جيل من الخلايا الجذعية المستحثة-المحفزة عن طريق Synoviocytes الخلايا الليفية مثل المعزولة من المفاصل من التهاب المفاصل الروماتويدي المرضى

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات البشرية من synoviocytes تشبه الخلايا الليفية المستمدة من المريض، وذلك باستخدام نظام lentiviral دون الخلايا المغذية.

Abstract

الخلايا الجسمية الناضجة يمكن عكسها إلى المحفزة تشبه الخلايا الجذعية دولة باستخدام مجموعة محددة من العوامل برمجة. لقد ولدت العديد من الدراسات التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) من مختلف أنواع الخلايا الجسدية من قبل transducing أربعة عوامل النسخ ياماناكا: Oct4، Sox2، Klf4 وج. Myc على. تبقى دراسة iPSCs في طليعة من الأبحاث البيولوجية والسريرية. على وجه الخصوص، iPSCs المريض محددة يمكن أن تستخدم كأداة رائدة لدراسة البيولوجيا المرضية المرض، منذ iPSCs يمكن أن يتسبب من الأنسجة من أي فرد. التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو مرض التهابي مزمن، مصنفة حسب تدمير الغضروف والهيكل العظمي في مفصل. تضخم الزليلي هي واحدة من الأسباب الرئيسية أو الأعراض التي تؤدي إلى هذه النتائج في التهاب المفاصل الروماتويدي. Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي الخلايا المكونة الرئيسية في الغشاء الزليلي التصنع. FLSs في مفصل تتكاثر دون حدود، في نهاية المطاف غزو cartil المجاورةالعمر والعظام. حاليا، الغشاء الزليلي التصنع يمكن إزالتها إلا عن طريق إجراء العمليات الجراحية. يتم استخدام الغشاء الزليلي إزالة للبحث RA كمادة يعكس حالة التهاب المفصل. كما لاعبا رئيسيا في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي، FLSs يمكن استخدامها كمادة لتوليد والتحقيق في iPSCs من مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي. في هذه الدراسة، استخدمنا FLSs لمريض التهاب المفاصل الروماتويدي لتوليد iPSCs. باستخدام نظام lentiviral، اكتشفنا أن FLSs يمكن أن تولد RA المريض محددة التوجيهية. وiPSCs الناتجة عن FLSs يمكن مواصلة استخدامها كأداة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لالتهاب المفاصل الروماتويدي في المستقبل.

Introduction

الخلايا الجذعية المحفزة هي منصة الجيل القادم في مختلف المجالات السريرية والبيولوجية. وهي أداة الواعدة التي يمكن استخدامها في النمذجة المرض، وفحص المخدرات، والعلاج الطبي على التجدد. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) بشكل رئيسي إلى دراسة وفهم الخلايا المحفزة. ومع ذلك، معزولة عن تدمير الكيسة الإنسان، وترتبط hESCs مع العديد من المخاوف الأخلاقية. في عام 2007، والدكتور شينيا ياماناكا وفريقه عكس عملية برمجة الخلية وتطوير الخلايا الجذعية من البالغين البشري الخلايا الجسدية ^1،2. وبالتالي، فخلافا hESCs، التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) يمكن أن تتولد من الخلايا الجسمية الناضجة، وتجنب العقبات الأخلاقية.

عادة، يتم إنشاؤها iPSCs قبل تسليم أربع جينات الخارجية: Oct4، Sox2، Klf4، وج. Myc على. يتم تسليم هذه العوامل ياماناكا أصلا باستخدام أنظمة lentiviral وفيروسات. وقد استمدت هذه iPSCs الأولى من الماوس جسدية جملتعلمي اللغة اإلنكليزية ^3. بعد ذلك، تم تطبيق هذه التقنية لالليفية الجلدية الإنسان ^1،2. دراسات لاحقة إنشاء بنجاح iPSCs من مصادر مختلفة، مثل البول ^4، والدم ^5،6، الكيراتينية ^7، والعديد من أنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك، هناك بعض الخلايا الجسدية التي لم يتم استخدامها في إعادة برمجة، وفحص إمكانيات إعادة برمجة مختلف أنواع الخلايا من أنسجة معينة في حالة المرض، لا تزال هناك حاجة.

التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو المرض الذي يمكن أن يصيب جميع المفاصل ويؤدي إلى الظروف الذاتية في الأجهزة الأخرى. RA يصيب حوالي 1٪ من البالغين في العالم المتقدم. وهو مرض شائع نوعا ما، وانتشاره يزيد كل سنة ^8. ومع ذلك، RA من الصعب تحديد في المراحل المبكرة وoncebone تدمير يحدث هناك أي علاج يمكن أن استرداد الضرر. وعلاوة على ذلك، نجاعة الأدوية تختلف من مريض لآخر، وأنه من الصعب التنبؤ مسعفالمعهد الوطني للإحصاء ما هو مطلوب. لذلك، هناك حاجة إلى تطوير طريقة فحص المخدرات، ومطلوب مادة الخلية التي يمكن أن تعكس ظروف RA.

Synoviocytes تشبه الخلايا الليفية (FLSs) هي مشاركا نشطا الخلوي في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي ^9،10. توجد FLSs في بطانة باطنة الزليلي بين الكبسولة المشتركة وتجويف، الذي يشار إليه أيضا باسم الغشاء الزليلي. من خلال دعم الهيكل المشترك وتوفير المواد الغذائية للغضروف المحيطة بها، FLSs عادة ما تلعب دورا حاسما في وظيفة مشتركة والصيانة. ومع ذلك، FLSs في الاتحاد الإقليمي لها النمط الظاهري الغازية. RA FLSs يكون النمط الظاهري للسرطان مثل، في نهاية المطاف تدمير العظام المحيطة بها من انتشار لانهائي ^10. مع هذه الخاصية الفريدة، FLSs يمكن استخدامها كمادة الواعدة التي يمكن أن تعكس البيولوجيا المرضية من التهاب المفاصل الروماتويدي. ومع ذلك، ونادرا ما يتم إنتاج هذه الخلايا، والظواهر خلية يغير مثل خلايا تذهب من خلال العديد من المقاطع في في المختبر الظروف. وبالتالي، فإنه يمكن أن يكون معقدا لاستخدام RA FLSs كأداة التي يمكن أن تمثل حالة المريض.

نظريا، يمكن RA iPSCs المستمدة من المريض (RA-iPSCs) تصبح أداة مثالية لفحص المخدرات وإجراء مزيد من البحوث. iPSCs ولدت لديها قدرة التجديد الذاتي ويمكن الحفاظ على وتوسعت في المختبر. مع تعدد القدرات، وهذه الخلايا يمكن أن تكون متباينة في ناضجة خلية غضروفية وخلية عظمية الأنساب، التي يمكن أن تسهم المواد خلية للبحوث محددة في RA وغيرها من الأمراض المرتبطة العظام ^11.

في هذه الدراسة، ونحن لشرح كيفية عزل وتوسيع FLSs من الغشاء الزليلي ازالتها جراحيا، وكيفية توليد RA-iPSCs من FLSs باستخدام lentiviruses التي تحتوي على عوامل ياماناكا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بيان الأخلاق: وافق هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC12TISI0861).

1. عزل خلية زليلية والتوسع

1. خلية زليلية عزل
   1. تعقيم اثنين من أزواج من مقص جراحي وزوج واحد من الملقط.
   2. نقل الأنسجة الزليلي إلى صحن 100 ملم ويغسل مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
   3. قطع الأنسجة الدهنية والعظام بقايا مصفر. نقل الأنسجة قلص إلى بئر من لوحة 6 جيدا وإضافة 5 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS).
   4. ختم الأنسجة مع مقص حتى قطع صغيرة بما يكفي لاختراق ماصة للتصرف.
   5. نقل وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنسجة لأنبوب مخروطي 50 مل. حصاد المواد المتبقية عن طريق إضافة 5 مل من DMEM مع 20٪ FBS لوحة 6 جيدا، ثم نقل إلى الأنبوب.
   6. كولاجيناز ذوبان الجليد على الجليد. إضافة كولاجيناز إلى تركيز النهائي من 0.01٪ وختم الأنبوب مع بارافيلم. احتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع الهز لمدة 4 ساعة.
   7. بعد مرور فترة الحضانة، وملء الأنبوب مع DMEM مع 20٪ FBS، حتى الحجم الكلي هو 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج، RT لمدة 10 دقيقة.
   8. إزالة طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 40 مل من وسائل الاعلام لresuspend الكرية.
   9. كرر الخطوات من 1.1.10-1.1.11.
   10. Resuspend وبيليه في 25 مل من DMEM مع 20٪ FBS وانتظر كتل كبيرة من الأنسجة لتنزل الى القاع.
   11. نقل طاف على طبق 100 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 14 يوم.
2. صيانة خلية زليلية والتوسع
   1. تجاهل وسائل الإعلام المستخدمة من لوحة وغسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
   2. إضافة 1 مل PBS / 1 ملم EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ لمدة 2 دقيقة.
   3. اضغط على طبق بلطف وحوالةص الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج، RT لمدة 2 دقيقة.
   4. إزالة طاف دون الإخلال بيليه و resuspend بيليه في 30 مل من DMEM مع FBS 20٪.
   5. نقل الخلايا إلى 3 × 100 مم أطباق، دون ترك أي بقايا المواد المرئية.
   6. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الجديدة كل 3 د. انقسام الخلايا في 80٪ confluency باستخدام 1 مل PBS / 1 ملم EDTA. المحافظة حتى مرور 3 قبل الاستخدام. تقسيم كل طبق من الخلايا في 3 أطباق في كل انقسام.
      ملاحظة: بعد وصول مرور 3، الخلايا التي لن يتم استخدامها على الفور يمكن تجميد.

2. إعادة برمجة FLSs عن طريق ترميز Lentiviruses العوامل ياماناكا

1. تنبيغ (D0)
   1. البذور 3 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا في وسائط النمو (500 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
   2. في اليوم التالي، وإزالة قارورة واحدة من الفيروسة البطيئة التي تحتوي على 4 ياماناكا عوامل هي: Oct4، Klf4، Sox2 وج. Myc على من الفريزر وذوبان الجليد في 4 درجات مئوية. ملاحظة: تم إنتاج الفيروسة البطيئة من قبل الإجراء الموضح في دراسة سابقة لدينا ^11.
   3. في حين ذوبان الفيروس، وتغيير وسائل الاعلام وسائل الاعلام النمو FLS (20٪ FBS بالإضافة إلى المضادات الحيوية في DMEM) تحتوي على 10 ميكروغرام / مل بروميد hexadimethrine و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
   4. بعد تغيير وسائل الإعلام، إضافة 30 ميكرولتر من الفيروسة البطيئة للخلايا وتخلط بلطف. لتحسين العدوى، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 680 x ج، 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   5. بعد الطرد المركزي، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2.
2. الصيانة حتى إعادة برمجة مرئيا
   1. لمدة 3 أيام، واستبدال وسائل الإعلام يوميا مع وسائل الإعلام نمو FLS تحتوي على 0.1 ملي الزبدات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
   2. في اليوم التالي، واستبدال وسائل الإعلام مع خليط من وسائط النمو FLS ووسائل الاعلام التوجيهية (نسبة 1: 1) تحتوي على 0.1 ملي الزبدات الصوديوم و 50 ميكروغرام / مل حامض الاسكوربيك.
      ملاحظة: يتم إعطاء مكونات وسائل الإعلام التوجيهية في قائمة المواد / المعدات.
3. خلايا تقسيم لمستعمرة تشكيل
   1. إعداد لوحة 6 جيدا المغلفة vitronectin.
      1. إضافة 60 ميكرولتر vitronectin إلى 6 مل PBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2+ 2+.} ضع 2 مل من الخليط في كل الآبار واحتضان في RT لا يقل عن 1 ساعة. ملاحظة: إن تركيز عمل vitronectin هو 5 ميكروغرام / مل.
   2. على D5، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
   3. إضافة 1 مل PBS / 1 ملم EDTA لفصل الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 2 دقيقة.
   4. حصاد الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج، RT لمدة 2 دقيقة.
   5. انقسام الخلايا في 3 نسب مختلفة (1: 3، 1: 6 و 1: 9) لتحقيق confluencies مختلفة. إضافة 900 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى الخلية بيليه و resuspend. إضافة 300، 150، و 100 ميكرولتر من الخليط خلية لكل بئر من 6-كذلك لوحة لتحقيق نسبة 1: 3، 1: 6 و 1: 9 على التوالي.
   6. استبدال وسائل الإعلام يوميا مع وسائل الاعلام التوجيهية حتى تظهر المستعمرات. سوف تظهر المستعمرات بعد حوالي D18. ملاحظة: في هذه المرحلة، المستعمرات IPSC تتعايش مع FLSs غير برمجتها.
4. مستعمرة قطف
   1. إعداد لوحة 48-جيدا المغلفة vitronectin بإضافة 500 ميكرولتر vitronectin إلى الآبار، واحتضان على RT لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
   2. وضع المجهر على مقاعد البدلاء النظيفة، وإزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة.
   3. إزالة حل vitronectin من لوحة 48-جيدا وإضافة 500 وسائل الاعلام التوجيهية ميكرولتر تستكمل مع المرتبطة رو-10MM، ملفوف لفائف تحتوي على البروتين كيناز (ROCK) المانع.
   4. باستخدام طرف 10P ماصة، وقطع جميع أنحاء المستعمرة. نقل مستعمرة التقطت لجانب واحد من لوحة 48-جيدا.
   5. بعد اختيار عدة مستعمرات، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2.
   6. الحفاظ على الخلايا حتى المستعمرات هي إينو الكبيرلاف للنقل. ملاحظة: نحن عادة المسكوب الخلايا عندما يحصل على مستعمرة من الحقل المرئي من المجهر، عندما ينظر إليها في التكبير 100X.

3. المناعي تلطيخ

1. إعداد الخلية
   1. وضع معقم 18 مم غطاء زجاجي في لوحة 12-جيدا.
   2. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني لتبرد وشطف الزجاج غطاء.
   3. استبدال مع 1 مل من / مل vitronectin حل 10 ميكروغرام.
   4. احتضان لوحة في RT لا يقل عن 1 ساعة.
   5. تجاهل الحل vitronectin وiPSCs لوحة في لوحة 12-جيدا المغلفة vitronectin والثقافة لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO _2، وتغيير وسائل الإعلام يوميا.
2. تلطيخ الخلايا
   1. تجاهل وسائل الإعلام والثقافة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
   2. إصلاح الخلايا في 0.4٪ امتصاص العرق (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT.
   3. Permeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون X-100 لمدة 5 دقائق على RT.
   4. إزالة permeabilizationحل وكتلة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 30 دقيقة في RT.
   5. تمييع الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ BSA وفقا للجدول 1. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 2 ساعة على RT.
   6. إضافة الضد الثانوية (المخفف 1: 200)، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة على RT، وتجنب ضوء.
   7. علاج الخلايا مع 1 ميكرولتر / مل دابي لمدة 10 دقيقة.
   8. وضع غطاء زجاجي على أعلى من الزجاج الشرائح مع antifade كاشف واحتضانها في RT لمدة 24 ساعة، وتجنب ضوء.
   9. تحقق من التعبير مع المجهر مضان.

4. في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (RT-PCR)

1. استخراج مرنا من بيليه الخلية باستخدام guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم طريقة استخراج ^11.
2. تضخيم [كدنا من 2 ميكروغرام من إجمالي مرنا باستخدام النسخ العكسي ^11.
3. خلط المكونات المطلوبة لPCR باستخدام 2 ميكرولتر من [كدنا تيملوحة ^(11).
4. أداء RT-PCR والتحقق من النتائج وفقا لهلام الكهربائي ^11.

5. الفوسفاتاز القلوية (ا ف ب) تلطيخ

1. iPSCs الثقافة لمدة 5-7 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ قبل تلطيخ.
2. نضح في وسائل الإعلام وإصلاح الخلايا مع PFA 4٪ لمدة 1 دقيقة.
3. تجاهل تثبيتي، وشطف الخلايا مع عازلة شطف 1X.
4. إعداد الكواشف لAP تلطيخ. مزيج من المواد الكيميائية في نسبة التالية: سريع الأحمر البنفسج: نفثول AS-BI حل الفوسفات: الماء = 2: 1: 1.
5. احتضان الخلايا مع حل تلطيخ على RT لمدة 15 دقيقة، وتجنب ضوء.
6. تجاهل الحل تلطيخ وشطف الخلايا مع العازلة الشطف.
7. تغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمنع جفاف والتحقق من التعبير باستخدام المجهر مشرق الميدان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول لتوليد iPSCs من FLSs باستخدام نظام lentiviral. ويبين الشكل 1A مخطط بسيط للبروتوكول العزلة FLS. وبعد الاستئصال الجراحي للالزليلي، والمفروم النسيج الى قطع صغيرة باستخدام مقص جراحي. وأضاف كولاجيناز لعزل الخلايا من كتل من ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

قبل اكتشاف iPSCs والعلماء تستخدم أساسا المجالس الاقتصادية والاجتماعية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية والأنساب الخلية الأخرى من خلال التمايز. ومع ذلك، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكتلة الداخلية من الكيسة، وهو الجنين في مرحلة مبكرة. لعزل المجالس الاقتصا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004