرصد عملية فتيلة العدلات في الحيوانات الحية، التي لم يتم الوفاء بها من خلال التقنيات المتاحة حاليا. ولتحقيق هذا الهدف، نفذت ثلاث منهجيات محددة: 1) تحريض التهاب الجلد في IL-1β عن dsRed الفئران مراسل يحركها المروج كمقياس للفتيلة، 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have no financial conflicts of interest.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Heparin sodiumAPP PharmaceuticalsNDC 63323-540-31
ACK lysing bufferLonza10-548E
Fetal bovine serumSigma-AldrichF0926
LipopolysaccharidesSigma-AldrichL4391
Ketamine hydrochlorideHospiraNDC 0409-2051-05
XylazineLLOYD LaboratoryNADA #139-236
AcepromazineBoehringer IngelheimANADA 200-361
Hair-removal creamChurch & Dwight
AcetoneFisher ScientificA16P4
OxazoloneSigma-AldrichE0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibodyBioLegend127610
U-100 insulin syringe with 28 G needleBD329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDaSigma-Aldrich74817
Butterfly infusion set (27 G needle)BD387312
FACSCalibur cytometerBD
CellQuest Pro softwareBD
Confocal microscopeOlympusFV1000
Metamorph SoftwareUniversal Imaging

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112 intravital

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved